補腎填髓方對阿爾茨海默病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶 能力及線粒體氧化應(yīng)激的影響

曹玉成　王哲　宋煒熙

〔摘要〕 目的 觀察補腎填髓方對阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease， AD）模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及線粒體氧化應(yīng)激的影響。方法 50只大鼠先用Y迷宮初篩，再按曠場實驗得分隨機分成正常組、模型組、假手術(shù)組、中藥組、西藥組。假手術(shù)組兩側(cè)側(cè)腦室注射β淀粉樣蛋白（Aβ）42～1，余下除正常組外均以雙側(cè)側(cè)腦室注射（Aβ）1-42復(fù)制AD模型。造模后中藥組灌服補腎填髓方，西藥組灌服多奈哌齊，其他組灌服等容量生理鹽水，連續(xù)干預(yù)28 d。Morris水迷宮檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）檢測大鼠腦皮質(zhì)及血清超氧化物歧化酶（superoxide dismufase， SOD）活性，硫代巴比妥酸法（TBA）檢測大鼠腦皮質(zhì)及血清丙二醛（malondialdehyde， MDA）活性，透射電鏡觀測海馬線粒體超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果 與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠水迷宮逃避潛伏期縮短，在原平臺象限游泳時間及距離的百分比增加，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，中藥組SOD活性升高，MAD活性減低（P<0.05，P<0.01）;西藥組的SOD活性升高，MDA活性降低（P<0.01）;中藥組及西藥組的海馬線粒體超微結(jié)構(gòu)病理損害改善。結(jié)論 補腎填髓方可以改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機制可能與改善線粒體氧化應(yīng)激有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 阿爾茨海默病;補腎填髓方;氧化應(yīng)激;線粒體

〔中圖分類號〕R285.5;R745.1? ? ? ?〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.04.006

Effects of Bushen Tiansui Fang on Learning and Memory Abilities and Oxidative Stress of Mitochondria of Alzheimer's Disease Model Rat

CAO Yucheng1， WANG Zhe2， SONG Weixi3*

（1. Qiyang Hospital of Traditional Chinese Medicine， Yongzhou， Hunan 426100， China; 2. The Second Xiangya Hospital of Central South University， Changsha， Hunan 410013， China; 3. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Bushen Tiansui Fang on learning and memory abilities and oxidative stress of mitochondria of Alzheimer's disease （AD） model rats. Methods A total of 50 rats were initially screened by Y maze， and then divided into the normal group， the model group， the sham operation group， the Chinese medicine group， the Western medicine group randomly according to the score of open filed test. Aβ1-42 （amyloid β-protein） were injected into bilateral ventricle of rats to duplicate AD model， and Aβ42-1 were injected into the sham operation group rats as the same dose. After modeling， the Chinese medicine group and the Western medicine group were administered by gavage once a day for 4 weeks with Bushen Tiansui Fang and Donepezil respectively. At the same time， the remaining groups were given by gavage with the same capacity amount of normal saline， for continuous 28 days' intervention. The abilities of learning and memory were assessed with Morris water maze. The activity of superoxide dismutase （SOD） in prefrontal cortex and serum of rats was detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. The activity of malondialdehyde （MDA） in prefrontal cortex and serum of rats was detected by thiobarbituric acid （TBA） method. The ultrastructures of hippocampal mitochondria were observed with transmission electron microscopy. Results Compared with the model group， the escape latent period shortened in the Chinese medicine group and the Western medicine group， while the percentage of swimming time and swimming distance in the original platform quadrant increased （P<0.01）. Compared with the model group， the SOD activity increased and MAD activity decreased in Chinese medicine group （P<0.05; P<0.01）; the SOD activity increased and MDA activity decreased in the Western medicine group （P<0.01）; the mitochondrial ultrastructure pathological changes in the Chinese medicine group and the Western medicine group were ameliorated. Conclusion The learning and memory abilities of AD rats can be improved by Bushen Tiansui Fang， and its mechanism may be related to the improvement of mitochondrial oxidative stress.

〔Keywords〕 Alzheimer's disease; Bushen Tiansui Fang; oxidative stress; mitochondria

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease， AD）是與年齡相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以進行性記憶下降及認(rèn)知損傷為特點[1]。由于人口老齡化，目前世界范圍內(nèi)AD患病人數(shù)已經(jīng)達到4 400萬[2]，給社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。AD的病因和發(fā)病機制復(fù)雜且并不完全清楚，現(xiàn)在的治療藥物不能完全滿足臨床需要，并且費用昂貴，還存在肝毒性、腹瀉、惡心嘔吐、頭暈等不良反應(yīng)[3]。因此，研究療效更確切、副作用更少的AD治療藥物非常緊迫。近年來，大量文獻研究報道，AD與氧化應(yīng)激聯(lián)系緊密，改善氧化應(yīng)激可以明顯改善AD[4-6]。補腎填髓方是根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論“腎虛髓虧”，基于經(jīng)典方劑孔圣枕中丹（《千金方》）化裁而成，相關(guān)研究證實補腎填髓方藥能有效延緩癡呆早期患者大腦結(jié)構(gòu)的萎縮，改善其認(rèn)知及記憶功能[7]，但其作用機制并不十分明確。本研究擬以AD模型大鼠為實驗對象，從線粒體的氧化應(yīng)激角度，探討補腎填髓方抗AD的作用機制。

1 材料與儀器

1.1? 實驗動物

90只健康雄性清潔級SD大鼠，體質(zhì)量（180±20）g，購自斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SYXK（湘）2010-0013;實驗動物來源證號：430047000，飼養(yǎng)于湖南省人民醫(yī)院動物實驗室。所有動物飼養(yǎng)在室溫22～25 ℃、濕度40%～60%條件下，以普通飼料喂養(yǎng)，自由進食飲水。將大鼠觀察性飼養(yǎng)1周后進行Y迷宮實驗初篩。

1.2? 實驗藥物、試劑及儀器設(shè)備

補腎填髓方由石菖蒲10 g，遠(yuǎn)志10 g，何首烏15 g，淫羊藿15 g，龜板20 g，龍骨20 g組成。鹽酸多奈哌齊片，衛(wèi)材藥業(yè)有限公司，批號：1611013。Aβ1-42，Sigma公司，批號：A4559。Aβ42-1，Sigma公司，批號：A2201（以無菌雙蒸水將Aβ1-42及Aβ42-1配制成濃度為2 μg/μL， 置于37 ℃恒溫箱孵育7 d，保存于4 °C冰箱備用）。丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒，南京建成，批號：A003-1。超氧化物歧化酶（superoxide dismufase， SOD）試劑盒，武漢華美，批號：P03037347。大鼠腦立體定位儀，美國KOPF（Model-900）。Morris水迷宮，上海欣軟（XR-XM101）。Y迷宮，上海軟?。˙W-MYM103）。透射式電子顯微鏡，美國FEI公司（Tecnai G2 Spirit）。

2 方法

2.1? AD大鼠模型的復(fù)制及干預(yù)

根據(jù)參考文獻[8]行Y型迷宮初篩，剔除先天愚鈍的大鼠，隨后依據(jù)曠場實驗水平運動得分將大鼠分為正常組、假手術(shù)組、模型組、西藥組、中藥組，每組10只。參照Xi等[9]方法，復(fù)制AD模型。除正常組外，各組大鼠以10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉后俯臥固定于腦立體定位儀，常規(guī)備皮消毒，頭頂正中切開皮膚，找到大鼠前囟，結(jié)合《大鼠腦立體定向儀圖譜》[10]及預(yù)實驗結(jié)果，在大鼠兩側(cè)側(cè)腦室（位置：前囟后1 mm，矢狀縫向左、右側(cè)旁開1.5 mm，深4.6 mm）用針頭鉆開顱骨，假手術(shù)組兩側(cè)側(cè)腦室注入Aβ42-1 5 ？滋L，其余實驗組緩慢注入Aβ1～42 5 ？滋L。注入時間均為5 min，留針時間5 min，注射完畢后縫合皮膚，局部紅霉素外涂防感染。

正常組不灌胃，其他組造模后隔天開始灌胃。根據(jù)人與大鼠換算系數(shù)0.018，以大鼠體質(zhì)量200 g，成人體質(zhì)量60 kg為參考，西藥組按0.33 mg/（kg·d）、中藥組按生藥量8.1 g/（kg·d）的劑量灌胃，給予藥液8 mL/（kg·d）。模型組和假手術(shù)組灌服等容量生理鹽水，連續(xù)給藥4周。

造模成功標(biāo)準(zhǔn)[8]：造模結(jié)束后第15天，對大鼠再次進行Y型迷宮篩選，如15次測試中正確次數(shù)比造模前下降1/3者為造模成功。共剔除死亡大鼠5只，造模失敗3只，將存活的成功模型納入下一步實驗，其中假手術(shù)組8只，模型組7只，中藥組9只，西藥組8只，正常組10只，成模率80%，并遵循隨機原則補齊每組動物為10只。

2.2? Morris水迷宮測試大鼠學(xué)習(xí)記憶能力

在各組大鼠28 d干預(yù)完成后，每天下午14：30左右開始定位航行訓(xùn)練，連續(xù)5 d。每天將大鼠面向池壁分別從4個平均分布的標(biāo)記點輕輕放入水中，記錄1 min內(nèi)其找到水下平臺所花費的時間（逃避潛伏期，escape latency）。第6天移除隱藏的平臺，從定位航行實驗的第1個入水點將大鼠放入水池，記錄1 min內(nèi)大鼠經(jīng)過虛擬平臺的總次數(shù)，原平臺象限的活動時間與距離占總游泳時間及總游程的百分比[11]。

2.3? ELISA、TBA法分別測定前額皮質(zhì)組織勻漿及血清中SOD、MDA活性

水迷宮測試結(jié)束后，大鼠用10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，腹主動脈采血后，斷頭取腦，碎冰上迅速分離出大鼠前額皮質(zhì)，預(yù)冷的生理鹽水洗凈血漬，吸干水分后稱質(zhì)量，制備成10%組織勻漿液，分別低溫離心機3 500 r/min離心勻漿液及血液15 min，取上清，按照SOD、MDA試劑盒說明書操作測定。

2.4? 電鏡觀察

大鼠麻醉處死后斷頭取腦，碎冰上分離大鼠海馬，用2.5%戊二醛固定2 h以上，0.1 mmol/L磷酸緩沖液清洗3次;1%鋨酸固定1～2 h，0.1 mmol/L磷酸緩沖液漂洗3次;常規(guī)50%、70%、90%、100%丙酮脫水，經(jīng)過浸泡、包埋、固化后超薄切片機切片，檸檬酸鉛和醋酸鈾雙染，透射電鏡下放大20 000倍觀察并拍照記錄。

2.5? 統(tǒng)計方法

用SPSS l7.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)均用“x±s”表示，水迷宮逃避潛伏期采用重復(fù)測量方差分析[12]，其余各組間比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較使用LSD檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 水迷宮定位航行試驗

隨著訓(xùn)練時間的延長，各組大鼠逃避潛伏期逐漸縮短。與假手術(shù)組比較，模型組第3天開始出現(xiàn)逃避潛伏期延長（P<0.01）;與模型組比較，中藥組、西藥組逃避潛伏期第3天開始縮短（P<0.01）。與西藥組相比，中藥組逃避潛伏期稍有延長，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖1、表1。

3.2? 水迷宮空間探索試驗

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠原平臺象限游泳時間百分比及游泳距離百分降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與模型組相比，中藥組、西藥組游泳時間及游泳距離的百分比升高（P<0.05或P<0.01）;與西藥組相比，中藥組原平臺象限游泳時間所占百分比稍有降低，但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），中藥組原平臺象限游泳距離所占百分比降低，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表2、圖2。

3.3? 補腎填髓方對大鼠前額皮質(zhì)組織及血清SOD、MDA酶活性的影響

與假手術(shù)組比較，模型組SOD活性明顯下降，MDA活性顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，中藥組、西藥組SOD活性均升高，MDA活性均顯著下降（P<0.05或P<0.01）;西藥組與中藥組SOD活性、MDA活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

3.4? 補腎填髓方對大鼠海馬線粒體的影響

電鏡結(jié)果顯示，正常組和假手術(shù)組線粒體形態(tài)清楚完整，大小、形狀規(guī)則，分布均勻且數(shù)目多，外膜平整光滑，線粒體膜間隙無明顯擴張，線粒體嵴排列整齊呈板層狀，內(nèi)膜和嵴內(nèi)腔含有較多均勻的顆粒狀基質(zhì)，未見線粒體水腫及空泡化改變。

模型組部分線粒體形態(tài)欠完整，結(jié)構(gòu)不清晰，體積縮小，大小、形狀不規(guī)則，分布紊亂且數(shù)目減少，線粒體外膜模糊，內(nèi)嵴大量斷裂或溶解消失，線粒體腫脹，基質(zhì)疏松清淡，未見基質(zhì)顆粒，出現(xiàn)空泡化改變。

中藥組、西藥組大鼠線粒體組織結(jié)構(gòu)上較為完整清晰，大小、形狀相對規(guī)則，數(shù)目較模型組增多，外膜可見，尚光滑，內(nèi)嵴增多，排列比較整齊，偶可見嵴內(nèi)腔稍有擴大，內(nèi)嵴溶解減輕，部分線粒體腫脹明顯改善，基質(zhì)較均勻，可見少許基質(zhì)顆粒。見圖3。

4 討論

AD是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，β淀粉樣蛋白沉積成老年斑是AD病理標(biāo)志，并且被認(rèn)為直接損害學(xué)習(xí)能力和記憶[13]，其中Aβ1-42能夠自我組裝形成寡聚體和淀粉樣纖維而具有很強的細(xì)胞毒性;Aβ42-1作為它的反序列肽，缺乏了自我組裝及構(gòu)成毒性寡聚態(tài)的能力，不具有細(xì)胞毒性，故而在許多研究中作為Aβ1-42的對照肽[14]。條件恐懼、放射狀迷宮、Morris水迷宮實驗、Y迷宮實驗等均是AD行為學(xué)評價的常用方法[15-16]。AD患者后期多伴有如幻想、焦慮、抑郁等精神癥狀，曠場實驗是評價實驗動物在新異環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度的一種方法，常用于評價實驗動物在新異環(huán)境中的焦慮狀態(tài)。初期就選擇Y迷宮進行初篩，并配合曠場實驗評分，既可避免Morris水迷宮初篩大鼠會遺留對平臺記憶干擾后期Morris水迷宮測試結(jié)果，又可排除大鼠情緒原因引起自主活動差異而影響最終的測試結(jié)果。造模后大鼠Morris水迷宮實驗測定結(jié)果顯示，模型組逃避潛伏期延長，在原平臺象限的游泳時間和游泳距離百分比縮短，假手術(shù)組未見明顯變化，表明模型大鼠學(xué)習(xí)記憶受損。

AD發(fā)病機制復(fù)雜，多種因素參與了它的發(fā)病過程，其中氧化應(yīng)激可能在其中占有重要的地位，大量實驗研究及回顧性研究均提出AD發(fā)生發(fā)展與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[17-19]。盡管生理濃度的活性氧在體內(nèi)的一些信號通路中起著重要作用，但活性氧的過度產(chǎn)生會引起脂質(zhì)、蛋白、核酸等分子損傷。MDA是一種重要的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，表明了機體受氧化損傷的程度?；钚匝醯南饕ㄟ^酶促及非酶促兩種途徑，SOD是體內(nèi)重要抗氧化酶，可通過催化還原態(tài)單電子氧轉(zhuǎn)化為過氧化氫從而清除體內(nèi)氧自由基，減輕氧化損傷的程度，維持生物體細(xì)胞成分正常的結(jié)構(gòu)和功能[20]。通過抗氧化手段進行干預(yù)，或可延緩疾病向AD終末的進展。本實驗結(jié)果顯示，模型組血清及皮質(zhì)抗氧化酶SOD活性均有下降，MDA活性均表現(xiàn)升高趨勢;中藥組可以升高皮質(zhì)及血清中的SOD活性，降低MDA活性。表明補腎填髓方可以增強機體的抗氧化能力，拮抗過度產(chǎn)生的氧自由基，這與姜招峰等[21]的研究有共通之處，其研究表明海馬及皮層部位的氧自由基損傷與大鼠記憶及學(xué)習(xí)能力密切相關(guān)。

由于線粒體電子傳遞中不可避免的出現(xiàn)電子泄露，成為了機體活性氧主要產(chǎn)生來源，90%內(nèi)源性氧自由基均由線粒體而來，線粒體自身亦可受到氧自由基的破壞，加劇線粒體的損傷，從而形成惡性循環(huán)[22]。本研究通過電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示模型組線粒體形態(tài)不完整，結(jié)構(gòu)破壞，體積變小，分布紊亂且數(shù)目減少，出現(xiàn)空泡化改變，表明AD模型鼠線粒體整體結(jié)構(gòu)受損;大鼠灌服中藥補腎填髓方能使線粒體組織結(jié)構(gòu)部分恢復(fù)，大小、形狀變得規(guī)則，數(shù)目增多。表明補腎填髓方對受損的AD大鼠線粒體結(jié)構(gòu)的破壞有改善作用。

AD屬于中醫(yī)學(xué)“癡呆”“呆證”的范疇，病性以本虛標(biāo)實為主，以髓?？仗摓楸?，痰濁、瘀血阻絡(luò)為標(biāo)，而腎虛髓空是其根本原因。腎與腦之間有著密不可分的聯(lián)系，“癡呆”的中醫(yī)藥治療多集中在補腎填髓。老年癡呆臨床辨證分型流行病調(diào)查也發(fā)現(xiàn)，髓海不足證在所有證型中出現(xiàn)頻次最高[23]。補腎填髓方基于經(jīng)典方劑“孔圣枕中丹”（《千金方》）化裁而成，以淫羊藿、何首烏為君藥，功效在于滋陰補腎、強精益血;臣藥龜板、龍骨強精益髓，增慧添智;佐以遠(yuǎn)志、石菖蒲開竅豁痰，醒神益智?？v觀全方藥物組成，主要功效在于補腎填髓，且兼顧了化痰開竅?，F(xiàn)代藥理研究表明：淫羊藿中的成分淫羊藿苷可以通過抗氧化應(yīng)激、抗炎、清除自由基、抑制乙酰膽堿酯酶的活性以及抑制Aβ聚集等途徑發(fā)揮對AD的改善作用[24]。何首烏主要水溶性成分二苯乙烯苷可改善擬癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，提高大鼠海馬組織CA1區(qū)腦啡肽酶及低密度脂蛋白相關(guān)受體1表達，增強對Aβ的降解和轉(zhuǎn)運[25]。遠(yuǎn)志粗提物經(jīng)D101大孔吸附樹脂富集后，發(fā)現(xiàn)皂苷類成分和黃酮類成分或許能通過抗氧化應(yīng)激，改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能[26]。石菖蒲的主要有效成分β-細(xì)辛醚可以改善認(rèn)知功能，其作用機制包括了抑制炎癥因子IL-1β、TNF-α的分泌及下調(diào)AQP4的表達來保護星形膠質(zhì)細(xì)胞[27]。

本實驗顯示補腎填髓方可以改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，增強抗氧化應(yīng)激能力，且能夠改善線粒體的結(jié)構(gòu)，其機制可能與改善線粒體相關(guān)的氧化應(yīng)激有關(guān)，更深入的機制研究還需下一步進行。

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