一種應(yīng)用SELEX方法篩選糖化血紅蛋白適配子的方法介紹

徐菁 孫平

摘 ?要：糖尿病是危害人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題，而我國糖尿病患者正在呈上升趨勢，近年已達近9200多萬。傳統(tǒng)的血糖檢測只能檢測患者及時血糖，對確診糖尿病臨床指標不高，而糖化血紅蛋白作為血糖監(jiān)測的金指標，能夠有效提示病人血糖動態(tài)水平。目前市場上幾個主要糖化血紅蛋白檢測的方法包括：液相色譜法、比濁法、金標法、親和層析法等，存或設(shè)備昂貴、檢測過程復(fù)雜或檢測靈敏度低等問題。應(yīng)用SELEX技術(shù)篩選糖化血紅蛋白適配子，并通過熒光親合體標記技術(shù)，使用普通熒光檢測儀器即可讀取，既提高了血紅蛋白適配子的親和力，又減少了設(shè)備門檻。對提高糖尿病的檢測率有重大意義。

糖尿病是危害人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題，糖尿病是一種終生性疾病，其并發(fā)癥是至殘至死的主要原因，所以人們希望能盡早發(fā)現(xiàn)和治療糖尿病。2007年～2008年，中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會在我國選擇經(jīng)濟發(fā)展水平不同的14個省市，對糖尿病進行了流行病學(xué)調(diào)查。該調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國糖尿病患病率的增長速度令人震驚。2002年，在全國營養(yǎng)狀況調(diào)查過程中進行的糖尿病流行病學(xué)調(diào)查表明，我國城市糖尿病患病率為4.5%，農(nóng)村為1.8%，推算全國有病人2000多萬。而時隔6年，我國20歲以上人群的糖尿病患病率已達9.7%，推算病人約為9200萬人;糖尿病前期患病率達15.5%，推算處于糖尿病前期者約1.48億人，這意味著我國糖尿病“后備軍”人群龐大。目前糖尿病的快速檢測以血糖檢測數(shù)據(jù)為主，但是該項檢查主要是體現(xiàn)被檢者臨時血糖數(shù)據(jù)，如需確診還要重復(fù)兩至三次檢查或者進行糖耐量測試，這對大部分糖尿病前期患者很難通過及時體檢發(fā)現(xiàn)糖尿病前兆，從而能夠在患病前采取干預(yù)治療，提高患者健康指數(shù)。

1 糖化血紅蛋白檢測的意義

傳統(tǒng)的糖尿病診斷和治療監(jiān)測采用空腹血糖、餐后血糖和口服葡萄糖耐量試驗等，但是血糖參數(shù)僅代表抽血時的瞬間血糖水平，而糖化血紅蛋白（GHb）作為反映長期血糖水平的金標準，也是監(jiān)測糖尿病治療的重要指標。GHb是紅細胞中血紅蛋白與葡萄糖緩慢、持續(xù)且不可逆地進行非酶促蛋白糖化反應(yīng)的產(chǎn)物，形成兩周后不易分開。當血液中葡萄糖濃度較高時，人體所形成的GHb含量也會相對較高[2]。正常生理條件下，非酶促糖化反應(yīng)產(chǎn)物的生成量與反應(yīng)物的濃度成正比。由于蛋白質(zhì)濃度保持相對穩(wěn)定，糖化水平主要決定于葡萄糖濃度，也與蛋白質(zhì)與葡萄糖接觸的時間長短有關(guān)。GHb可以反映最近2—3個月的平均血糖水平。2002年美國糖尿病協(xié)會已明確規(guī)定應(yīng)定期檢測GHb，并將其作為監(jiān)測糖尿病血糖控制的金標。普及糖尿病知識，更新治療理念，監(jiān)測并保持GHb達標，更早、更合理地使用胰島素等藥物治療，對于控制糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展尤為重要。

2 糖化血紅蛋白檢測常規(guī)方法與優(yōu)缺點

目前臨床上常用的糖化血紅蛋白的檢測方法有以下幾種：

2.1高壓液相方法（HPLC）

全自動分離測定GHb及血蛋白的變異體和亞型，但儀器的操作保養(yǎng)要求較高，CV值1%以內(nèi)，以北京執(zhí)信醫(yī)療公司的HLC-723 G7為代表。但由于此方法所使用的儀器昂貴，難以在比較基層的醫(yī)院和實驗室普及;微柱法手工操作步驟繁瑣，層析時間和微柱的質(zhì)量不易控制，易產(chǎn)生操作技術(shù)誤差，重復(fù)性欠佳;而且干擾因素很多，尤其對pH值和溫度的變化敏感，HbF及變異血紅蛋白（HbS、HbC、HbE等）對結(jié)果干擾，干擾程度根據(jù)柱的分離能力而定，所以一定要仔細觀察圖譜。市場主流：高端HPLC方法學(xué)是日本TOSOH的G7，美國伯樂的DS5，價格在20萬上下，中檔為西門子拜耳的DCA Vantage，價格約在10萬以下，低端和普及型的是挪威小旋風價格3.6萬。

2.2 免疫方法

（1）比濁法：利用抗原、抗體反應(yīng)的原理進行測定。GHb的B鏈N末端提供了一個容易被抗體識別的抗原表位，用單克隆抗體特異識別GHb的B鏈N末端最后4～6個氨基酸組成的抗原表位，結(jié)合比濁法。

（2）離子捕獲法：應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)原理，并聯(lián)以熒光標志物，通過連接帶負電的多陰離子復(fù)合物，吸附到帶正電的的纖維表面，經(jīng)過一系列徹底清洗等步驟后，測定熒光強度變化率，計算GHb濃度。杭州麗珠醫(yī)療器械有限公司代理韓國艾可美 糖化血紅蛋白檢測試劑盒。

（3）膠乳凝集法：利用抗原抗體反應(yīng)直接測定總lib中HbAlc的百分含量的方法。樣品中總Hb和GHb與膠乳有相同的非特異性吸附而固相化，當加入HbAlc的特異性單克隆抗體后形成膠乳一GHb.鼠抗人GHb單克隆抗體的復(fù)合物，此復(fù)合物由于羊抗鼠抗體而形成凝集，凝集量因膠乳表面固相化的GHb量的不同而不同。通過測定其吸光度并與GHb百分濃度的標準曲線比較后即可求出樣品中GHb所占Hb的百分含量。免疫法測定糖化血紅蛋白其準確性和重復(fù)性均有欠缺，測定受高濃度葡萄糖、高三酰甘油、高膽紅素等物質(zhì)的干擾，由于樣本的濁度會使光度計測定產(chǎn)生錯誤。另外，抗體由動物免疫獲得，成本高且篩選周期長，批與批之間存在差異;抗體對溫度濕度敏感，易變性難保存等缺點。該類試劑以北京萊幫生物技術(shù)有限公司（德國萊幫）北京九強生物技術(shù)有限公司（英國朗道公司）

2.3親和層析法：

該試劑盒包含多孔性濾膜裝置，含試劑的試管和洗滌溶液。試劑能溶解紅細胞并特異性沉淀血紅蛋白因子，其中藍色的硼酸綴合物能和糖化血紅蛋白上的Cis-diols相結(jié)合。血液加入試劑中，紅細胞立即溶解，使全部的血紅蛋白都沉淀，硼酸綴合物就和GHb中的cis-diol結(jié)構(gòu)相結(jié)合。血液和試劑混合后加入濾膜裝置，所有沉淀的血紅蛋白，不管是和綴合物結(jié)合的或未結(jié)合的都保留在濾膜的頂部。過量的顯色綴合物就被洗滌液洗掉。通過金標定量儀測定藍色（糖化血紅蛋白）和紅色（總血紅蛋白）的強度，可以計算樣品中的GHb的百分比。主要生產(chǎn)廠家包括美國Bio-Rad、Primus、日本TOSOH、英國DREWSCIENTIFIC、德國SIEMENS公司，挪威小旋風Nycocard Reader II等等。

3.應(yīng)用SELEX技術(shù)篩選糖化血紅蛋白適配子

核酸適體探針開發(fā)的第一步是通過SELEX方法篩選到與靶分子特異并緊密結(jié)合的核酸適體。通過篩選的糖化血紅蛋白核酸適體探針用于直接檢測混合生物樣品中的靶分子，核酸適體的特異性將是檢測系統(tǒng)的關(guān)鍵。SELEX篩選過程采用引入負篩選步驟，即先將隨機寡核苷酸文庫與靶分子相似的分子或不含靶分子的樣品混合，除去非特異結(jié)合的核酸適體。然后再把處理過的隨機寡核苷酸文庫與靶分子混合進行SELEX篩選，從而保證與靶分子結(jié)合的核酸適體的特異性。通過引入帶有額外化學(xué)修飾基團的核苷酸，如benzylaminocarbonyl-dUTP（BndUTP）等，增加核酸適體與靶分子相互作用的位點，使核酸適體與靶分子的親和力達到nM 甚至 pM 水平。不與靶分子結(jié)合時，核酸適體處于比較松散的結(jié)構(gòu)，5' 和3' 兩端相互游離。與靶分子結(jié)合時，靶分子誘導(dǎo)核酸適體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，核酸適體的5' 端和3' 端都將參與與靶分子特定區(qū)域（類似于與康體結(jié)合的抗原位點）的相互作用，導(dǎo)致5' 和3' 兩端相互靠近（見圖1）。

這一特點使核酸適體成為分子信標探針設(shè)計和開發(fā)的熱點。選用激發(fā)態(tài)二聚體核酸適體分子信標技術(shù)，是因為芘激發(fā)態(tài)二聚體不僅熒光強度高，而且熒光壽命比生物樣品中的非特異激發(fā)熒光的壽命長，檢測時可以在非特異激發(fā)熒光消失后，再來收集激發(fā)態(tài)二聚體的熒光信號，大大提高檢測的特異性和靈敏度（見圖2）。

4 結(jié)論

該文從糖化血紅蛋白的常見檢測方法及優(yōu)缺點對比進行分析與總結(jié)，并通過相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，提出了應(yīng)用SELEX技術(shù)篩選糖化血紅蛋白適配子來檢測糖化血紅蛋白的論點。本文進一步提出，利用適配子探針標記技術(shù)，能夠提高血紅蛋白讀取率，克服目前市場糖化血紅蛋白檢測中的弊端。該方法一經(jīng)推廣，可以廣泛應(yīng)用于糖尿病健康定量篩查、糖尿病血糖控制快速監(jiān)測，并取代目前的血糖監(jiān)測法，為廣大糖尿病患者提供更準確有效的血糖監(jiān)測指數(shù)，同時為醫(yī)生調(diào)整用藥提供輔助資料。

該文基于血紅蛋白檢測方法與實踐應(yīng)用，從多方面分析、思考與總結(jié)，為科研工作者和醫(yī)院相關(guān)人員提供詳實、可靠的參考資料，同時又提出更新的血紅蛋白檢測解決方案，為科研實踐提供了參考意義。

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作者簡介：徐菁（1980-），女，湖北武漢人，碩士研究生，講師，主要研究方向為藥物分析、適配子篩選技術(shù)研究。

通訊作者：孫平（1979-），男，湖北黃岡人，碩士研究生，實驗室主任，主要研究方向為實驗室安全管理、生物安全管理。