車前子及其混淆品的微觀特征熒光鑒別研究

羅晉萍 寧紅婷 郭景文 康帥 張南平 連超杰 馬雙成

中圖分類號 R282.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）05-0665-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.05.18

摘 要 目的：建立車前子及其混淆品的微觀特征熒光鑒別方法，為中藥飲片的市場監(jiān)管及檢驗提供技術(shù)支持。方法：應(yīng)用熒光體式顯微鏡分別在可見光和紫外光下觀察，從整體表面特征、種臍特征和切面特征3個方面對車前子[車前（Platago asiatica L.）、平車前（Platago depressa Willd.）的種子]及其混淆品大車前（Platago major L.）的種子、荊芥（Schizonepeta tenuifolia Briq.）的果實、黨參[Codonopsis pilosula （Franch.） Nannf.]的種子、地膚[Kochia scoparia（L.） Schrad.]的種子（去皮）、北柴胡（Bupleurum chinense DC.）的果實進行比較研究和鑒別。結(jié)果：在可見光下觀察，正品車前子表面紋理為波狀條紋或細皺紋，混淆品分別為波狀條紋、縱棱或紋理不明顯；正品車前子種臍位于腹面中央，混淆品除大車前子外其余位于一端；正品車前子切面可見明顯的胚直生其中，混淆品除大車前子外其余胚細小或呈環(huán)形。在紫外光下觀察，正品車前子表面波狀條紋明顯，呈橙色與淺藍綠色相間的熒光，平車前表面為網(wǎng)格狀皺紋，呈灰藍色與灰棕色相間的熒光；正品車前子種臍熒光強烈，混淆品中除荊芥果外其余熒光微弱；正品車前子與混淆品切面在熒光顏色、胚大小及分布位置上均有明顯差異。結(jié)論：熒光體式顯微技術(shù)可有效、準確地鑒別車前子藥材的真?zhèn)巍?/p>

關(guān)鍵詞 熒光體式顯微技術(shù)；車前子；混淆品；微觀特征；整體表面特征；種臍特征；切面特征

Study on Fluorescence Identification of Microscopic Characteristics of Plantaginis Semen and Its Adulterants

LUO Jinping1，NING Hongting1，GUO Jingwen1，KANG Shuai2，ZHANG Nanping2，LIAN Chaojie2，MA Shuangcheng2（1.Shanxi Institute for Food and Drug Control， Taiyuan 030001， China；2.National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 100050， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a fluorescence identification method of the microscopic characteristics for Plantagin Semen and its adulterants， and to provide technical support for the market supervision and inspection of TCM decoction pieces. METHODS： Under visible and ultraviolet light， comparative study and identification of the Plantagin Semen （seeds of Platago asiatica L. and Platago depressa Willd.） and its adulterants as seeds of Platago major L.， fruits of Schizonepeta tenuifolia Briq.， seeds of Codonopsis pilosula （Franch.） Nannf， seeds （peeled） of Kochia scoparia （L.） Schrad.， fruits of Bupleurum chinense DC. were carried out by means of stereoscopic fluorescence microscopy from aspects of overall surface characteristics， umbilicus characteristics and section characteristics. RESULTS： Under visible light， the surface texture of Plantagin Semen was wavy stripe or fine wrinkle， while the adulterants were wavy stripe， longitudinal edge or texture was not obvious. The umbilicus of Plantagin Semen was located in the center of the ventral surface， while that of adulterants were located at one end except for P. major. In the section of Plantagin Semen， there were obvious direct embryos， in which the adulterants were small or circular embryos except for P. major. Under ultraviolet light， P. asiatica had obvious wavy stripes in surface， orange and light blue-green fluorescence； P. depressa had grid-shaped wrinkles and gray-blue and gray-brown fluorescence； the umbilical fluorescence of Plantagin Semen was strong， and the fluorescence of the adulterants was weak except for S. tenuifolia. There were obvious differences in fluorescence color， embryo size and distribution between the section of Plantagin Semen and adulterants. CONCLUSIONS： The stereoscopic fluorescence microscopy is effect and accurate for the identification of Plantagin Semen.

KEYWORDS Stereoscopic fluorescence microscopy； Plantagin Semen； Adulterants； Microscopic characteristics； Overall surface characteristics； Umbilicus characteristics； Section characteristics

車前子為常用傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，曰：“車前子，味甘，性寒。主氣癃，止痛，利水道小便；除濕痹。久服輕身耐老。一名當?shù)?，生平澤。”[1]目前，全世界車前科植物共有3個屬，而在我國僅有車前屬1屬，有17種2變種1變形[2]。我國傳統(tǒng)車前子商品分為大粒車前子和小粒車前子，其中大粒車前子為車前科植物車前（Platago asiatica L.）的種子，小粒車前子為車前科植物大車前（Platago major L.）及平車前（Platago depressa Willd.）的種子，而市場上小粒車前子的商品來源又主要為大車前[3]。在2015年版《中國藥典》（一部）（以下簡稱藥典）中，車前子主要有2個基原，即車前科植物車前和平車前[4]。雖然在《維吾爾藥材標準》（1993年版）中曾將大車前作為車前子的來源收載，但在現(xiàn)行版藥典中未將其作為車前子的正品來源。

由于車前子細?。ㄩL約2 mm，寬約1 mm），混淆品較多，如荊芥（Schizonepeta tenuifolia Briq.）的果實、黨參[Codonopsis pilosula （Franch.） Nannf.]的種子、地膚[Kochia scoparia（L.） Schrad.]的干燥果實及種子、北柴胡（Bupleurum chinense DC.）的果實等，肉眼識別困難，摻偽現(xiàn)象時有發(fā)生。有研究通過薄層色譜法對大車前子、車前子和平車前子[5]以及其質(zhì)量標志物[6]進行鑒定，但均未成功；還有研究者試圖通過高效毛細管電泳結(jié)合聚合酶鏈式技術(shù)鑒別車前子[7-8]，但因檢測成本和技術(shù)問題，難以實現(xiàn)快檢和基層監(jiān)管。有的研究者對車前子及其部分混淆品的粉末進行了顯微鑒別[9-10]，以及采用放大鏡或解剖鏡在自然光下觀察其表面微性狀特征[11-13]。但目前未見采用熒光體式顯微技術(shù)對車前子及其偽品進行鑒定的報道。

熒光體式顯微技術(shù)利用短波長的光線照射生物體或用熒光素染色被檢物體，使之受激發(fā)產(chǎn)生長波長的熒光進行觀察達到鑒別目的。該方法已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、工業(yè)檢測、司法刑偵等領(lǐng)域，但在中藥鑒定方面，無論國家或地方的法定標準以及檢驗檢測中均未得到有效應(yīng)用。該方法較粉末顯微鑒別快速，較一般自然光下微性狀特征的鑒定更具專屬性，且因不需試劑處理樣品更加經(jīng)濟環(huán)保。因此，針對當前中藥材混雜現(xiàn)狀，建立一種準確、快速、簡便易行的篩查中藥材真?zhèn)纹返姆椒ň惋@得十分必要。

1 材料

1.1 儀器

SZX-12型熒光體式顯微鏡及數(shù)碼成像系統(tǒng)（德國卡爾蔡司股份有限公司）。

1.2 藥品

藥典品種來源：車前子于2016年采集于湖北，大車前于2017年采集于河北，均由中國食品藥品檢定研究院張南平主任藥師鑒定為正品；平車前子于2015年采集于山西，由山西食品藥品檢所郭文菊主任藥師鑒定為正品?；煜穪碓矗呵G芥果于2012年收集于安徽、黨參子于2012年收集于甘肅、地膚的種子（去皮）于2012年收集于河北、北柴胡果于2012年收集于甘肅，均由中國食品藥品檢定研究院張繼主任藥師鑒定為正品。所有樣品均收藏于中國食品藥品檢定研究院中藥標本館。

2 方法與結(jié)果

2.1 整體表面特征

取車前子及其混淆品，置于熒光體式顯微鏡的載物臺上，分別在可見光及紫外光下觀察樣品的形狀、顏色、大小、表面紋理等特征差異，同時采用景深擴展進行拍攝及合成圖像。車前子與其混淆品的整體表面特征觀察圖見圖1，表面紋理觀察圖見圖2，對比結(jié)果見表1。

由圖1、圖2和表1可知，車前子與大車前子形狀及表面紋理相近，二者大小雖有差異，但也存在一定范圍的交集。平車前子與大車前子大小與顏色均相近，車前子、平車前子和大車前子在可見光下較難識別，極易混淆；而在紫外光下觀察，三者所展示的微觀特征（表面紋理、熒光顏色及強度等）有明顯區(qū)別。黨參子與荊芥果在可見光下呈現(xiàn)的顏色、形狀及表面紋理相近；而在紫外光下觀察，前者為細縱網(wǎng)紋，后者為點狀細密網(wǎng)紋，較易區(qū)分。在可見光下，無法辨識地膚子（去皮）表面特征細節(jié)；但在熒光體式顯微鏡下，其表面有花紋狀熒光，切面環(huán)形胚的紅色熒光特征十分突顯。

2.2 種臍特征

取車前子及其混淆品，調(diào)整種臍或柱基等部位角度，使其特征面向上，再照“2.1”項下操作，觀察各樣品種臍的形狀、顏色、所在位置等特征差異。車前子及其混淆品的種臍特征圖見圖3，對比結(jié)果見表2。

表2 車前子及其混淆品的種臍特征對比結(jié)果

Tab 2 Comparison result of the umbvlicul cord cha- racteristics of Plantaginis Semen and its adulterants

[品名＼& 位置＼& 形狀＼&顏色 ＼& 可見光下＼& 紫外光下＼&車前子＼&腹面中央＼&闊橢圓形，凹入＼&灰白色或棕色＼&強烈的藍綠色熒光＼&平車前子 ＼&腹面中央＼&近圓形，臍點及合點凹入＼&灰白色或棕色＼&強烈的藍白色熒光＼&大車前子＼&腹面中央＼&橢圓形，臍點及合點凹入＼&灰白色或棕色＼&強烈的橙色熒光＼&柴胡果 ＼&果柄位于一端＼&柱基扁盤形＼&褐色＼&淺棕色熒光微弱＼&黨參子＼&種子一端＼&類三角形，孔洞狀＼&棕色＼&棕黃色熒光＼&地膚子（去皮）＼&種子一端＼&類長圓形，微凹入＼&棕黑色＼&紅、黑相間的熒光＼&荊芥果＼&種子一端＼&類圓形，凹窩狀＼&灰白色＼&強烈的淺黃綠色熒光＼&]

由圖3和表2可知，正品車前子、大車前子以及混淆品大車前子的種臍均位于腹面中央，多呈近圓形或凹入；而其余混淆品的種臍則位于一端，形狀各有不同。在可見光下觀察，正品車前子和平車前子以及混淆品大車前子的種臍均呈灰白色或棕色，而其余混淆品種臍顏色多呈棕色或棕黑色；在紫外光下，正品車前子和平車前子具有強烈偏藍色熒光，而上述混淆品熒光弱或熒光顏色不同?？梢?，通過種臍的位置、形狀、顏色及熒光強度等差異可以有效區(qū)分車前子及其混淆品。

2.3 切面特征

取車前子及其混淆品，將樣品橫剖和縱剖，再照“2.1”方法操作，觀察并拍攝其橫、縱切面特征。車前子及其混淆品的橫、縱切面特征圖分別見圖4、圖5，對比結(jié)果見表3。

由圖4、圖5和表3可見，正品車前子、大車前子以及混淆品大車前子的胚均直生其中，子葉背腹向排列；混淆品柴胡果、黨參子、荊芥果的胚細小，地膚子（去皮）具紅色熒光的胚呈環(huán)形，與正品區(qū)別甚大。

3 討論

車前子具有清熱利尿、滲濕通淋、明目、祛痰之功效，而混淆品與之作用不同，一旦混入其中不僅削弱了車前子的功效，有的甚至?xí)斐刹涣己蠊行ёR別車前子真?zhèn)?，可避免此類事件發(fā)生。熒光圖像不僅具有形態(tài)學(xué)特征，還具有熒光的顏色與強度的優(yōu)勢特征，二者結(jié)合更有助于準確鑒定。因其具有不破壞或少破壞樣品形態(tài)、試驗用量少、快速、準確、環(huán)保等優(yōu)點，且與可見光相比，信息量更大、特征性更強，可作為一種新的方法廣泛應(yīng)用于中藥材的鑒定中。由于熒光強度隨照射時間延長而逐漸減弱，因此檢驗時應(yīng)及時拍攝照片，記錄觀察結(jié)果。由于樣品底部形態(tài)多為圓形或具棱角，觀察和拍攝時較難調(diào)整方向，故將樣品沾少許凡士林或融化的蠟固定其方向。

本研究采用微觀特征熒光鑒別方法對藥典記載的正品車前子（車前子和平車前子）以及5種常見的混淆品進行鑒定，發(fā)現(xiàn)兩者在整體表面特征、種臍特征以及切面特征三個方面均存在差異，可對其進行鑒別。

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（收稿日期：2018-11-14 修回日期：2019-01-02）

（編輯：林 靜）