石菖蒲中生物堿成分的分離與鑒定

胡小玲 唐怡 袁金斌

中圖分類號 R917；R927.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）05-0642-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.05.13

摘 要 目的：分離并鑒定石菖蒲的生物堿成分，為進一步研究其藥理活性奠定基礎。方法：利用陽離子交換樹脂分離石菖蒲的生物堿成分；采用超高效液相色譜串聯(lián)質譜（UPLC-MS）法進行鑒定，色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18，流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈（梯度洗脫），流速為0.3 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為1 μL；離子源為電噴霧離子源，采用正離子模式檢測，并結合Peakview 1.2等軟件對生物堿成分進行分析。結果：石菖蒲中共檢測到86個成分，并鑒定出5個生物堿成分，分別為菖蒲堿甲、N-反式阿魏酰酪胺、N-月桂基二乙醇胺、4-羥雙氫鞘氨醇和5-丁基尿苷。結論：該試驗結果可為石菖蒲生物堿成分的藥理活性研究奠定基礎。

關鍵詞 石菖蒲；生物堿；超高效液相色譜串聯(lián)質譜法；分離；鑒定

Isolation and Identification the Compositions of Alkaloids in Acorus tatarinowii

HU Xiaoling1，TANG Yi1，YUAN Jinbin2（1.Dept. of Pharmacy， Jiangxi Hospital of Integrated Traditional and Western Medicine， Nanchang 330003， China；2.College of Pharmacy， Jiangxi University of TCM， Nanchang 330000， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To isolate and identify the compositions of alkaloids in Acorus tatarinowii， and to lay the foundation for further study of its pharmacological activity. METHODS： The compositions of alkaloids from A. tatarinowii was separated by cation exchange resin. UPLC-MS method was used to identify the alkaloids. The separation was performed on a Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid-acetonitrile （gradient elution） at a flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and the injection volume was 1 μL. ESI ion source was used to detect the fragments， the ion mode scan was positive. Peakview 1.2 and other softwares were used to analyze the compositions of alkaloids. RESULTS： 86 compositions were separated and 5 alkaloids were identified， such as tatarine A， N-trans-feruloyltyramine， N-lauryldiethanolamine， phytosphingosine and 5-butyluridine. CONCLUSIONS： The results of the study lay a foundation for the study of pharmacological activity of alkaloids from A. tatarinowii.

KEYWORDS Acorus tatarinowii； Alkaloids； UPLC-MS； Isolation； Identification

石菖蒲為天南星科植物石菖蒲（Acorus tatarinowii Schott）的干燥根莖，具有化濕開胃、開竅豁痰、醒神益智的功效[1]。臨床上，石菖蒲主要用于治療健忘、中風失語、癲癇、老年癡呆癥等[2]。相關研究發(fā)現(xiàn)，在治療老年癡呆癥的方劑中，石菖蒲的使用頻次最高[3]。

目前，石菖蒲的主要研究側重于其揮發(fā)油成分[4-6]，其非揮發(fā)性成分的報道卻不多。石菖蒲的化學成分多樣，除了揮發(fā)油以外，還有黃酮、醌類、生物堿類、三萜皂苷等[7]，均具有一定的藥理活性。比如，勞安娜等[8]研究發(fā)現(xiàn)石菖蒲中的生物堿成分菖蒲堿乙和菖蒲堿丙可作為預防、改善中老年記憶障礙及老年性癡呆。本文旨在通過陽離子交換樹脂，針對性地分離出石菖蒲的生物堿成分，再通過超高效液相色譜串聯(lián)質譜（UPLC- MS）技術，對其進行成分分析，以期為進一步研究石菖蒲的藥理活性奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器與軟件

Triple TOF 5600 UPLC-MS儀（美國AB Sciex公司）；Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18色譜柱（美國Agilent公司）；BT224S萬分之一電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；001×7陽離子交換樹脂（西安藍曉科技有限公司）。

Peakview 1.2軟件（https：//sciex.com.cn/software- support/softwaredownloads）、Chemical book軟件（https：//www.chemicalbook.com/）均由美國AB Sciex公司開發(fā)。

1.2 藥品與試劑

石菖蒲藥材為2018年8月采集于南昌梅嶺，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學袁金斌教授鑒定為Acorus tatarinowii Schott的干燥根莖；磷酸鹽緩沖液（PBS）粉末（北京中山金橋生物技術有限公司，批號：20180121）；乙腈、甲酸、氫氧化鈉、鹽酸均為分析純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法

2.1 陽離子交換樹脂的預處理

加2倍樹脂體積的純凈水浸泡001×7陽離子交換樹脂24 h，純凈水洗凈后，裝入層析柱中。用3～4倍體積的4%氫氧化鈉沖柱，浸泡2 h后，用純凈水洗至中性；再用3～4倍體積的5%鹽酸沖柱，浸泡2 h后，純凈水洗至中性，備用。

2.2 石菖蒲生物堿的提取

參考文獻[8]中石菖蒲生物堿的提取方法，將100 g粉碎的石菖蒲，過六號篩（100目），置于超聲提取器中，加入3 000 mL的蒸餾水，浸泡2 h后，50 ℃超聲（功率：200 W，頻率：30 kHz）提取2 h，抽濾，得濾液；將濾液于50 ℃減壓濃縮后得石菖蒲粗提物。加入粗提物體積5倍的純凈水攪拌成粗提物混懸液，然后通過001×7陽離子交換樹脂，靜態(tài)吸附4 h；再用乙醇洗至洗脫液無色，用4%的氫氧化鈉乙醇溶液對陽離子交換樹脂進行解析，得解析液；5%鹽酸調解析液pH至7，靜置2 h后，15 000 r/min（離心半徑為5 cm）離心15 min，取上清液50 ℃減壓濃縮，即得石菖蒲生物堿浸膏，得率為5.49%。

2.3 色譜及質譜條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18（100 μm×2.1 μm，1.8 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0.1～5 min，5%→20% B；5～14 min，20%→23%B；14～25 min，23%→46% B；25～35 min，46%→72%B；35～45 min，72%→80% B；45～50 min，80%→20% B）；流速為0.3 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為1 μL。

2.3.2 MS條件 離子源為電噴霧離子源（ESI），霧化氣為60 Psi，輔助氣為60 Psi，噴霧電壓為5 500 V，離子源溫度為600 ℃；在正離子模式下采集數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采集范圍為一級質荷比（m/z）100～1 000，二級m/z 50～1 000；采用基于信息關聯(lián)數(shù)據(jù)采集（IDA）的一級和二級MS解析方法采集數(shù)據(jù)，碰撞能量為25 V。

2.4 石菖蒲生物堿成分分析

2.4.1 供試品溶液的制備 取“2.2”項下的石菖蒲生物堿浸膏1 mg，PBS溶解，0.22 μm微孔濾膜過濾，得質量濃度為5 mg/mL的供試品溶液。

2.4.2 成分分析 取“2.4.1”項下供試品溶液，按“2.3”項下條件進樣測定，記錄石菖蒲生物堿成分的總離子流圖及部分成分的MS數(shù)據(jù)。

2.5 石菖蒲生物堿部分成分的結構鑒定

通過查閱石菖蒲的相關文獻[2-16]，建立石菖蒲化學成分數(shù)據(jù)庫，內容包括化學式、名稱、二級碎片、理論相對分子質量和化學結構，然后采用Peakview 1.2軟件對石菖蒲的一級和二級MS數(shù)據(jù)進行處理。一級MS分析是依據(jù)測定相對分子質量與理論精確相對分子質量的偏差小于5.0×10-6、保留時間誤差范圍小于5.0%和同位素不匹配度小于10.0%的原則[9]，并結合建立石菖蒲化學成分數(shù)據(jù)庫，確定色譜峰對應的化合物的分子式；二級MS分析是在已建立的石菖蒲化學成分數(shù)據(jù)庫中檢索匹配的化合物，并運用Chemical book軟件查出其對應結構；然后將其結構與二級碎片信息比對，判斷斷裂的基團是否為其結構中的官能團；最后結合一級MS信息和二級MS的碎片信息，從而確定該化合物。

3 結果

3.1 石菖蒲生物堿成分分析結果

石菖蒲生物堿成分的總離子流圖見圖1。筆者對其中主要的5個峰進行了鑒定，其MS數(shù)據(jù)信息見表1。

筆者前期查閱相關文獻共找到14種石菖蒲生物堿成分，且經(jīng)過分析，只有表1中的5個成分可通過后續(xù)的鑒定得以確定，故并未將全部成分的MS信息列出。

3.2 石菖蒲生物堿部分成分的結構鑒定

化合物1（峰1），保留時間為8.49 min，準分子離子峰[M+H]+ m/z 280.096 4，經(jīng)Peakview 1.2軟件推測其化學式可能為C17H13NO3（誤差為0.1 ppm）；經(jīng)MS裂解分析可知，[M+H]+ m/z 280.096 4先丟失2個甲氧基（—OCH3）生成碎片離子m/z 218.059 6；再丟失1個H2O生成碎片離子m/z 200.048 9。結合相關文獻[7]可推斷化合物1為菖蒲堿甲?；衔?的MS裂解途徑見圖2。

化合物2（峰2），保留時間為13.30 min，準分子離子峰[M+H]+ m/z 314.133 4，經(jīng)Peakview 1.2軟件推測其化學式可能為C18H19NO4（誤差為0.5 ppm）；經(jīng)MS裂解分析可知，[M+H]+ m/z 314.133 4丟失1個酰胺基部分而生成碎片離子m/z 177.052 5；再丟失1個—OCH3生成碎片離子m/z 145.027 2。結合相關文獻[10]可推斷化合物2為N-反式阿魏酰酪胺。化合物2的MS裂解途徑見圖3。

化合物3（峰3），保留時間為23.98 min，準分子離子峰[M+H]+ m/z 274.274 4，經(jīng)Peakview 1.2軟件推測其化學式可能為C16H35NO2（誤差為0.3 ppm）；經(jīng)MS裂解分析可知，[M+H]+ m/z 274.274 2丟失1個H2O生成碎片離子m/z 256.263 2；再丟失1個—C2H2生成碎片離子m/z 230.247 6，然后脫去1個H2O而生成碎片離子m/z 212.236 4。結合上述信息，推斷化合物3為N-月桂基二乙醇胺（N-lauryldiethanolamine）?；衔?的MS裂解途徑見圖4。

化合物4（峰4），保留時間為24.29 min，準分子離子峰[M+H]+ m/z 318.298 9，經(jīng)Peakview 1.2軟件推測其化學式可能為C18H39NO3（誤差為0.5 ppm）；經(jīng)MS裂解分析可知，[M+H]+ m/z 318.298 9丟失1個H2O生成碎片離子m/z 300.289 1，再丟失1個丙基（—C3H8）生成碎片離子 m/z 256.262 7。結合上述信息，可推斷化合物4為4-羥雙氫鞘氨醇（Phytospingosine）?；衔?的MS裂解途徑見圖5。

化合物5（峰5），保留時間為34.86 min，準分子離子峰[M+H]+ m/z 301.139 2，經(jīng)Peakview 1.2軟件推測其化學式可能為C13H20N2O6（誤差為4.8 ppm）；經(jīng)MS裂解分析可知，[M+H]+ m/z 301.139 2丟失1個—C5H12N2O生成碎片離子m/z 186.924 5；再丟失1個一個甲基（—CH3）生成碎片離子m/z 171.004 3。結合上述信息，可推斷化合物5為5-丁基尿苷（5-butyluridine）?；衔?的MS裂解途徑見圖6。

4 討論

本試驗前期分別采用了正模式與負模式對石菖蒲進行分析，發(fā)現(xiàn)正模式下響應更高，MS信息更加明晰且背景少，有利于確認分子離子或準分子離子，從而可鑒定一些低含量的石菖蒲提取物，故后續(xù)選用正離子模式進行試驗。此外，筆者還考察了15、25、35 V這3個碰撞能量對質譜的影響，發(fā)現(xiàn)在15 V下，一些分子量較大的母離子基本沒有打碎；在35 V下，所得碎片離子中干擾離子太多，不易鑒別化學成分，故選用了25 V的碰撞能量。

本試驗共鑒定出石菖蒲中5個生物堿成分，經(jīng)查閱文獻[7，10]可知，化合物1和化合物2分別為菖蒲堿甲、N-反式阿魏酰酪胺。N-月桂基二乙醇胺、4-羥雙氫鞘氨醇和5-丁基尿苷為首次鑒定出的石菖蒲中的新化合物。

綜上所述，本研究共鑒定了石菖蒲中5個生物堿成分，即菖蒲堿甲、N-反式阿魏酰酪胺、N-月桂基二乙醇胺、4-羥雙氫鞘氨醇和5-丁基尿苷，可為石菖蒲生物堿成分的進一步研究奠定基礎。

參考文獻

[ 1 ] 黃月純，魏剛.石菖蒲揮發(fā)油的氣相色譜指紋圖譜研究[J].中國藥房，2005，16（21）：1676-1677.

[ 2 ] 吳啟端，吳清和.石菖蒲的藥理研究進展[J].中藥新藥與臨床藥理，2006，17（6）：477-480.

[ 3 ] 胡增峣，黃晏，劉港，等.中藥復方治療老年癡呆的用藥規(guī)律分析[J].中藥藥理與臨床，2012，28（5）：252-256.

[ 4 ] 楊潔，陶汝俊，王垠蕓，等.石菖蒲化學成分及其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用研究進展[J].藥物資訊，2017，6（5）：133- 141.

[ 5 ] 盧成淑，馮寧，南國，等.石菖蒲及其活性成分防治阿爾茨海默病的研究進展[J].中草藥，2016，47（7）：1236-1242.

[ 6 ] 倪剛.石菖蒲、華?；瘜W成分及生物活性研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學院，2010.

[ 7 ] 陳鋒.菖蒲屬植物的化學成分及藥理作用[J].世界科學技術（中醫(yī)藥現(xiàn)代化），2011，13（6）：1013-1017.

[ 8 ] 勞安娜，唐希燦，王洪誠，等.石菖蒲中菖蒲堿及它們的用途：中國，ZL97106786.4[P]. 2013-02-19.

[ 9 ] YUAN J， CHEN Y， LIANG J， et al. Component analysis and target cell-based neuroactivity screening of panax ginseng by ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight mass spectrometry[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2016.DOI：10.1016/j.jchromb.2016.10. 014

[10] 吳春華，陳玥，李曉霞，等.石菖蒲化學成分的分離與結構鑒定[J].中國藥物化學雜志，2014，24（3）：209-213.

[11] KUMAR V， KUMAR S， SINGH B， et al. Quantitative and structural analysis of amides and lignans in zonthoxylum armatum by UPLC-DAD-ESI-QTOF-MS/MS[J]. J Pharmaceut Biomed Anal，2014，94（3）：23-29.

[12] 楊穎達. 3種植物的化學成分和生物活性研究[D].武漢：華中科技大學，2014.

[13] 賴顯英，梁紅，趙玉英.石菖蒲化學成分和藥理作用研究[J].中國中藥雜志，2002，27（3）：161-166.

[14] 唐怡，任剛，黃群，等.石菖蒲揮發(fā)油化學成分的GC-MS[J].江西中醫(yī)藥，2014，45（12）：60-62.

[15] 唐怡，李健康，劉校妃，等.石菖蒲鮮、干藥材及其不同部位中揮發(fā)油、α-細辛醚和β-細辛醚的含量比較[J].中國實驗方劑學雜志，2016，22（5）：32-35.

[16] 吳啟端，方永奇，李翎，等.不同劑量石菖蒲對中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響的實驗研究[J].中國藥房，2005，16（9）：656-658.

（收稿日期：2018-09-09 修回日期：2018-11-22）

（編輯：唐曉蓮）