上皮性卵巢癌組織OIP5表達及其意義

丁杰 盧璐 武欣

[摘要]目的 探討OPA相互作用蛋白5（OIP5）在上皮性卵巢癌組織中的表達及臨床病理學意義。方法?選擇90例上皮性卵巢癌組織及配對的癌旁正常組織標本，運用免疫組化技術(shù)檢測OIP5的表達及細胞定位。結(jié)果?與癌旁正常組織相比，OIP5蛋白在卵巢癌組織中表達明顯升高（χ2=14.100，P<0.05），且其表達水平與卵巢癌的N分期、遠端轉(zhuǎn)移和不良預后等顯著相關(guān)，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=5.000～10.106，P<0.05）。結(jié)論 OIP5在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著癌基因的作用。

[關(guān)鍵詞]卵巢腫瘤;OPA相互作用蛋白5;腫瘤轉(zhuǎn)移;預后;病理學，臨床

[中圖分類號]R737.31

[文獻標志碼]A

[文章編號] 2096-5532（2019）05-0560-05

doi：10.11712/jms201905014

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

上皮性卵巢癌 （EOC）是一種常見的婦科惡性腫瘤，占卵巢腫瘤的50%～70%。由于EOC早期 （Ⅰ、Ⅱ期）缺乏典型的臨床表觀，大約76%的病人在就診時往往處于癌癥晚期階段 （Ⅲ、Ⅳ期），發(fā)現(xiàn)時已有腹腔、肝、胸腔或顱內(nèi)轉(zhuǎn)移和種植，這是導致EOC較高病死率的主要原因。目前，EOC的侵襲和轉(zhuǎn)移機制尚不明確。隨著分子生物學的發(fā)展，人類基因組計劃已極大的豐富了人類對腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制認識，各種實驗平臺技術(shù)被用來發(fā)現(xiàn)和鑒定癌癥相關(guān)基因或者治療的靶標。OPA相互作用蛋白5（OIP5）基因最初被鑒定為OPA互作蛋白5[1-3]。PAWLAK等[4]研究顯示，OIP5在一些腫瘤組織或者正常組織中均有表達。OIP5在細胞增殖的G1期或者細胞在靜止、衰老與分化完畢時呈上調(diào)表達[1];亦有研究發(fā)現(xiàn)其對中心體或著絲粒的結(jié)構(gòu)和功能是必要的，OIP5在細胞末期G1期的中心體上聚集，介導染色質(zhì)和細胞周期的調(diào)控[2]。目前相關(guān)研究結(jié)果表明，OIP5參與了胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌、食管癌、腎透明細胞癌、急性髓樣白血病、膠質(zhì)母細胞瘤、乳癌、肝癌和膀胱癌等疾病的發(fā)生和發(fā)展[5-13]。但OIP5在EOC組織中的表達目前尚未見有研究報道。為了明確OIP5在EOC中的表達及其與臨床病理學的相關(guān)性，本文研究運用免疫組化技術(shù)對90例EOC及配對癌旁正常組織中的OIP5表達進行了檢測?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

2010—2016年，我科診治EOC病人 90例，年齡46～83歲，中位年齡61.5歲。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會 （AJCC） 2016年第8版TNM分期標準[1]：Ⅰ期10例，Ⅱ期33例，Ⅲ期34例，Ⅳ期13例;T1+T2期34例，T3+T4期56例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移72例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例;遠端轉(zhuǎn)移60例，無遠端轉(zhuǎn)移30例;黏液型卵巢癌18例，漿液型卵巢癌46例，子宮內(nèi)膜型卵巢癌14例，卵巢移行細胞癌5例和卵巢透明細胞癌7例。本研究通過了醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準，病人均知情同意。

1.2 免疫組化方法

EOC組織切片于60 ℃烤箱中過夜后，依次經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇溶液水化后浸泡于蒸餾水中待用。OIP5蛋白采用檸檬酸進行組織抗原修復：取200 mL修復緩沖液于耐高溫的修復盒，將脫蠟水化后的組織切片置于切片架上，放入緩沖液中，將修復盒放入微波爐中，調(diào)至解凍溫度，20 min后取出，冷卻至室溫，取出玻片，先用蒸餾水沖洗2次，每次5 min，之后再用磷酸鹽緩沖液（pH值7.2～7.4）沖洗2次，每次5 min。甩去PBS液后，每張切片加200 μL的兔抗人OIP5抗體（稀釋度1∶100，Abcam公司），放入濕盒內(nèi)，置于4 ℃冰箱內(nèi)過夜。甩去PBS液，每張切片加200 μL辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)公司），37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育30 min。PBS沖洗3次，每次5 min。甩去PBS液，每張切片加200 μL新鮮配制的DAB溶液，光學顯微鏡下控制顯色，并及時終止反應。自來水沖洗，蘇木精復染20 s，用自來水沖洗30 min，使切片返藍。切片經(jīng)過梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封固。以已知陽性的病例作為陽性對照，以正常兔IgG代替一抗作為免疫組化實驗的陰性對照。

1.3 免疫組化評分

OIP5蛋白表達定位于細胞膜和細胞漿，均為棕黃色、棕褐色顆粒。陽性細胞數(shù)比例評分：陽性表達細胞<5%為0分，5%～20%為1分，21%～50%為2分，>50%為3分。陽性細胞表達染色強度評分：基本不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。綜合陽性細胞數(shù)比例和染色強度，以兩者之和為最后得分判斷：0～1分為陰性（-），2分為弱陽性（+），3～4分為中陽性（），5～6分為強陽性（）。在低倍鏡（100倍）下觀察整張切片，隨機選擇4個高倍視野（200倍）計數(shù)陽性細胞。最后以陰性和弱陽性表達為OIP5低表達組、中陽性和強陽性為OIP5高表達組進行臨床病理學參數(shù)的相關(guān)性分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件對所得結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理和分析，計數(shù)資料的組間比較用χ2檢驗。生存資料單因素分析采用Kaplan-Meier法，差異的顯著性分析采用Log-rank檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 OIP5在卵巢癌組織中的表達

免疫組化結(jié)果顯示，OIP5陽性顆粒定位于細胞膜和細胞質(zhì)/漿中。OIP5的表達具有高度的異質(zhì)性，其在腫瘤組織中的表達從陰性、弱陽性到中陽性表達。90例EOC組織中，OIP5陰性表達者18例，弱陽性表達者20例，中陽性表達者52例，未見強陽性表達。在正常組織中OIP5呈陰性表達的有73例，中陽性表達的有17例。與癌旁正常組織相比，OIP5在EOC組織中顯著性上調(diào)，其差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=14.100，P<0.05）。見圖1。

2.2 OIP5高表達與EOC臨床病理特征的相關(guān)性

本文結(jié)果表明，OIP5的表達水平與N分期和遠端轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=5.000、8.221，P<0.05）。與其他臨床病理學參數(shù)，比如病人年齡、T分期、臨床分期、腫瘤大小和病理學分型等均不具有統(tǒng)計學相關(guān)性（P>0.05）。值得注意的是，雖然OIP5的表達與病理學分型不具有統(tǒng)計學相關(guān)性，但是具有統(tǒng)計學差異的趨勢（P=0.068）。即在黏液型、漿液型、子宮內(nèi)膜型及混合型卵巢癌組織中，OIP5蛋白在漿液型EOC組織中傾向性高表達。見表1。

2.3 OIP5表達與EOC病人預后的關(guān)系

本文90例EOC病人中，手術(shù)時間為2010—2016年，生存時間0.5～37.5個月，平均21.38個月。存活24例，死亡66例;OIP5高表達52例，低表達38例。Long-rank分析顯示，OIP5的表達與不良預后具有統(tǒng)計學意義相關(guān)性（χ2=10.106，P<0.01）。其表達水平越高，總生存率越低。見圖2。

3 討論

在本研究中，我們報道了OIP5在EOC組織中的表達水平及其臨床病理學意義。本文結(jié)果表明，OIP5在EOC組織中相比癌旁正常組織顯著性上調(diào);且OIP5表達與卵巢癌的N分期、遠端轉(zhuǎn)移和不良預后等具有顯著相關(guān)性，提示OIP5可能參與了EOC的發(fā)生發(fā)展。

在惡性腫瘤中，最先開展OIP5的研究是在胃癌中，隨后陸續(xù)地在結(jié)直腸癌、肺癌、食管癌、腎透明細胞癌、急性髓樣白血病、膠質(zhì)母細胞瘤、乳癌、肝癌和膀胱癌等中均發(fā)現(xiàn)OIP5呈上調(diào)表達[5-13]，這與本研究的結(jié)果是一致的。這些研究結(jié)果提示，OIP5在A為黏液型卵巢癌組織，B為漿液型卵巢癌組織，C為子宮內(nèi)膜型卵巢癌組織，D為正常卵巢組織。A、B、C表示OIP5中陽性表達;B1表示弱陽性表達;B2、D表示陰性表達或不表達。圖中比例尺為200 μm。

惡性腫瘤中可能是一個癌基因，參與了癌癥的發(fā)生發(fā)展及惡性表型。CHUN等[6]運用RT-PCR技術(shù)對66例結(jié)腸癌組織和9例正常組織的檢測結(jié)果顯示，OIP5在腫瘤組織中的表達是其在正常組織的3.7倍;但是OIP5的表達與臨床分期（Ⅱ期和Ⅲ期之間）和復發(fā)與否（復發(fā)與非復發(fā)之間）均無顯著相關(guān)性。本研究結(jié)果與其一致，這說明OIP5的表達不太可能作為EOC臨床分期的一個潛在標志物。KOINUMA等[7]在336例非小細胞性肺癌和305例食管鱗癌中分析OIP5表達的臨床病理學意義，結(jié)果顯示，OIP5的表達與非小細胞性肺癌和食管鱗癌的預后均具有統(tǒng)計學相關(guān)性。并且通過多因素分析確認了OIP5的表達在非小細胞性肺癌中是一個獨立的預后因素。本研究結(jié)果與其基本一致。由于本研究未進行多因素分析，因而無法得出OIP5的表達水平是否在EOC中是一個獨立的預后因素。因此，這需要在后續(xù)研究中用較大樣本進行確認。GONG等[8]運用免疫組化技術(shù)檢測OIP5在腎透明細胞癌表達的結(jié)果表明，其表達不僅與T分期、N分期和臨床分期有關(guān)，而且多因素分析顯示OIP5還是腎透明細胞癌的一個獨立預后因素。這與我們的研究有所不同。本研究結(jié)果未顯示，OIP5的表達與T分期和臨床分期無顯著相關(guān)性。其差異可能與使用的抗體不同或者使用的組織標本不同有關(guān)。OIP5已被證實為是一種組織特異性基因，其表達具有一定的組織特異性[5]。此外，OIP5在膀胱癌中亦被鑒定為發(fā)揮著癌基因的作用[13]。在乳癌中OIP5被發(fā)現(xiàn)除了介導染色質(zhì)結(jié)構(gòu)之外，在調(diào)控細胞周期及有絲分裂中正常染色體分離等方面起著重要的作用[11]。盡管如此，有關(guān)OIP5的分子機制的研究鮮有報道。研究發(fā)現(xiàn)，在肝細胞癌中OIP5參與了腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，該作用是通過miR-15-5p調(diào)控OIP5來完成的[12]。在乳癌中OIP5是通過miR-139-5p/NOTCH1通路而起作用的[16]。OIP5在EOC中的作用機制尚不明確，有待于進一步研究。由于其機制研究離不開體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，在本研究中我們未能開展體外EOC細胞系培養(yǎng)工作，因而有關(guān)其具體的生物學功能及相關(guān)機制尚不明確，需要在后續(xù)實驗中進一步研究探討。此外，在我們的研究中，仍有兩點需要注意。首先，由于免疫組化的評分有較大的主觀性，因此免疫組化的評分標準可能會潛在地影響最終統(tǒng)計學相關(guān)性分析。其次，鑒于OIP5在EOC組織中表達的高度異質(zhì)性，在本研究中我們只使用了一種實驗方法探討OIP5在卵巢癌組織中的表達或許不夠充分。免疫印跡或者實時熒光定量PCR技術(shù)可能是免疫組化的一個強有力的實驗技術(shù)驗證或補充。

總之，本研究結(jié)果顯示EOC組織中OIP5表達顯著上調(diào);上調(diào)表達的OIP5與卵巢癌的N分期、遠端轉(zhuǎn)移和不良預后等顯著相關(guān)，提示OIP5可能參與了EOC的發(fā)生發(fā)展。鑒于本研究的樣本例數(shù)有限，因而有必要在后續(xù)實驗中進行多中心大樣本的實驗驗證。

[參考文獻]

[1]NAETAR N， HUTTER S， DORNER D， et al. LAP2 alpha-binding protein LINT-25 is a novel chromatin associated protein involved in cell cycle exit[J]. Journal of Cell Science， 2007，120（5）：737-747.

[2]FUJITA Y， HAYASHI T， KIYOMITSU T， et al. Priming of centromere for CENP-A recruitment by human hMis18alpha， hMis18beta， and M18BP1 [J]. Developmental Cell， 2007，12（1）：17-30.

[3]WILLIAMS J M， CHEN G C， ZHU L， et al. Using the yeast two-hybrid system to identify human epithelial cell proteins that bind gonococcal Opa proteins： intracellular gonococci bind pyruvate kinase via their Opa proteins and require host pyruvate for growth[J]. Molecular Microbiology， 1998，27（1）：171-186.

[4]PAWLAK A， TOUSSAINT C， LEVY I， et al. Characterization of a large population of messenger-rnas from human testis[J]. Genomics， 1995，26（1）：151-158.

[5]NAKAMURA Y， TANAKA F， NAGAHARA H， et al. Opa interacting protein 5 （OIP5） is a novel cancer-testis specific gene in gastric cancer [J]. Annals of Surgical Oncology， 2007，14（2）：885-892.

[6]CHUN H K， CHUNG K S， KIM H C， et al. OIP5 is a highly expressed potential therapeutic target for colorectal and gastric cancers[J]. BMB Reports， 2010，43（5）：349-354.

[7]KOINUMA J， AKIYAMA H， FUJITA M A， et al. Characterization of an Opa interacting protein 5 involved in lung and esophageal carcinogenesis[J]. Cancer Science， 2012，103（3）：577-586.

[8]GONG Mancheng， XU Yangyang， DONG Wenjing， et al. Expression of Opa interacting protein 5 （OIP5） is associated with tumor stage and prognosis of clear cell renal cell carcinoma [J]. Acta Histochemica， 2013，115（8）：810-815.

[9]YAZARLOO F， SHIRKOOHI R， MOBASHERI M B， et al. Expression analysis of four testis-specific genes AURKC， OIP5， PIWIL2 and TAF7L in acute myeloid leukemia： a gender-dependent expression pattern [J]. 2013，30（1）：368.

[10]PEREIRA FREITAS M R， FLEURY MALHEIROS S M， BIASSI T P， et al. Expression of cancer/testis antigens is correlated with improved survival in glioblastoma [J]. Oncotarget， 2013，4（4）：636-646.

[11]MOBASHERI M B， SHIRKOOHI R， MODARRESSI M H. Cancer/Testis OIP5 and TAF7L genes are up-regulated in breast cancer[J]. Asian Pacific Journal of?cancer prevention： APJCP， 2015，16（11）：4623-4628.

[12]LI H， ZHANG J， LEE M J， et al. OIP5， a target of miR-15b-5p， regulates hepatocellular carcinoma growth and metastasis through the AKT/mTORC1 and beta-catenin signaling pathways[J]. Oncotarget， 2017，8（11）：18129-18144.

[13]HE Xuefeng， HOU Jianquan， PING Jigen， et al. Opa interacting protein 5 acts as an oncogene in bladder cancer [J]. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology， 2017，143（11）：2221-2233.

[14]BAKER M. Reproducibility crisis： blame it on the antibodies [J]. Nature， 2015，521（7552）：274-276.

[15]HOLMSETH S， ZHOU Y， FOLLIN-ARBELET V V， et al. Specificity controls for immunocytochemistry： the antigen preadsorption test can Lead to inaccurate assessment of antibody specificity [J]. Journal of Histochemistry & Cytochemistry， 2012，60（3）：174-187.

[16]LI Hongchang， CHEN Yafeng， FENG Wen， et al. Loss of the Opa interacting protein 5 inhibits breast cancer proliferation through miR-139-5p/NOTCH1 pathway [J]. Gene， 2017，603：1-8.

（本文編輯 于國藝）