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    細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法研究進(jìn)展

    2019-09-10 04:59:57王婭寧高龍
    現(xiàn)代鹽化工 2019年5期

    王婭寧 高龍

    摘 ? 要:細(xì)菌內(nèi)毒素廣泛存在于人們的生活中,可引起人體發(fā)熱、白細(xì)胞減少、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素休克、彌散性血管內(nèi)凝血等癥狀,在藥品生產(chǎn)過(guò)程中不可避免地會(huì)引入細(xì)菌內(nèi)毒素,所以藥品質(zhì)量控制中對(duì)內(nèi)毒素的檢測(cè)尤為重要。目前,細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)方法有家兔熱原試驗(yàn)法、鱟試劑法、微量凝膠法、重組C因子法、酶聯(lián)免疫法等檢測(cè)方法。文章對(duì)這幾種檢測(cè)方法進(jìn)行綜述,比較各自的優(yōu)缺點(diǎn),以期為內(nèi)毒素的檢測(cè)提供更合理有效的方法。

    關(guān)鍵詞:細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法;鱟試劑;微量凝膠法;重組C因子法

    細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞壁上的脂多糖,在極微量(1~5 ng/kg體重)的情況下便可引起人體發(fā)熱、白細(xì)胞減少、微循環(huán)障礙、全身炎癥反應(yīng)及多器官功能衰竭等嚴(yán)重不良反應(yīng),所以在藥物生產(chǎn)中,尤其是注射劑的生產(chǎn)中,細(xì)菌內(nèi)毒素的控制與檢測(cè)非常重要,關(guān)乎人們的生命安全。

    細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)方法:家兔熱原試驗(yàn)法、鱟試劑法、微量凝膠法、重組C因子法、酶聯(lián)免疫法等檢測(cè)方法?!吨腥A人民共和國(guó)藥典》(2015版)規(guī)定細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)采用鱟試劑檢測(cè)法。鱟試劑是由美洲鱟或東方鱟的血液中變形細(xì)胞的溶解物提取而成。我國(guó)每年對(duì)鱟試劑的需求為1 000萬(wàn)支,使我國(guó)鱟資源面臨著巨大壓力[1]。由于近些年淺海環(huán)境的惡化,人們肆意地捕食,我國(guó)的鱟資源急劇減少,所以,尋找細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的替代方法和補(bǔ)充方法已經(jīng)迫在眉睫[2]。

    1 ? ?細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法分析

    1.1 ?家兔法

    由于家兔對(duì)熱原的反應(yīng)與人基本相似,所以,采用家兔耳緣靜脈注射的方式,監(jiān)測(cè)家兔體溫,用來(lái)定性檢測(cè)熱原。但是家兔法存在很多缺點(diǎn),如:不能定量檢測(cè)熱原、使用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度低等,因此家兔法正在逐步被取代。

    1.2 ?鱟試劑法

    鱟試劑法是目前檢查細(xì)菌內(nèi)毒素的常用標(biāo)準(zhǔn),鱟試劑主要含有:C因子、B因子、G因子、凝固蛋白酶原等物質(zhì),其反應(yīng)原理是:首先C因子與細(xì)菌內(nèi)毒素結(jié)合被激活為酶活性形式,然后活化的C因子將B因子活化,活化的B因子將凝固蛋白酶原活化為凝固蛋白酶,凝固蛋白酶將凝固蛋白原轉(zhuǎn)化為凝固蛋白形成凝膠[3]。鱟試劑法具有操作簡(jiǎn)單、高靈敏度、易于推廣等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥品檢測(cè),但鱟試劑法在檢測(cè)某些復(fù)雜成分的藥品時(shí),需要排除很多干擾因素,給檢驗(yàn)工作增加了負(fù)擔(dān),同時(shí)由于鱟資源逐漸枯竭,尋找鱟試劑法的替代方法也是最近幾年的研究重點(diǎn)。

    1.3 ?微量凝膠法

    微量凝膠法是采用微量鱟試劑與微量供試品反應(yīng)的一種檢測(cè)方法,在無(wú)菌環(huán)境下加樣品10 μL,和鱟試劑平鋪在無(wú)熱原的平板上進(jìn)行反應(yīng),使用含2%亞甲基藍(lán)的70%乙醇溶液為染料,滴在凝膠樣本上,若形成堅(jiān)實(shí)凝膠,染料會(huì)順著凝膠滑落,記錄為陽(yáng)性;若未形成凝膠,樣本將被染色,記錄為陰性。裴宇盛等[4]選取了74個(gè)品種的232批次的樣品,分別采用凝膠法和微量凝膠法進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果判斷相同的為221批,占95.2%,根據(jù)數(shù)據(jù)分析,微量法的陰性結(jié)果可靠,更加靈敏,但假陽(yáng)性率相對(duì)較高。《歐洲藥典》7.0版已收錄了微量凝膠法且已使用多年,但微量凝膠法在我國(guó)的實(shí)際應(yīng)用中還存在著一些問(wèn)題,如:(1)有部分廠家生產(chǎn)的鱟試劑只能使用自己生產(chǎn)的檢查用水才能判斷檢查結(jié)果。裴宇盛等[4]的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)個(gè)別廠家在使用微量凝膠法時(shí),試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)難以區(qū)分陽(yáng)性和陰性的問(wèn)題,但用鱟試劑廠家提供的檢查用水時(shí),有助于解決該問(wèn)題,這是因?yàn)槲覈?guó)鱟試劑廠家在生產(chǎn)工藝上存在著差別,這種差別所帶來(lái)的影響在微量法中被放大了。(2)目前,我國(guó)還未制定微量凝膠法的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),試驗(yàn)結(jié)果的判定存在一定的主觀性。(3)含有表面活性劑的樣品不適合使用微量法,如果樣品中含有表面活性劑,會(huì)使液體攤散在酶標(biāo)板上,進(jìn)而在水浴孵育時(shí)使液體蒸發(fā),導(dǎo)致無(wú)法觀察結(jié)果。(4)微量法使用的染色劑中含有高濃度乙醇,乙醇揮發(fā)會(huì)導(dǎo)致凝膠融化,使結(jié)果全部為陰性,因此在染色結(jié)束后應(yīng)馬上觀察結(jié)果。所以,微量凝膠法優(yōu)缺點(diǎn)比較明顯,陰性結(jié)果可靠,假陽(yáng)性率太高,可以利用微量凝膠法進(jìn)行大批量樣品篩查,其不確定結(jié)果可以使用凝膠法進(jìn)行驗(yàn)證或者仲裁。微量凝膠法在未來(lái)經(jīng)過(guò)經(jīng)驗(yàn)的積累,制定統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)之后,有望收錄進(jìn)我國(guó)藥典。

    1.4 ?重組C因子法

    重組C因子是由東方鱟或者美洲鱟的基因克隆而成,具有與C因子一樣的生理活性。目前,我國(guó)已成功開發(fā)重組C因子試劑盒且已上市[5],其原理是使用單一的蛋白質(zhì)C因子作為活性成分參與反應(yīng),被內(nèi)毒素活化的C因子將人工合成的三肽鏈熒光底物裂解,產(chǎn)生熒光復(fù)合物,通過(guò)定量檢測(cè)熒光復(fù)合物來(lái)量化細(xì)菌內(nèi)毒素。其優(yōu)點(diǎn)是因?yàn)闆]有B因子的存在,從而有效地避免了因G因子的旁路干擾而產(chǎn)生的假陽(yáng)性。裴宇盛等[6]選用了我國(guó)生產(chǎn)的抗生素、中藥注射液、生化藥品、重組技術(shù)產(chǎn)品、病毒疫苗和單克隆抗體6個(gè)具有代表性的品種進(jìn)行干擾試驗(yàn)。結(jié)果回收率均在50%~200%范圍內(nèi),表明該6個(gè)品種在我國(guó)均可用重組C因子法進(jìn)行檢測(cè)。近些年來(lái),雖然我國(guó)關(guān)于重組C因子的制備研究增多[7-8],但是有關(guān)重組C因子的應(yīng)用研究比較少[9-10],能提供的試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)很少,重組C因子法在我國(guó)還沒有取得法定地位。根據(jù)文獻(xiàn)提供的數(shù)據(jù)支持,仍需要大力推廣重組C因子法,獲得更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),為重組C因子法收錄進(jìn)我國(guó)藥典作鋪墊。

    2 ? ?發(fā)展趨勢(shì)

    微量凝膠法與重組鱟C因子法目前已經(jīng)具備了全面推廣的條件,在推廣使用中可以收集到大量的應(yīng)用數(shù)據(jù),逐步形成一套標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法,然后便可收錄進(jìn)我國(guó)藥典,同時(shí)還應(yīng)該探索靈敏度更高、適應(yīng)性更強(qiáng)的方法。如Grallert H等[11]制備了一種對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素核心保守區(qū)域具有高度特異性和選擇性的噬菌體蛋白,實(shí)現(xiàn)了對(duì)內(nèi)毒素的特異性捕捉。該方法是重組C因子法和ELISA法的結(jié)合,其具體步驟為將樣品吸附到預(yù)先包被的酶標(biāo)板上,然后將樣品基質(zhì)洗脫,加入重組C因子,重組C因子被內(nèi)毒素活化,活化的C因子與熒光底物反應(yīng),產(chǎn)生熒光。該方法檢測(cè)范圍為0.05~500 EU/mL,用15種不同菌株的內(nèi)毒素,同時(shí)用這種方法與細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法測(cè)定,結(jié)果數(shù)值呈線性相關(guān)(R2=0.91)[11]。該方法具有明顯的優(yōu)勢(shì),如:假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果更少,靈敏度更高,檢測(cè)范圍更廣,適用性更強(qiáng)。我國(guó)也有關(guān)于ELISA法檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的研究,但并未使用重組C因子法檢測(cè)。張夢(mèng)等[12]采用分子印跡法,以多巴胺為功能單體,內(nèi)毒素為模板分子,在酶標(biāo)板形成包被抗體MIP,用于吸附內(nèi)毒素,MIP的吸附性與多巴胺的聚合時(shí)間有關(guān),多巴胺膜越厚吸附能力越強(qiáng)。周卓晟[13]采用多粘菌素B作為酶標(biāo)板的包被材料,作為內(nèi)毒素的吸附劑。分子印跡法產(chǎn)生的MIP與多粘菌素B都具有價(jià)格低廉、易于制備的優(yōu)點(diǎn),可以大批量的生產(chǎn)制備,可以嘗試用這兩種材料來(lái)吸附細(xì)菌內(nèi)毒素。

    3 ? ?結(jié)語(yǔ)

    目前,我國(guó)東南沿海海域的中華鱟和圓尾鱟因?yàn)闂h(huán)境的破壞和大量捕食等原因數(shù)量急劇減少,甚至某些地區(qū)瀕臨滅絕。應(yīng)該積極地推廣和使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的替代方法,減少鱟試劑的使用量,使鱟資源變成可持續(xù)發(fā)展的資源,長(zhǎng)期地造福人類。

    [參考文獻(xiàn)]

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    [3]李世崇,胡顯文,胥照平.鱟C因子的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、功能及應(yīng)用[J].中國(guó)生物工程雜志,2003(5):78-81.

    [4]裴宇盛,蔡 ?彤,陳 ?晨,等.微量凝膠法檢查細(xì)菌內(nèi)毒素方法學(xué)驗(yàn)證研究[J].中國(guó)新藥志,2018(27):16-20.

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    [13]周卓晟.檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的酶聯(lián)免疫吸附法及免疫傳感器法的研究[D].武漢:華中科技大學(xué),2010.

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