KCNJ11啟動子區(qū)甲基化在2型糖尿病患者中的初步研究

李雯翀?朱詠瑤?劉抐岢?陳慶隆

[摘要] 目的 探討2型糖尿?。═2DM）與患者KCNJ11啟動子區(qū)部分CpG位點的甲基化的相關性。 方法 選取15例新發(fā)單純性2型糖尿病患者和15例健康正常對照者，用亞硫酸鹽法測定KCNJ11基因啟動子5端300bp中的46個CpG位點DNA甲基化水平，用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）測定KCNJ11基因轉(zhuǎn)錄表達。 結(jié)果 在KCNJ11啟動子區(qū)的實驗區(qū)域存在多個甲基化水平增高的位點，兩組比較，總甲基化比率及其mRNA表達無明顯差異（t=1.0323；P>0.05），每個研究對象KCNJ11啟動子區(qū)的CpG+62、CpG+66、CpG+351位點甲基化比率均有升高，兩組間比較無明顯差異（t=0.2582，0.7821，1.1859；P>0.05），但CpG+78、CpG+96、CpG+100、CpG+104、CpG+108、CpG+111、 CpG+21、 CpG+129、 CpG+132、CpG+136、CpG+141、CpG+168、CpG+174、CpG+178、CpG+201、CpG+210、CpG+215、 CpG+219、 CpG+223、CpG+233、CpG+248、CpG+268、CpG+270、CpG+272、CpG+288、CpG+324等26個位點的甲基化比率在2型糖尿病組的個別患者中有所升高，而在健康正常對照組卻未出現(xiàn)甲基化。 結(jié)論 2型糖尿病患者KCNJ11啟動子區(qū)甲基化呈現(xiàn)異常，可能參與2型糖尿病的發(fā)病。

[關鍵詞] 2型糖尿病；DNA甲基化；聚合酶聯(lián)反應；KCNJ11

[中圖分類號] R587.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）16-10-05

Preliminary study of KCNJ11 promoter methylation in patients with type 2 diabetes mellitus

LI Wenchong ZHU Yongyao LIU Ruike CHEN Qinglong

Department of Endocrinology， Dongguan Third People's Hospital of Dongguang， Guangdong， Dongguang 523320， China

[Abstract] Objective To investigate the correlation between methylation of partial CpG site in KCNJ11 promoter region and type 2 diabetes mellitus （T2DM）. Methods 15 patients with newly diagnosed type 2 diabetes mellitus and 15 healthy controls were enrolled， DNA methylation levels of 46 CpG loci in 300bp gene promoter 5 were measured by sulfite assay in the promoter of KCNJ11 gene promoter. The transcription of KCNJ11 gene was measured by semi quantitative reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）. Results In the experimental region of the KCNJ11 promoter region， multiple methylation levels were increased. The ratio of total methylation and its expression of mRNA were not significantly different between the two groups （P>0.05）. Each object of study of the promoter region of KCNJ11 CpG+62， CpG+66， CpG+351 methylation ratio increased， no significant difference between two groups between （P>0.05）， but increased the methylation ratio of CpG+78， CpG+96， CpG+100， CpG+104， CpG+108， CpG+111， CpG+21， CpG+129， CpG+132， CpG+136， CpG+141， CpG+168， CpG+174， CpG+178， CpG+201， CpG+210， CpG+215， CpG+219， CpG+223， CpG+， CpG+248， CpG+268 233， CpG+270， CpG+272， CpG+288， CpG+324 etc. 26 loci in individual patients with type 2 diabetes group， while in the normal control group without methylation. Conclusion Methylation of KCNJ11 promoter region is abnormal in type 2 diabetes mellitus， and it may be involved in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus.endprint

[Key words] Type 2 diabetes mellitus； DNA methylation； Polymerase chain reaction； KCNJ11

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是指占糖尿病總數(shù)95%以上的，以不同程度胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗共存所致的原發(fā)性糖尿病。越來越多的研究[1]表明，遺傳與表觀遺傳機制共同

在T2DM患者的發(fā)病過程中起重要作用。有學者研究發(fā)現(xiàn)，KCNJ11基因與2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關，其啟動子區(qū)甲基化可能在其中發(fā)揮重要作用[2]。本研究選取2014年4月～2015年4月我院初治T2DM患者15例，探討T2DM患者KCNJ11啟動子區(qū)甲基化，以及比較在2型糖尿病患者及健康正常對照者的mRNA表達情況，從表觀遺傳學角度解釋T2DM的致病機制。結(jié)果令人滿意，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年4月～2015年4月我院初治T2DM患者15例，為東莞市第三人民醫(yī)院內(nèi)分泌科確診的新發(fā)單純性T2DM患者（依照WHO1999診斷標準），男9例，女6例，平均年齡（57.0±13.1）歲。同一時間選取年齡、性別匹配的正常對照組15例，選自無糖尿病、自身免疫性疾病及其家族史的健康志愿者；男9例，女6例，平均年齡（56.7±10.1）歲：75g口服葡萄糖耐量實驗（oral glucose toleran test，OGTT）：空腹血糖<5.6mmol/L，糖負荷2h血糖<7.8mmol/L?；颊呔卺t(yī)師告知下自愿配合完成本次研究；排除既往明確診斷為糖尿病患者；排除合并有嚴重感染、免疫功能疾病、惡性腫瘤、肝腎功能不全及心功能障礙患者；排除妊娠期、哺乳期患者；排除治療和隨訪期間失訪患者。兩組患者基線資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 標本收集 選取我院內(nèi)分泌科初治T2DM患者15例，收集所有受試者晨起空腹靜脈血各4mL分別注入EDTA-K2的抗凝管內(nèi)（2支管各2mL）和干燥管內(nèi)（1支管3mL），一支EDTA-K2的抗凝管常規(guī)分離血漿行靜脈血漿血糖測定，干燥管常規(guī)分離血漿后取血清行胰島素、C-肽測定。日立7170A全自動生化分析儀測定血糖，葡萄糖氧化酶法測定血漿血糖，糖化血紅蛋白（HbA1C）檢測采用高壓液相色譜法，運用深圳邁瑞全自動糖化血紅蛋白分析儀進行檢測。德國西門子ADVIACENTAUR CP全自動免疫分析儀化學發(fā)光免疫分析法測定血清胰島素、C-肽。兩支EDTA-K2的抗凝管抗凝血備存于-80℃冰箱行基因測定。

1.2.2 CpG島預測 KCNJ11啟動子區(qū)總長度為1417bp，通過http：//www.urogene.org/cgi-bin/met在線軟件預測285 ～ 910bp（共626bp）是一個CpG富含區(qū)域（CpG島），位于第一外顯子下游游用“+”表示，檢測5端300bp左右區(qū)域，見圖1。

1.2.3 BSP-測序 取受試者靜脈血1mL，采用基因組DNA提取試劑盒（GENERAY，GK1022）抽提受試者外周血白細胞DNA，紫外分光光度法檢測DNA純度，置于-80℃凍存待用。應用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit（QIAGEN，cat：59824）按照說明

書進行DNA亞硫酸氫鹽修飾處理，未甲基化的胞嘧啶經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后變?yōu)槟蜞奏?，甲基化的胞嘧啶不改變。MethPrimer軟件設計甲基化KCNJ11引物（見表1），引物由GENERAY公司合成。PCR擴增總體系50μL，加入經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的DNA模板2μL，2×PCR buffer 25μL，上下游引物各1μL，用雙蒸水調(diào)整至終體積為50μL。PCR條件及設定反應程序：95℃預變性4min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，運行40個循環(huán)；72℃修復延伸5min結(jié)束反應。PCR產(chǎn)物以3%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段，挑取陽性克隆送GENERAY公司測序。BSP擴增基因包含46個CpG位點，本研究設定原始系列中所有的CpG都是甲基化的，經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后KCNJ11修飾序列所有的CpG均不發(fā)生改變，以避免原始序列中的TG感染甲基化率，見圖2。使用Vector NTI 8 軟件對比序列，研究發(fā)現(xiàn)甲基化發(fā)生在第+62位、+66位、+351位3個CpG位點上，因此，以甲基化胞嘧啶（mC）克隆數(shù)目/10×100%計算個體甲基化率。

1.2.4 QPCR檢測 用HiPure Blood/Liquid RNA Kit（Magen，R4163）提取外周血白細胞RNA，按Reverse Transcription System（Promega，A3500）試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。QPCR擴增總體系20μL，加cDNA模板1.5μL，GoTaq qPCR Master Mix （Promega，A6002）10μL，上下游引物（見表1）1μL，用雙蒸水調(diào)整至終體積為20μL。PCR條件及設定反應程序：95℃預變性120s；95℃變性15s，60℃退火延伸30s，運行40個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計學分析

符合正態(tài)分布的計量資料采用（）表示，組間比較采用t檢測，mRNA相對定量結(jié)果比較用秩和檢驗，相關分析用Spearman相關分析。采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的臨床特點

T2DM患者為單純性新發(fā)患者，空腹血糖（11.62±3.64）mmol/L，HbA1C（10.15±2.69）%，空腹胰島素（10.2±5.07）μU/mL，空腹C-肽（2.33±1.05）ng/mL。入組的15例T2DM患者與15例健康正常對照組比較，年齡及性別無顯著差異。endprint

2.2 T2DM組與健康正常對照組KCNJ11啟動子區(qū)甲基化位點及水平比較

兩組出現(xiàn)甲基化的位點37個，2型糖尿組甲基化的位點是健康正常對照組的3.18倍，CpG+78、CpG+96、CpG+100、CpG+104、CpG+108、CpG+111、 CpG+121、 CpG+129、 CpG+132、CpG+136、CpG+141、CpG+168、CpG+174、CpG+178、CpG+201、CpG+210、CpG+215、 CpG+219、 CpG+223、CpG+233、CpG+248、CpG+268、CpG+270、CpG+272、CpG+288、CpG+324等26個位點的甲基化比率在2型糖尿病組的個別患者中有所升高，而在健康正常對照組卻未出現(xiàn)甲基化，兩組間總甲基化水平無明顯差異（t=1.0323；P>0.05），各組均有甲基化的位點分別為CpG+62、CpG+66、CpG+351，見A圖，該三個位點在正常組，甲基化比率分別為（58%±24%）、（46%±17%）、（96%±8.944%）；在2型糖尿病組分別為（60%±18%）、（41%±18%）、（99%±4%），正常組與2型糖尿病組的三個位點甲基化比率均無明顯差異（t=0.2582，0.7821，1.1859；P>0.05），見B圖。正常對照組mRNA與2型糖尿病組mRNA相對定量結(jié)果比較無明顯差異（F=0.2534；P>0.05）。

2.3 KCNJ11基因啟動子區(qū)甲基化與蛋白質(zhì)表達的關系

直線回歸分析顯示，2型糖尿病組患者KCNJ11基因啟動子區(qū)甲基化率高于健康正常組，而由KCNJ11基因編碼內(nèi)向整流型鉀離子通道蛋白Kir6.2表達則低于健康正常組，甲基化程度與但標志表達呈顯著負相關（r=-0.93，P<0.01）。

3 討論

2型糖尿病為多基因遺傳性復雜病[3]，目前對2型糖尿病的病因和發(fā)病機制仍然認識不足，是一組異質(zhì)性疾病，占糖尿病發(fā)病的絕大部分，此類患者并未完全喪失產(chǎn)生胰島素的能力，但胰島素的作用效果較差[4]，其病因較為復雜，一方面胰島素分泌相對不足，另一方面患者產(chǎn)生了胰島素抵抗[5-6]。2型糖尿病的發(fā)病除了受到環(huán)境因素的影響外[7]，基因遺傳因素的影響非常明顯[8]。對于2型糖尿病的易感基因的研究中，KCNJ11一直是一個熱點。KCN11基因編碼內(nèi)向整流鉀通道Kir6.2亞基。Kir6.2亞基主要分布于胰島β細胞，并與磺脲受體1共同組成β細胞ATP敏感的鉀通道（K-ATP通道）[9]，該通道在胰島素分泌和作用過程中扮演著十分重要的角色[10]，成為2型糖尿病發(fā)病機制中易感基因之一。目前有大量的研究[11-12]提示KCNJ11的基因突變是2型糖尿病發(fā)病機制之一，并把2型糖尿病發(fā)病機制的研究提升到表觀遺傳學水平，在國外Olsson AH等[13]報道，在對2型糖尿病患者胰島細胞啟動子甲基化的研究中，發(fā)現(xiàn)胰島β細胞相關基因之一KCNJ11甲基化與胰島β細胞mRNA表達呈負相關，在我國尚無相關報道。

本研究通過對我國新發(fā)2型糖尿病患者血液標本進行表觀遺傳學的研究，把2型糖尿病患者KCNJ11啟動子區(qū)甲基化及其mRNA表達及與健康正常人群對比，發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者KCNJ11啟動子區(qū)甲基化的位點明顯增多，推測可能：（1）2型糖尿病患者啟動子區(qū)的某些位點的甲基化水平變化可能影響胰島β分泌胰島素功能變化。（2）2型糖尿病患者KCNJ11啟動子區(qū)的甲基化水平變化可能與該基因突變相關[14]。

綜上所述，目前在糖尿病領域中，對于DNA甲基化的研究主要針對兩個方面[15]：一方面是全基因組水平上掃描與糖尿病相關的差異DNA甲基化；另一方面是利用特異性引物對先前研究中已知功能的糖尿病相關基因進行差異DNA甲基化檢測。本研究通過對2型糖尿病患者KCNJ11啟動子區(qū)部分位點甲基化的狀態(tài)，極大的促進了2型糖尿病發(fā)病機制在表觀遺傳學研究的發(fā)展，為今后2型糖尿病發(fā)病機制及新藥[16]的研究提供了方向，然而是否存在其他相關基因位點的特異性甲基化與糖尿病的發(fā)生有關，仍尚待研究。本研究所用樣本量較小，后續(xù)深入研究需采用較大的樣本量。

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（收稿日期：2017-06-27）endprint