安徽無花果炭疽病病原鑒定及對殺菌劑的敏感性

李丹丹 劉燦 葉磊 喬慧君 檀根甲

摘要 采集安徽田間典型發(fā)病癥狀的樣品，通過組織分離法從無花果病葉和病果上分離獲得10個菌株，采用形態(tài)學(xué)方法和分子生物學(xué)方法鑒定并進行致病性測定和柯赫氏法則驗證。結(jié)果表明，所分離的10個菌株均為膠胞炭疽（Colletotrichum gloeosporioides），其中K7菌株的致病性最強。采用菌絲生長速率法和含毒介質(zhì)法測定了多菌靈、苯甲·丙環(huán)唑、苯甲·嘧菌酯、戊唑醇、吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺等7 種殺菌劑對無花果炭疽病菌K7菌株的抑制作用。其中苯丙甲環(huán)唑和咪鮮胺對K7菌株的菌絲生長抑制效果最好，EC50值分別為0.011 2和0.013 0 μg/ml。該研究為無花果炭疽病菌的鑒定和高效防治提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 無花果;病原菌鑒定;膠孢炭疽菌;殺菌劑

中圖分類號：S436.639 文獻標識碼：A 文章編號：2095-3305（2019）06-014-04

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2019.06.007

Isolation and Identification of the Pathogen in Fig Anthracnose and Bioactivity of 7 Fungicides Against This Pathogen

LI Dan-danet al（College of Plant Protection，Anhui Agricultural University，Key Laboratory of biology and Sustainable Management of Plant Diseases and Pests of Anhui Higher Education Institutes，Hefei，Anhui 230036）

Abstract Samples with typical symptom were collected from the field in Anhui Province and then 10 strains were isolated from leaf and fruit by tissue separation method. The pathogen of fig anthracnose was identified by morphological and molecular biological methods and the pathogenicity of pathogen was tested by Koch’s law. The results showed that the 10 strains were Colletotrichum gloeosporioides，and the K7 was the most virulent strain. Based on mycelial growth method and the toxic medium method，the inhibitory activity of carbendazim，difenoconazole·propiconazole，difenoconazole·azoxystrobin，tebuconazole，pyraclostrobin，difenoconazole and prochloraz against the fig anthraces K7 strain were determined. Among them，difenoconazole and prochloraz had the most satisfactory activity against the mycelial growth of K7 strain，and the EC50 values were 0.011 2 μg/ml and 0.013 0 μg/ml，respectively. This study provided a theoretical basis for understanding the pathogen diversity and chemical control of fig anthracnose.

Key words Fig; Identification; Colletotrichum gloeosporioides;Fungicide

無花果（Ficus carica）屬桑科榕屬無花果亞屬，原產(chǎn)于地中海，落葉灌木或小喬木，花隱生于囊狀花托內(nèi)，為隱頭花序，故名無花果[1]。無花果果實柔軟味甜，含有人體需要的18種氨基酸、多種維生素和微量元素及豐富的食物纖維，具有較高的藥用價值和營養(yǎng)價值。其性味甘平，能吸附腸道內(nèi)有害物質(zhì)，促進腸道內(nèi)有益菌類繁殖，維持正常的血糖和膽固醇含量，提高人體免疫力和抗衰老、抗病能力，且具有減肥美容的功效[2]。美國和日本已經(jīng)將無花果定位為抗癌食品，無花果果干、無花果茶飲品等均已上市，應(yīng)用前景十分廣闊。

無花果炭疽病是由膠孢炭疽菌 [Colletotrichum gloeosporioides （Penz.） Sacc.]引起的一種真菌性病害，隨著無花果產(chǎn)業(yè)擴大和氣候變化，該病已經(jīng)成為影響無花果產(chǎn)量和品質(zhì)的重要病害。膠孢炭疽菌寄主范圍廣，除侵染大田作物外，還可危害無花果、桃、梨、葡萄和柑橘等多種果樹。當(dāng)空氣濕度大時，無花果樹易發(fā)生炭疽病，隨著樹齡增加，果園郁閉，該病發(fā)生概率大，成為無花果生長期和采后貯藏期的重要病害，嚴重影響果實品質(zhì)和產(chǎn)量[3]。合肥市作為目前安徽省最大的無花果露地栽培基地，無花果種植面積逐年增加，主要的栽培品種為108B、白山口、馬斯依淘芬、金奧芬、121E、芭勞奈、波姬紅、118D和青皮。據(jù)筆者調(diào)查，該病在合肥市無花果種植基地發(fā)病率達到50%～80%，不僅危害了無花果產(chǎn)量與質(zhì)量，而且嚴重影響了無花果采后貯藏和銷售[4]。目前，對無花果炭疽病及其病原的研究尚少[3-4]，筆者對合肥市無花果炭疽病進行了病原菌分離鑒定，并測定7種殺菌劑對無花果炭疽病菌的抑制作用，以期為深入了解無花果炭疽病菌的致病性和化學(xué)防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料來源 病樣采于安徽省肥西縣官亭鎮(zhèn)無花果產(chǎn)區(qū)，采用品種為108 B的無花果發(fā)病病葉和病果。將病葉和病果保存于密封袋中帶回實驗室，用于后續(xù)試驗研究，拍照并記錄發(fā)病葉片和病果的主要特征。

1.1.2 供試藥劑 98%多菌靈原藥（寧國市朝農(nóng)化工有限公司）;97%戊唑醇原藥（安徽眾邦生物工程有限公司）;97%吡唑醚菌酯原藥（巴斯夫歐洲公司）;98%苯醚甲環(huán)唑原藥;97%咪鮮胺原藥（青島海納生物科技有限公司）;300 g/L苯甲·丙環(huán)唑乳油（瑞士先正達作物保護有限公司）;30%苯甲·嘧菌酯懸浮劑（安徽豐樂農(nóng)化有限責(zé)任公司）。

1.1.3 供試引物 試驗所用引物如表1所示。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離、純化 采用組織分離法[5-7]，切取病葉和病果的病健交界處組織塊，放入75%酒精中消毒20～30 s，然后轉(zhuǎn)入0.1%的升汞溶液中消毒1～2 min，最后用無菌水沖洗3次，轉(zhuǎn)移至含有鏈霉素的PDA平板上，27℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5 d左右，純化后用單孢分離法挑取單孢轉(zhuǎn)入試管斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)并保存。

1.2.2 柯赫氏法則驗證 選取健康的無花果葉片、葉柄和果，用75%酒精進行表面消毒，后用無菌水沖洗干凈，采用人工接種方法測定病原菌的致病性。具體操作如下：用0.05%吐溫20溶液洗下PDA平板中孢子，在顯微鏡下調(diào)整孢子懸浮液濃度為1×107個/ml;用滅菌的大頭針均勻地刺傷葉片、葉柄和果實，將孢子懸浮液均勻地噴灑在其表面，每個處理3次重復(fù)，設(shè)置無菌水對照。上述所有處理用保鮮膜包裹，放置于人工氣候箱中28℃光照培養(yǎng)，每天觀察發(fā)病情況并拍照記錄。

1.2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 將分離純化的單孢培養(yǎng)物用直徑5 mm打孔器制成菌餅，接種到PDA平板中央，27℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)，每天觀察菌絲生長情況及菌落形態(tài)變化。待菌落成熟并產(chǎn)孢，用0.05%吐溫20洗下孢子，取分生孢子懸浮液滴在玻片上，在顯微鏡下觀察分生孢子的形態(tài)特征并記錄分生孢子的大小[7]。采用玻片萌發(fā)法誘導(dǎo)附著胞的產(chǎn)生，觀察附著胞的形態(tài)特征。

1.2.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 分離純化病原菌后對病原菌進行分子生物學(xué)鑒定。采用CTAB法分別提取各菌落的DNA[8]，對病原菌的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）、肌動蛋白基因（actin，ACT）、β微管蛋白基因（βtubulin，TUB2）、幾丁質(zhì)合成酶A基因（chitin synthase A，CHS1）、3磷酸甘油醛脫氫酶基因（glyceraldehydes3phosphate dehydrogenase，GAPDH）和鈣調(diào)蛋白基因（calmodulin，CAL）進行PCR擴增。PCR反應(yīng)總體系為25 μl，包括DNA模板1 μl，正反向引物各1 μL，2×Master Mix 12.5 μl，以9.5 μl ddH2O補足至25 μl。反應(yīng)程序見表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將具有目的條帶的產(chǎn)物送擎科生物科技公司進行測序，將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的rDNA序列比對，并下載含有ITS、ACT、GAPDH、TUB2、CHS1和HIS3等6種基因的炭疽屬模式菌株作為參考序列進行多位點系統(tǒng)遺傳學(xué)分析建樹系。用EditSeq軟件將各基因按照ITSACTCALCHS1TUB2GAPDH的順序連接，用mafft 2.7和Clustal 2.0將序列進行比對并校正，用MEGA6.0軟件，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以自展法進行檢測，循環(huán)1 000次，構(gòu)建供試菌株的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.2.5 殺菌劑對病原菌的毒力測定 采用含毒介質(zhì)法[9]，選取病原菌活化后接種到PDA上，恒溫黑暗培養(yǎng)5 d后待用。準確稱取藥劑，將多菌靈、苯甲·丙環(huán)唑、苯甲·嘧菌酯、戊唑醇、吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺，分別配制成1、10、25、50和100 μg/ml濃度，用丙酮稀釋原藥，無菌水和丙酮作為對照。將培養(yǎng)基按照藥與培養(yǎng)基1∶10比例配好，用移液槍取出1 ml藥液于90 mm培養(yǎng)皿中，再取9 ml融化好的PDA培養(yǎng)基混合均勻，然后倒平板，放置凝固后備用。將培養(yǎng)好的病菌用直徑5 mm 打孔器打取菌餅，每個含藥平板中心接入菌餅，每個處理均設(shè)3個平板重復(fù)。接種菌餅后放入27℃恒溫箱中，培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測量菌落直徑，相對抑制率 =（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。用DPS V7.05版軟件對藥劑濃度、抑制率求得殺菌劑毒力回歸方程、EC50、EC90及95%置信限。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀描述

試驗樣品采于2017年9月，分別收集無花果發(fā)病的葉片、葉柄及果實，癥狀如圖1所示。葉片中一部分發(fā)病的葉片背面沿葉脈散布褐色病斑（圖1a），另一部分葉片，在葉片正面邊緣處散布淡黃色病斑，病斑中間為褐色壞死病斑（圖1b）;葉柄感病初變暗褐色，后病斑逐漸擴大，中間顏色呈深褐色，邊緣處顏色較淡（圖1c）;發(fā)病果實表面呈現(xiàn)圓形或橢圓形的褐色斑塊，病斑中間處凹陷顏色較淡，病斑邊緣顏色較深（圖1d）。

2.2 病原菌分離

通過組織分離法，從葉片、葉柄及果實病樣上分離得到10個菌株，將其純化用于后續(xù)試驗。

2.3 病原菌致病性與柯赫氏法則驗證

將分離得到的10個菌株接種到健康的葉片、葉柄和果實上，3 d后不同接種部位都出現(xiàn)了與田間自然發(fā)病一致的癥狀，其中K7菌株的致病性最強。葉片正面散布中心為深褐色邊緣為淡黃色壞死斑，有明顯的黃色暈圈（圖1e）。葉片背面深褐色病斑沿葉脈擴展（圖1f），葉柄感病后傷口部位變暗褐色后病斑逐漸擴大，感病部位稍凹陷（圖1g）。發(fā)病果實表面呈現(xiàn)圓形褐色斑塊，病斑中間處顏色較淡，病斑邊緣顏色較深（圖1h）。對病斑組織再次進行病原菌分離，分離所得菌落與原接種菌落形態(tài)特征一致，且分生孢子形態(tài)特征也完全一致，符合柯赫氏法則。試驗中所有空白對照均未發(fā)病，也沒有分離到病原菌（圖1i～k）。綜上可以確定，試驗中分離所得的菌株確實為引起無花果炭疽病的病原菌。

2.4 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

通過組織分離法，從病樣上純化并進行單胞分離得到10株病原菌，將各菌株編號后觀察菌落形態(tài)。菌落在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，菌落呈圓形，邊緣整齊，菌落生長初期為白色，隨著生長菌落中間由白色逐漸變?yōu)榛疑缴罨疑涔饣?、蓬松。?dāng)菌落長滿培養(yǎng)皿后，中間可見橘紅色黏狀孢子團（圖2a）。用0.05%吐溫20洗下菌落的孢子，于光學(xué)顯微鏡下觀察。各菌落的分生孢子形態(tài)特征基本相同，分生孢子呈長橢圓形、透明，大小為（7.5～12.0） μm×（2.0～5.5） μm，孢子中間有油滴狀透明圓圈（圖2b）。利用玻片萌發(fā)法誘導(dǎo)附著胞的產(chǎn)生，附著胞褐色呈吸盤狀，中間有白色圓圈（圖2c）。根據(jù)以上對真菌的形態(tài)特征描述，鑒定分離的10個菌株均為炭疽菌（Colletotrichum） [10]。

2.5 病原菌分子生物學(xué)鑒定

對10個菌株的ITS、ACT、CAL、CHS1、TUB2和GAPDH基因進行擴增，得到長度分別為555、240、690、300、750和580 bp的片段（圖3）。序列擴增測序后，與參考基因進行比對，構(gòu)建最大似然分析生成的系統(tǒng)發(fā)生樹（圖4）。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，病原菌與炭疽屬模式菌株中的C. gloeosporioides聚為一個進化枝，其支持率為98%。結(jié)合病原菌的形態(tài)特征與多基因系統(tǒng)發(fā)育樹，確定無花果炭疽病病原菌為膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）。

2.6 殺菌劑對菌株K7菌絲生長的抑制作用

由表2可以看出，7種殺菌劑對病原菌都有抑制作用，其中苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺對病原菌的菌絲生長抑制作用最好，EC50值分別為0.011 2和0.013 0 μg/ml，其次是多菌靈，EC50值為0.592 0 μg/ml，其他藥劑苯甲·丙環(huán)唑、苯甲·嘧菌酯、戊唑醇和吡唑醚菌酯的EC50值分別為1.243 2、4.845 1、3.790 3和6.420 8 μg/ml。

3 討論

該試驗對安徽省肥西縣官亭鎮(zhèn)無花果產(chǎn)區(qū)108 B品種的無花果病葉和病果進行病原菌的分離純化，分離菌株經(jīng)柯赫氏法則驗證為無花果炭疽病的病原菌。通過對病原菌的形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)其與張雪丹在威海無花果炭疽病病原鑒定及殺菌劑毒力測定中所描述的膠孢炭疽形態(tài)特征基本一致[4]。將病原菌的ITS、ACT、CAL、CHS1、TUB2和GAPDH 6種基因連接并進行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)育樹結(jié)果顯示該病原菌與炭疽菌屬膠孢炭疽復(fù)合種下的膠孢炭疽模式菌株在一個分枝上，聚為一個進化枝并且支持率為98%，與Weir所報道的無花果炭疽病癥狀一致[10]，結(jié)合病原菌形態(tài)學(xué)特征和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析可確定引發(fā)無花果炭疽病的病原菌為膠孢炭疽復(fù)合種下的膠孢炭疽C. gloeosporioies。

在進行室內(nèi)回接試驗時發(fā)現(xiàn)，回接初期葉片及果實上出現(xiàn)退綠斑點，發(fā)病癥狀不明顯，不易觀察，在回接12 h后，病斑迅速擴展，葉片及果實發(fā)病嚴重。田間果實感病初期癥狀不明顯，不易察覺，果實接近成熟時病斑會迅速擴展，田間發(fā)病明顯加重，此時已經(jīng)無法有效進行病害的防控工作，所以對病害的早期準確診斷是防止病害發(fā)生、擴展的前提。

近年來無花果的栽植品種和種植規(guī)模不斷增加，同時無花果炭疽病也在逐年加重，這給果農(nóng)帶來巨大的經(jīng)濟損失?；瘜W(xué)防治是防治無花果炭疽病的主要手段，該試驗對多菌靈、苯甲·丙環(huán)唑、苯甲·嘧菌酯、戊唑醇、吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺等7種藥劑進行毒力測定，結(jié)果顯示7種殺菌劑對病原菌均有較好的抑制作用，其中苯丙甲環(huán)唑和咪鮮胺對菌絲生長抑制作用最好，EC50值分別為0.011 2和0.013 0 μg/ml。該研究為無花果炭疽病的針對性防治提供了理論依據(jù)。

為實現(xiàn)無花果炭疽病的高效綜合防治，種植基地要合理密植、通風(fēng)，農(nóng)事操作中盡量避免造成傷口，防止病原菌的侵入，同時采用合理高效的化學(xué)藥劑有效控制病害的發(fā)生和蔓延。

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責(zé)任編輯：鄭丹丹