響應(yīng)面法優(yōu)化白首烏C21甾苷熱回流提取工藝

許慧卿 馮進 李春陽 顧閩峰 吳承東 張明 張道國

摘要：【目的】通過響應(yīng)面法優(yōu)化白首烏中C21甾苷的熱回流提取工藝條件，為促進白首烏C21甾苷在食品工業(yè)中的開發(fā)利用提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳?年生濱烏一號為原料，通過單因素試驗考察乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度和提取時間等4個因素對白首烏C21甾苷提取量的影響;利用響應(yīng)面試驗設(shè)計，采用4因素3水平分析法對白首烏C21甾苷熱回流提取工藝進行優(yōu)化。【結(jié)果】建立了白首烏C21甾苷提取量（Y）與乙醇體積分數(shù)（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和提取時間（D）間的二次多元回歸方程： Y=22.76+0.81A+0.85B+1.10C+1.44D+0.32AB–0.18AC+0.11AD+0.94BC+0.66BD+0.57CD–1.14A2–2.00B2–1.98C2–1.59D2。各因素對白首烏C21甾苷提取量影響效果的排序為提取時間>提取溫度>料液比>乙醇體積分數(shù)，4個因素及料液比與提取溫度、料液比與提取時間、提取溫度與提取時間的交互作用對白首烏C21甾苷提取量的影響顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）。熱回流提取白首烏C21甾苷的最佳工藝條件為：乙醇體積分數(shù)90%、料液比1∶17（g/mL）、提取溫度80 ℃、提取時間2.5 h，在此條件下，白首烏C21甾苷提取量為23.56±0.432 mg/g，與預(yù)測值（23.79 mg/g）接近。【結(jié)論】響應(yīng)面優(yōu)化的熱回流提取工藝可有效提取白首烏C21甾苷，建立的回歸模型可用于實際生產(chǎn)預(yù)測。

關(guān)鍵詞： 白首烏;C21甾苷;熱回流提取;單因素;響應(yīng)面法;工藝優(yōu)化

中圖分類號： S567.79? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）06-1304-08

Abstract：【Objective】The thermal circumfluence extraction parameters of C21 steroidal glycosides in Cynanchum auriculatum Royle ex Wight were optimized in this work by response surface methodology to promote their development and utilization in the food industry. 【Method】Biennial C. auriculatum Bingwuyihao was subjected to C21 steroidal glycosides extraction in this work， and the effects of extraction parameters， such as ethanol volume fraction， solid-to-liquid ratio， extraction temperature and extraction time， on the yield of C21 steroidal glycosides were investigated by single-factor tests. Thereafter， a response surface experiment with four factors and three levels was utilized to optimize the extraction process of C21 steroidal glycosides from C. auriculatum. 【Result】A quadratic multiple regression equation between the extraction yield of C21 steroidal glycosides（Y） and ethanol volume fraction（A）， the solid-to-liquid ratio（B）， extraction temperature （C） and extraction time（D） was established：Y=22.76+0.81A+0.85B+1.10C+1.44D+0.32AB–0.18AC+0.11AD+0.94BC+0.66BD+0.57CD–1.14A2–2.00B2–1.98C2–1.59D2. The order of factors affecting C21 steroidal glycosides yield was as fo-llow：extraction time>extraction temperature>solid-to-liquid ratio>ethanol volume fraction. The effects of various factors and interaction between solid-to-liquid ratio and extraction temperature，between solid-to-liquid ratio and extraction time，between extraction temperature and extraction time on the C21 steroidal glycosides yield were significant（P<0.05） or extremely significant（P<0.01）. The optimal parameters were as follows：ethanol volume fraction 90%， solid-to-liquid ratio 1∶17（g/mL）， extraction temperature 80 ℃， and extraction time 2.5 h. C21 steroidal glycosides yield of 23.56±0.432 mg/g was obtained under the optimized condition， which was consistent with the predicted value（23.79 mg/g）. 【Conclusion】 Optimization of the thermal circumfluence extraction by response surface methodology can effectively extract the C21 steroidal glycosides from C. auriculatum. The established regression model can be used for actual production forecasts.

Key words：Cynanchum auriculatum Royle ex Wight; C21 steroidal glycosides; thermal circumfluence extraction; single factor; response surface methodology; process optimization

收稿日期：2018-10-23

作者簡介：*為通訊作者，李春陽（1966-），博士，研究員，主要從事食品營養(yǎng)化學(xué)及農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)研究工作，E-mail：lichunyang968@126.com。許慧卿（1994-），研究方向為功能食品與活性物質(zhì)，E-mail：2017808092@njau.edu.cn

0 引言

【研究意義】濱海白首烏又名耳葉牛皮消（Cynanchum auriculatum Royle ex Wight），為蘿藦科鵝絨藤屬植物，是濱海的特色植物資源（張曉玲等，2006;陳亞等，2013）。濱海白首烏味甘、苦，性微溫，含有蛋白質(zhì)、淀粉、磷脂、游離氨基酸等多種營養(yǎng)成分（Sun et al.，2013;孫彥敏等，2015;方希修等，2016），并含有C21甾苷、多糖、苯酮等生物活性物質(zhì)（趙雪，2017;Qin et al.，2018）。藥理研究證實，白首烏具有抗氧化（宋俊梅等，2001）、護肝（尹家樂等，2007）、抗炎（張士俠等，2007a）、延緩衰老（張士俠等，2007b）、免疫調(diào)節(jié)（曾郁敏等，2009）及抗腫瘤（陳蔣麗等，2015）等功效。C21甾苷是目前白首烏中發(fā)現(xiàn)的最主要生物活性成分，但其在食品工業(yè)中的應(yīng)用較少，提取工藝的相關(guān)研究也不多，因此，優(yōu)化白首烏C21甾苷提取工藝，對促進其在食品領(lǐng)域中的開發(fā)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】在白首烏C21甾苷結(jié)構(gòu)和活性功能方面，Teng等（2011）從耳葉牛皮消中分離到Cyanoauriculoside A、B兩種新的C21甾苷單體;Liu等（2013）從耳葉牛皮消中分離獲得9種新型孕甾苷（Cyanoauriculoside A～Cyanoauriculoside I），并通過大鼠模型驗證其具有抑制食欲作用;王冬艷等（2015）通過建立實驗性高脂血癥大鼠模型，發(fā)現(xiàn)白首烏C21甾苷具有較好的調(diào)節(jié)血脂和改善肝臟脂肪變性作用;Qian等（2017）從耳葉牛皮消中分離鑒定出23種C21甾體糖苷，并證實其可顯著抑制H2O2引起的PC12細胞損傷。在白首烏C21甾苷提取方面，付文煥（2003）的研究結(jié)果表明熱回流法對白首烏總苷的提取率高于滲漉法，通過正交試驗優(yōu)化得到最佳熱回流提取工藝：10倍量95%乙醇回流提取3次，每次2 h;呂志敏等（2009）采用正交試驗對白首烏中C21甾苷超臨界CO2液體萃取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，確定萃取溫度、原料粒度和夾帶劑量對C21甾苷提取能力影響最大，得出最優(yōu)萃取條件：萃取壓力30 MPa、萃取時間90 min、萃取溫度55 ℃、原料粉碎粒度40目、夾帶劑量2.0 mL/g;宋康等（2010）對不同提取工藝下白首烏C21甾苷含量進行研究，確定常溫浸提獲得的C21甾苷含量最低，超聲提取次之，熱回流提取效果最佳;牟玲麗等（2011）以得率為考察指標(biāo)，通過正交試驗優(yōu)化得到白首烏C21甾苷提取最佳工藝：6倍量90%乙醇提取3次，每次1 h?！颈狙芯壳腥朦c】目前，研究者大多采用正交試驗優(yōu)化白首烏C21甾苷提取工藝，把乙醇體積分數(shù)、料液比、提取次數(shù)和提取時間作為單因素（付文煥，2003;牟玲麗等，2011），而將提取溫度考慮在內(nèi)，利用響應(yīng)面試驗?zāi)Ｐ蛢?yōu)化熱回流提取白首烏C21甾苷工藝的研究鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】以2年生濱海白首烏為試驗材料，在已有研究（付文煥，2003;牟玲麗等，2011;費洪榮等，2015）的基礎(chǔ)上增加溫度因素對白首烏C21甾苷提取量的影響，通過單因素試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化熱回流提取白首烏C21甾苷的工藝條件，為擴大白首烏甾苷在功能食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

2年生白首烏濱烏一號由鹽城市新洋農(nóng)業(yè)試驗站提供，無水乙醇、正丁醇和香蘭素等購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，告達亭標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物科技公司。主要儀器設(shè)備：Sigma 3K15離心機（德國Sigma公司）、萬能高速粉碎機[歐凱萊芙（香港）寶業(yè)公司]、AL104型電子天平[梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司]、RE52-A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）和752型紫外可見分光光度計（上海棱光技術(shù)有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 告達亭標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 配制1 mg/mL告達亭標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0.04、0.08、0.12、0.14、0.16、0.18和0.20 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液置于磨口具塞試管中，揮干溶劑后，加入0.5 mL 8.0%香草醛無水乙醇溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）;然后在冰水浴中加入5.0 mL 77%硫酸溶液，充分混合后，置于70 ℃水浴中加熱15 min，立即轉(zhuǎn)入冰水浴中冷卻15 min;室溫條件下放置30 min后，使用紫外可見分光光度計測定混合溶液在478 nm處吸光值（付文煥，2003）。以告達亭質(zhì)量濃度（x）對吸光值（y）進行線性回歸分析，得到回歸方程y=0.0173x+0.0292（R2=0.9991，線性范圍3.636～36.364 μg/mL）。

1. 2. 2 白首烏C21甾苷提取及含量測定 將2年生白首烏用組織搗碎機粉碎，過60目篩后得到白首烏粉，于-20 ℃保存。準(zhǔn)確稱取白首烏粉末5.0 g，按料液比1∶12（g/mL，下同）加入80%乙醇溶液于圓底燒瓶中，采用熱回流法，提取溫度70 ℃，提取1.5 h;提取液經(jīng)4500 r/min離心10 min并收集上清液，殘渣二次提取離心后，將2次所得上清液合并，并減壓濃縮至無醇味;將濃縮液補水至50.0 mL，用等體積的水飽和正丁醇萃取2次，收集正丁醇相并減壓蒸干，然后用無水乙醇溶解并定容至25.0 mL，精密吸取0.1 mL乙醇溶液，水浴揮干后測定甾苷含量（費洪榮等，2015），結(jié)果以每克白首烏（干重）中含有的C21甾苷質(zhì)量（告達亭當(dāng)量）計，單位為mg/g。

1. 2. 3 單因素試驗

1. 2. 3. 1 乙醇體積分數(shù)對白首烏C21甾苷提取量的影響 準(zhǔn)確稱取5份5.0 g白首烏粉末，分別加入60.0 mL不同體積分數(shù)（60%、70%、80%、90%和100%）的乙醇溶液，70 ℃下提取2 h，提取2次，測定C21甾苷提取量。

1. 2. 3. 2 料液比對白首烏C21甾苷提取量的影響 準(zhǔn)確稱取5份5.0 g白首烏粉末，分別按料液比1∶4、1∶8、1∶12、1∶16和1∶20加入80%乙醇溶液，70 ℃下提取2 h，提取2次，測定C21甾苷提取量。

1. 2. 3. 3 提取溫度對白首烏C21甾苷提取量的影響 準(zhǔn)確稱取5份5.0 g白首烏粉末，加入60.0 mL 80%乙醇溶液，分別在30、45、60、75和90 ℃下提取2 h，提取2次，測定C21甾苷提取量。

1. 2. 3. 4 提取時間對白首烏C21甾苷提取量的影響 準(zhǔn)確稱取5份5.0 g白首烏粉末，加入60.0 mL 80%乙醇溶液， 70 ℃下分別提取1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h，提取2次，測定C21甾苷提取量。

1. 2. 4 響應(yīng)面法優(yōu)化白首烏C21甾苷提取工藝 選擇乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度和提取時間為自變量，以白首烏C21甾苷提取量為考察指標(biāo)，設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗，各因素水平見表1。

1. 3 統(tǒng)計分析

試驗進行3次重復(fù)。采用SAS 9.3分析處理試驗數(shù)據(jù)，使用Design-Expert 8.0.6進行響應(yīng)面分析，Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單因素對白首烏C21甾苷提取量的影響

2. 1. 1 乙醇體積分數(shù)對提取量的影響 乙醇體積分數(shù)與溶液的極性和穿透性密切相關(guān)，因此能影響C21甾苷的提取效率。從圖1可看出，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，白首烏C21甾苷提取量變大，當(dāng)乙醇體積分數(shù)達90%時，白首烏C21甾苷提取量達最大值（17.54 mg/g），之后繼續(xù)增加乙醇體積分數(shù)，白首烏C21甾苷提取量略有下降。這可能是隨著乙醇體積分數(shù)增加，溶液極性逐漸降低，溶劑的穿透力逐漸增強，達90%時，具有提取C21甾苷相對最合適的極性，使得提取量最大;隨著乙醇體積分數(shù)進一步增加，一些醇溶性雜質(zhì)、親脂性強的成分溶出增多，進而減弱了溶劑對C21甾苷的提取效果。因此，最適乙醇體積分數(shù)為90%左右。

2. 1. 2 料液比對提取量的影響 原料浸提過程中擴散速度是決定提取效果的關(guān)鍵因素。擴散過程中擴散系數(shù)與濃度差呈正相關(guān)，確定料液比的實質(zhì)是選擇一個合適濃度差，從而得到好的提取效果。由圖2可知，料液比在1∶4～1∶16時，提取量隨料液比的減小而增大，料液比為1∶16的提取量達最大值（17.70 mg/g），此后繼續(xù)減小料液比，提取量反而降低。分析原因可能是當(dāng)料液比大于1∶16時，隨著提取溶劑體積的增大，濃度差加大，增強了擴散作用的推動力，使得C21甾苷浸出物增多;小于1∶16時由于溶劑用量過大導(dǎo)致濃縮能耗增加和回收困難，使得C21甾苷提取量有所下降。因此，最適料液比為1∶16左右。

2. 1. 3 提取溫度對提取量的影響 溫度主要通過影響可溶性成分的溶解度和擴散速度從而影響C21甾苷提取量。C21甾苷對熱穩(wěn)定，理論上溫度越高，擴散速度越快，可溶性成分的溶解度越高，C21甾苷浸出物會越多。由圖3可知，在30～75 ℃范圍內(nèi)，C21甾苷提取量隨著提取溫度的升高而增加，在75 ℃左右提取量達最大值（17.82 mg/g），之后繼續(xù)升高溫度至90 ℃時，C21甾苷提取量不再增加。溫度過高時，熱不穩(wěn)定成分或揮發(fā)性成分易分解或揮發(fā)，從而影響C21甾苷提取純度。因此，最適溫度在75 ℃左右。

2. 1. 4 提取時間對提取量的影響 由圖4可知，當(dāng)提取時間從1.0 h延長至2.5 h時，白首烏C21甾苷提取量由14.48 mg/g增加至17.56 mg/g，超過2.5 h后趨于平穩(wěn)。分析原因，可能是擴散值隨著提取時間的延長而增大，從而有利于浸提物析出，但提取時間越長，可溶性雜質(zhì)溶出也越多，從而影響后續(xù)測定。所以在浸提完全的前提下，需要盡可能地縮短提取時間。因此，最適提取時間在2.5 h左右。

2. 2 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果

2. 2. 1 二次回歸模型的建立 利用Design-Expert 8.0.6對響應(yīng)面結(jié)果（表2）進行分析，并建立二次回歸模型，擬合得到白首烏C21甾苷提取量與提取條件之間的二次多元回歸方程： Y=22.76+0.81A+0.85B+1.10C+1.44D+0.32AB–0.18AC+0.11AD+0.94BC+0.66BD+0.57CD–1.14A2–2.00B2–1.98C2–1.59D2。

2. 2. 2 回歸模型的顯著性分析結(jié)果 由表3可知，回歸模型P<0.0001，達極顯著水平;失擬項P=0.7545>0.05，不具有顯著性;R2=0.9733，R[2Adj]=0.9466，說明在97.33%的情況下，白首烏C21甾苷提取量隨各因素的變化可由建立的模型進行準(zhǔn)確預(yù)測?；貧w方程系數(shù)的方差分析表明，4個因素對白首烏C21甾苷提取量的影響排序為D（提取時間）>C（提取溫度）>B（料液比）>A（乙醇體積分數(shù)）。由P 可知，除交互項AB、AC和AD對白首烏C21甾苷提取量的影響不顯著（P>0.05，下同）外，其余項均達顯著（P<0.05，下同）或極顯著（P<0.01）水平。

2. 2. 3 兩因素間交互作用分析 響應(yīng)面試驗結(jié)果利用Design-Expert 8.0.6進行分析后，得到乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度和提取時間4個因素間交互作用的響應(yīng)面圖（圖5）。由圖5-D、圖5-E和圖5-F響應(yīng)面坡度較陡峭的趨勢可知，料液比、提取溫度和提取時間兩兩間的交互作用均對白首烏C21甾苷提取量有顯著影響。分析原因可能是料液比影響濃度差，進而改變擴散速度;同樣，提取溫度的改變會影響擴散效果;而提取時間延長，擴散值會越大，浸提效果越好，三者相輔相成。反之，由圖5-A、圖5-B和圖5-C的響應(yīng)面趨勢可知，乙醇體積分數(shù)與料液比、提取溫度和提取時間的交互作用對白首烏C21甾苷提取量均不顯著。響應(yīng)面分析結(jié)果與回歸模型的顯著性分析結(jié)果一致，說明結(jié)果可靠有效。

2. 2. 4 試驗結(jié)果驗證 由建立的回歸模型得到提取白首烏C21甾苷的最佳工藝參數(shù)：乙醇體積分數(shù)92.08%、料液比1∶16.85、提取溫度83.39 ℃、提取時間2.76 h，在上述工藝條件下提取2次，白首烏C21甾苷提取量為23.79 mg/g。根據(jù)實際情況，各參數(shù)調(diào)整為：乙醇體積分數(shù)90%、料液比1∶17、提取溫度80 ℃、提取時間2.5 h，在此條件下進行驗證，測得白首烏C21甾苷提取量為23.56±0.432 mg/g，與預(yù)測值相差較小，表明建立的回歸模型穩(wěn)定性和預(yù)測準(zhǔn)確性良好。

3 討論

C21甾苷的提取方法通常有滲漉法和熱回流法。由于滲漉法提取時間長、提取率低，因此目前主要采用熱回流法。付文煥（2003）研究得出白首烏C21甾苷的最佳熱回流提取工藝條件：95%乙醇、料液比1∶10、回流提取3次、每次2 h，在此條件下獲得白首烏C21甾苷含量16.5 mg/g;費洪榮等（2015）以泰山白首烏為原料，通過正交試驗優(yōu)化得到最佳提取工藝條件為8倍量95%乙醇回流提取2次，每次1.5 h，在此條件下泰山白首烏C21甾苷含量約3 mg/g。白首烏中C21甾苷含量隨栽培年限呈逐年升高趨勢（張鋒，2006），但栽培時間過長，也會造成栽培成本和栽培技術(shù)難度增加，故在本研究中，以2年生濱海白首烏為原料，并在前人研究（付文煥，2003;牟玲麗等，2011;費洪榮等，2015）基礎(chǔ)上考慮提取溫度對白首烏C21甾苷提取量的影響。通過單因素試驗發(fā)現(xiàn)，隨著提取溫度升高，物質(zhì)擴散速度加快，可溶性成分的溶解度升高，白首烏C21甾苷浸出物逐漸增加;但提取溫度過高時，熱不穩(wěn)定成分或揮發(fā)性成分易分解或揮發(fā)，從而影響提取出的白首烏C21甾苷純度，故將提取白首烏C21甾苷的適宜溫度范圍確定在70～90 ℃。然后通過設(shè)計響應(yīng)面試驗?zāi)Ｐ?，得出最?yōu)工藝水平：乙醇體積分數(shù)90%、料液比1∶17、提取溫度80 ℃、提取時間2.5 h，在此工藝下，測得白首烏C21甾苷含量為23.56±0.432 mg/g，與預(yù)測值相差較小?？梢?，由響應(yīng)面優(yōu)化得到的白首烏C21甾苷提取參數(shù)穩(wěn)定可靠。本研究獲得的白首烏C21甾苷提取量略高于付文煥（2003）的研究結(jié)果，究其原因，雖然研究材料均為濱海白首烏，但本研究的樣品為2年生白首烏，C21甾苷積累較1年生增多;且把提取溫度因素考慮在內(nèi)，提高了乙醇提取效果和C21甾苷的浸出率。相對于費洪榮等（2015）的研究結(jié)果差別明顯，可能是泰山白首烏中C21甾苷含量較少，或其采用的高氯酸比色法靈敏度不夠高導(dǎo)致檢測含量偏低。

現(xiàn)有研究大多通過正交試驗優(yōu)化白首烏C21甾苷提取工藝（付文煥，2003;費洪榮等，2015），但無法確定影響因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值，不能提供各影響因素的交互作用。本研究通過響應(yīng)面分析，既克服了正交試驗的局限性，得到單因素及兩兩因素間交互作用對白首烏C21甾苷提取量的影響，又能確保試驗值與理論值相差較小。4個因素及料液比與提取溫度、料液比與提取時間、提取溫度與提取時間的交互作用對白首烏C21甾苷提取量的影響顯著，各因素對白首烏C21甾苷提取量影響效果的排序為提取時間>提取溫度>料液比>乙醇體積分數(shù)，印證了將提取溫度這一因素考慮在內(nèi)的重要性。本研究優(yōu)化的白首烏C21甾苷提取工藝，為實現(xiàn)白首烏C21甾苷在食品工業(yè)中的開發(fā)利用提供了理論參考。

4 結(jié)論

通過響應(yīng)面試驗優(yōu)化的熱回流提取工藝（乙醇體積分數(shù)90%、料液比1∶17、提取溫度80 ℃、提取時間2.5 h）可有效提取白首烏C21甾苷，建立的回歸模型可用于實際生產(chǎn)預(yù)測。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）