雞胚成纖維細(xì)胞cDNA文庫構(gòu)建及其與禽呼腸孤病毒σA相互作用宿主蛋白的篩選

葉麗娜 謝芝勛 謝麗基 王盛 鄧顯文 謝志勤 范晴 黃嬌玲 曾婷婷 張艷芳 羅思思

摘要：【目的】構(gòu)建雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）的cDNA文庫并篩選與禽呼腸孤病毒（ARV）σA蛋白相互作用的宿主蛋白，為揭示互作蛋白對ARV復(fù)制及凋亡的分子調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎肨RIzol法提取CEF細(xì)胞總RNA，以SMART技術(shù)和LD-PCR合成雙鏈cDNA（ds cDNA），ds cDNA和pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建cDNA文庫;將pGBKT7-σA誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)至Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞中，并與構(gòu)建的cDNA文庫進(jìn)行酵母雙雜交篩選，篩選出的候選文庫菌經(jīng)質(zhì)粒提取后與pGBKT7-σA誘餌質(zhì)粒再共轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母菌，篩選出能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba固體培養(yǎng)基上生長且明顯變藍(lán)的菌落，最后提取藍(lán)色酵母菌質(zhì)粒進(jìn)行測序分析?！窘Y(jié)果】構(gòu)建的CEF細(xì)胞cDNA文庫庫容為1.6×106 CFU，文庫滴度為3.1×108 CFU/mL，插入片段大小集中在300～2000 bp，重組率為91.67%。以含有pGBKT7-σA的Y2HGold酵母菌與cDNA文庫酵母菌進(jìn)行雙雜交，陽性克隆能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba（SD/-4/X/A）固體培養(yǎng)基上長出菌落且明顯變藍(lán)，測序結(jié)果顯示共篩選出4個(gè)能與σA蛋白相互作用的宿主蛋白，分別是初期多肽相關(guān)復(fù)合體α亞基（NACA）、核苷二磷酸激酶2（NME2）、假定蛋白及線粒體核糖體蛋白S9（MRPS9）?！窘Y(jié)論】通過SMART技術(shù)構(gòu)建的CEF細(xì)胞cDNA文庫具有較好的庫容和滴度，且從cDNA文庫中篩選出4種與ARV σA蛋白相互作用的宿主蛋白，為后續(xù)研究互作蛋白對ARV復(fù)制及凋亡的分子調(diào)控機(jī)制提供了可靠數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞： 禽呼腸孤病毒;σA蛋白;cDNA文庫;互作蛋白;酵母雙雜交

中圖分類號： S852.657? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）06-1362-07

Abstract：【Objective】Construction of a cDNA library of chicken embryo fibroblasts（CEF） and screening for host proteins interacting with avian reovirus σA protein were conducted to lay a foundation for revealing the molecular regulation mechanism of interaction protein on ARV replication and apoptosis. 【Method】Extraction of CEF total RNA using TRIzol method was carried out， and double-strands cDNA（ds cDNA） was synthesized by SMART and LD-PCR technique. Co-transformation of ds cDNA with linearized pGADT7-Rec in competent Y187 yeast cells was realized， then cDNA library was established. The bait plasmid pGBKT7-σA was transformed into Y2HGold yeast competent cells，and yeast two-hybrid screening was conducted with the established cDNA library. The selected candidate library strain was extracted by plasmid， then co-transformed with bait plasmid pGBKT7-σAinto Y2HGold yeast cells. The colonies that grew well and could turn blue in solid media containing SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba were selected，then blue yeast plasmid was extracted for sequencing analysis. 【Result】The capacity of CEF cell cDNA library was 1.6×106 CFU， titer was 3.1×108 CFU/mL，the insert size was between 300 bp and 2000 bp， recombination rate was about 91.67%. Two-hybridization was carried out with Y2HGold yeast strain containing pGBKT7-σA and cDNA library yeast strain， and the po-sitive clone was able to grow colonieson the SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba（SD/-4/X/A） solid media and appeared blue. The sequencing results showed that four host proteins interacting with σA protein were screened， which were the initial polypeptide-related complex α subunit（NACA）， nucleoside diphosphate kinase 2（NME2）， putative protein and mitochondrial ribosomal protein S9（MRPS9）， respectively. 【Conclusion】The constructed CEF cDNA library by SMART technique has a good capacity and titer， and four host proteins interacting with ARV σA protein are screened from the cDNA library for further study of the molecular mechanisms interacting with ARV replication and apoptosis.

Key words： avian reovirus; σA protein; cDNA library; interacting proteion; yeast two-hybrid

收稿日期：2018-06-29

作者簡介：*為通訊作者，謝芝勛（1963-），研究員，主要從事動物傳染病防控技術(shù)研究工作，E-mail：xiezhixun@126.com。葉麗娜（1989-），主要從事動物傳染病分子生物學(xué)研究工作，E-mail：931997686@qq.com

0 引言

【研究意義】禽呼腸孤病毒（Avian reovirus，ARV）是家禽中普遍存在且具有免疫抑制作用的一種病毒，主要引起雞病毒性關(guān)節(jié)炎、矮小綜合征和呼吸道疾病等（韋平和秦愛建，2008;謝志勤等，2012），導(dǎo)致感染后的雛雞免疫器官發(fā)育不良（張昆麗等，2015a，2015b），對養(yǎng)禽業(yè)危害嚴(yán)重。σA蛋白為ARV的結(jié)構(gòu)蛋白，主要構(gòu)成其核衣殼，與病毒拮抗干擾素作用有關(guān)（González-López et al.，2003），通過降低感染雞群的免疫應(yīng)答能力而引起免疫抑制。σA蛋白還能激活PI3K/Akt信號通路，有利于ARV在宿主細(xì)胞內(nèi)感染復(fù)制（謝麗基等，2015）。此外，Yin等（2002）研究發(fā)現(xiàn)σA蛋白可將4種三磷酸核苷（NTP）水解成二磷酸核苷（NDP）或核苷酸（NMP）及游離磷酸，為病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄提供能量;Chiu等（2016）研究發(fā)現(xiàn)σA蛋白能進(jìn)入宿主細(xì)胞核內(nèi)，與細(xì)胞核內(nèi)蛋白發(fā)生結(jié)合;但至今尚未明確σA蛋白是與宿主細(xì)胞中的何種蛋白發(fā)生相互作用而最終誘導(dǎo)一系列生物學(xué)下游反應(yīng)。鑒于雞胚成纖維細(xì)胞（Chicken embryo fibroblasts，CEF）對ARV的易感性，且易于制備，通常將CEF細(xì)胞作為研究ARV的細(xì)胞模型（張昆麗等，2015a，2015b），因此，以CEF細(xì)胞為宿主細(xì)胞模型構(gòu)建cDNA文庫，并篩選與σA蛋白相互作用的宿主蛋白，對揭示σA蛋白的作用機(jī)理具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】CEF細(xì)胞來源方便、制備簡單，且表面有許多病毒受體，使其可成為很多病毒的體外宿主細(xì)胞，如研究馬立克氏病毒（MDV）、雞傳染性法氏囊病毒（IBDV）和雞新城疫病毒（NDV）等常見動物病毒時(shí)均首選CEF細(xì)胞作為宿主細(xì)胞（王友等，2013）。劉偉等（2007）運(yùn)用Gateway技術(shù)對CEF細(xì)胞mRNA進(jìn)行分離純化并反轉(zhuǎn)錄后連接Adapter，經(jīng)BP重組反應(yīng)及LR重組反應(yīng)后成功構(gòu)建獲得CEF細(xì)胞表達(dá)文庫，文庫庫容為5.5×106 CFU，文庫滴度為5×105 CFU/mL，為下一步研究IBDV致病機(jī)制打下基礎(chǔ)。張改平等（2008）也成功構(gòu)建了CEF細(xì)胞cDNA文庫，其庫容為8.8×105 CFU，可用于CEF細(xì)胞相關(guān)功能蛋白的研究。趙緒永等（2008）成功構(gòu)建了CEF細(xì)胞的cDNA T7噬菌體表達(dá)文庫，為篩選和研究CEF細(xì)胞上的病毒受體分子奠定了基礎(chǔ)。段志強(qiáng)等（2011）運(yùn)用SMART技術(shù)和LD-PCR將CEF細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA（ds cDNA）后轉(zhuǎn)化AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞，成功構(gòu)建獲得CEF細(xì)胞的cDNA文庫，文庫庫容為3×106 CFU。祁小樂等（2013）運(yùn)用SMART技術(shù)成功構(gòu)建了CEF細(xì)胞cDNA文庫，文庫滴度為6.94×107 CFU/mL，并證實(shí)該cDNA文庫可用于研究IBDV和NDV等禽病病毒與宿主蛋白的相互作用。此外，王建琳等（2017）利用CEF細(xì)胞研究NDV誘導(dǎo)雞TLR和Mx基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平，以期為揭示不同毒力NDV誘導(dǎo)IFN-I產(chǎn)生差異的作用機(jī)制提供參考依據(jù);劉煒瑋（2018）利用CEF細(xì)胞研究了NDV的復(fù)制機(jī)制及其與宿主的相互作用;王靜等（2018）利用CEF細(xì)胞揭示禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV）感染宿主的致瘤及免疫抑制機(jī)制?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】CEF細(xì)胞是研究病原體蛋白與宿主蛋白相互作用的首選宿主細(xì)胞，在NDV、IBDV等禽病病毒上已取得成功（李鐵強(qiáng)，2008;朱禮倩，2008;劉煒瑋，2018），但目前鮮見利用CEF細(xì)胞篩選與ARV σA蛋白相互作用宿主蛋白的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過SMART技術(shù)構(gòu)建CEF細(xì)胞cDNA文庫，并采用酵母雙雜交技術(shù)篩選出與ARV σA相互作用的宿主蛋白，為揭示互作蛋白對ARV復(fù)制及凋亡的分子調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

10日齡SPF雞胚購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司;氨芐青霉素（Amp+）、RNA提取試劑盒RNAiso Plus、Premix Ex Taq和RNA Loading Bu-ffer購自TaKaRa公司;質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Axygen公司;cDNA文庫構(gòu)建試劑盒、酵母菌質(zhì)粒提取試劑盒、Aureobasidin A（Aba）、X-α-gal及SD/Trp、SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His（SD/-4）等各種酵母培養(yǎng)基購自Clontech公司，其中Y187、Y2HGold、pGADT7-Rec和Carrier DNA為文庫構(gòu)建試劑盒自帶;參照盧恒等（2017）的方法構(gòu)建pGBKTA-σA誘餌質(zhì)粒;cDNA文庫鑒定引物T7（5'-TAATACGACTCA CTATAGGGC-3'）和3'AD（5'-AGATGGTGCACGAT GCACAG-3'）由深圳華大基因股份有限公司合成。

1. 2 CEF細(xì)胞制備

取10日齡SPF雞胚按常規(guī)方法制備CEF細(xì)胞（韋平和秦愛建，2008），置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21 h后提取細(xì)胞總RNA。

1. 3 CEF細(xì)胞總RNA提取及cDNA第一鏈合成

按照RNAiso Plus試劑盒說明提取細(xì)胞總RNA，然后用40.0 μL無RNA酶水溶解，紫外分光光度計(jì)測定總RNA濃度及OD260/OD280，取5.0 μL RNA并加入等體積RNA Loading Buffer，65 ℃作用10 min后以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測分析。按照cDNA文庫構(gòu)建試劑盒說明合成cDNA第一鏈。

1. 4 ds cDNA擴(kuò)增及純化

采用LD-PCR將cDNA第一鏈合成ds cDNA，反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序按照試劑盒說明進(jìn)行操作，選擇擴(kuò)增24個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后取7.0 μL LD-PCR產(chǎn)物，以1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，剩余LD-PCR產(chǎn)物經(jīng)CHROMA SPIN TE-400柱進(jìn)行純化。

1. 5 Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞制備

挑取30 ℃培養(yǎng)3 d的Y187酵母單菌落，接種于20.0 mL的YPDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600>1.5（約24 h），取菌液接種至100.0 mL新的YPDA液體培養(yǎng)基中，使菌液OD600為0.2～0.3，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6（4～5 h）。取100.0 mL菌液700×g離心5 min后用30.0 mL無菌去離子水重懸，700×g再離心5 min，用1.5 mL 1.1×TE/LiAC重懸菌體，12000 r/min離心15 s，再用600.0 μL 1.1×TE/LiAC重懸菌體，此菌體即為Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞。

1. 6 ds cDNA和pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化Y187酵母菌

取3 μg ds cDNA、6.0 μL pGADT7-Rec（0.5 μg/ μL）和20.0 μL Carrier DNA（經(jīng)熱變性處理），混均后加入到600.0 μL冰浴的Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞中，用15.0 mL 0.9% NaCl重懸菌體。取少量菌液，分別按1∶10和1∶100倍稀釋，兩個(gè)稀釋度的菌液各取100.0 μL涂布于100 mm的SD/-Leu培養(yǎng)基上，用于計(jì)算cDNA文庫庫容。剩余菌液涂布于100個(gè)150 mm的SD/-Leu培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d。

1. 7 文庫收集及滴度測定

將1.6中長出菌落的SD/-Leu培養(yǎng)基置于4 ℃冰箱中預(yù)冷4 h，用凍存液（含25%甘油的YPDA）和玻璃珠將培養(yǎng)基上的菌落洗下并收集，離心后將細(xì)菌濃度調(diào)至大于2×107 CFU/mL。取少量cDNA文庫進(jìn)行102、104和106倍稀釋，取100.0 μL稀釋后的菌液分別涂布于100 mm SD/-Leu培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并計(jì)算文庫滴度。文庫滴度（CFU/mL）=培養(yǎng)基菌落數(shù)/（涂板體積×稀釋倍數(shù)）。

1. 8 文庫插入片段鑒定

在SD/-Leu培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取24個(gè)單菌落，加200.0 μL PBS懸浮菌體，水浴鍋中煮沸10 min后進(jìn)行菌落PCR鑒定。采用pGADT7-Rec序列上的T7和3'AD引物擴(kuò)增目的片段，PCR反應(yīng)體系：Premix Ex Taq 12.5 μL，T7和3'AD引物（10 μmol/L）各1.0 μL，菌液1.0 μL，無菌去離子水9.5 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，鑒定文庫插入片段大小。

1. 9 誘餌菌株與文庫雜交

將pGBKTA-σA誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)至Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在SD/-Trp固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d后參照羅維玉等（2016）的方法進(jìn)行酵母雙雜交，挑選SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba（SD/-4/X/A）固體培養(yǎng)基上的藍(lán)色菌落，并接種至SD/-Trp/-Leu（SD/-2）固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3 d后按照酵母菌質(zhì)粒提取試劑盒說明提取質(zhì)粒。

1. 10 酵母質(zhì)粒提取及回轉(zhuǎn)驗(yàn)證

以1.9中提取獲得的候選文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100 ng/μL Amp+的LB培養(yǎng)基上，再挑取單菌落接種至含100 ng/μL Amp+的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并與pGBKT7-σA誘餌質(zhì)粒（各500 ng）共轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞，以pGBKT7-53和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化作為陽性對照，pGBKT7-Lam和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化作為陰性對照，涂布于SD/-4/X/A培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察酵母菌的生長情況。當(dāng)SD/-4/X/A培養(yǎng)基上長出菌落且明顯變藍(lán)時(shí)判為陽性，否則判為陰性。陽性候選酵母菌質(zhì)粒送至深圳華大基因股份有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 CEF細(xì)胞總RNA提取效果

提取的CEF細(xì)胞總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定，OD260/OD280為2.01，濃度為240 ng/μL，表明提取的總RNA純度較高。1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）顯示，CEF細(xì)胞總RNA富含兩條特異性條帶（28S和18S），小片段5S條帶也清晰可見。其中，28S∶18S約2∶1，表明提取的總RNA未發(fā)生降解，質(zhì)量良好，可用于后續(xù)的cDNA文庫構(gòu)建。

2. 2 ds cDNA合成與純化結(jié)果

LD-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果（圖2）顯示合成的ds cDNA呈彌散狀分布，表明不同豐度的mRNA均得到擴(kuò)增。純化后的ds cDNA經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)ds cDNA小片段大部分被去除，片段大小主要集中在500～2000 bp，即合成的ds cDNA片段長度適用于cDNA文庫構(gòu)建。

2. 3 文庫庫容及滴度測定結(jié)果

以ds cDNA和pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化的Y187酵母菌液經(jīng)1∶100倍稀釋培養(yǎng)3 d后，SD/-Leu培養(yǎng)基上有109個(gè)單菌落，文庫庫容1.6×106 CFU。收獲的cDNA文庫按102、104和106倍進(jìn)行稀釋，30 ℃培養(yǎng)3 d后發(fā)現(xiàn)106倍稀釋的培養(yǎng)基上有31個(gè)單菌落（圖4），計(jì)算得到該文庫滴度為3.1×108 CFU/mL。

2. 4 cDNA文庫插入片段鑒定結(jié)果

隨機(jī)挑取24個(gè)單菌落進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果（圖5）顯示，擴(kuò)增片段大小集中在300～2000 bp。24個(gè)克?。▎尉洌┲袃H有2個(gè)克隆未擴(kuò)增出目的條帶，重組率為91.67%，表明構(gòu)建的cDNA文庫質(zhì)量較好，可用于后續(xù)的酵母雙雜交試驗(yàn)。

2. 5 酵母菌回轉(zhuǎn)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

以含有pGBKT7-σA的Y2HGold酵母菌與cDNA文庫酵母菌進(jìn)行雙雜交，然后篩選SD-/Trp/-Leu/- Ade/-His/X-α-Gal/Aba（SD/-4/X/A）固體培養(yǎng)基上的藍(lán)色菌落進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗(yàn)證試驗(yàn)，回轉(zhuǎn)驗(yàn)證結(jié)果如圖6所示。陽性對照和陽性克隆均長出菌落且明顯變藍(lán)，而陰性對照未長出菌落。

2. 6 與σA蛋白相互作用的陽性克隆測序結(jié)果

將陽性克隆質(zhì)粒送至深圳華大基因股份有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對分析，結(jié)果得到4個(gè)與σA蛋白相互作用蛋白的編碼基因，對應(yīng)的編碼蛋白（表1）分別為初期多肽相關(guān)復(fù)合體α亞基（NACA）、核苷二磷酸激酶2（NME2）、假定蛋白及線粒體核糖體蛋白S9（MRPS9）。

3 討論

cDNA文庫最早由Hofstetter于1976年成功構(gòu)建獲得，最傳統(tǒng)的方法是將反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增獲得的cDNA酶切后與雙酶切的質(zhì)粒載體連接，但這種方法存在連接效率低、難以擴(kuò)增、文庫cDNA片段較小等缺點(diǎn)（晏慧君等，2006）。近年來，cDNA文庫構(gòu)建技術(shù)在不斷完善，最常用技術(shù)是美國Clontech公司的SMART技術(shù)及美國Invitrogen公司的GeneRace試劑盒。酵母雙雜交技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于蛋白相互作用的研究領(lǐng)域，尤其是病原體蛋白與宿主蛋白相互作用方面，為揭示動物病原分子致病機(jī)制、篩選疾病分子標(biāo)志物和藥物靶位、研發(fā)新藥和疫苗提供了技術(shù)保障（譚偉等，2014）。美國Clontech公司研發(fā)的Matchmaker雙雜交系統(tǒng)不僅提供構(gòu)建全長cNDA文庫的SMART技術(shù)，還提供構(gòu)建cDNA文庫、評判cDNA文庫質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等一系列詳細(xì)的技術(shù)服務(wù)。本研究將ds cDNA與pGADT7-Rec表達(dá)載體通過同源重組直接連接后共轉(zhuǎn)化Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞，與傳統(tǒng)方法將cDNA和載體酶切后連接再轉(zhuǎn)入細(xì)胞中的繁瑣步驟相比，該方法更快速簡便。在利用美國Clontech公司SMART技術(shù)構(gòu)建CEF細(xì)胞cDNA文庫的過程中，細(xì)胞RNA的質(zhì)量決定了cDNA文庫質(zhì)量。用于cDNA合成的RNA既可是總RNA也可是mRNA，本研究選擇總RNA合成cDNA第一鏈，減少了RNA在純化過程中的降解（28S∶18S約2∶1），有效保證了cDNA文庫的完整性，構(gòu)建的CEF細(xì)胞cDNA文庫庫容為1.6×106 CFU（大于最低要求的1.0×106 CFU），文庫滴度為3.1×108 CFU/mL（大于最低要求的2.0×107 CFU/mL），文庫插入片段大小主要集中在300～2000 bp，均滿足酵母雙雜交試驗(yàn)建庫要求。

將成功構(gòu)建的cDNA文庫與pGBKT7-σA誘餌質(zhì)粒進(jìn)行酵母雙雜交，共篩選出4種互作蛋白，分別為初期多肽相關(guān)復(fù)合體α亞基（NACA）、核苷二磷酸激酶2（NME2）、假定蛋白及線粒體核糖體蛋白S9（MRPS9）。初期多肽相關(guān)復(fù)合體（NAC）是新生肽鏈從核糖體上延伸出來第一個(gè)接觸的胞質(zhì)因子，由α和β兩個(gè)亞基組成，其中NACA主要在轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中發(fā)揮作用，包括激活骨鈣素基因、與輔激活類蛋白相互作用、調(diào)控FADD（一種死亡結(jié)構(gòu)域蛋白）等一系列功能，且在病毒性疾病中NACA能通過與病毒蛋白相互作用，導(dǎo)致機(jī)體功能紊亂（劉嬌玲等，2015）。核苷二磷酸激酶（NDPK）可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育和凋亡，還參與細(xì)胞的內(nèi)吞（熊盛等，2006）。假定蛋白是一種功能尚未明確的蛋白，其功能有待進(jìn)一步研究。核糖體蛋白S9（RPS9）廣泛存在于酵母菌、細(xì)菌、寄生蟲和哺乳動物的細(xì)胞中，Kim等（2003）研究證實(shí)RPS9與細(xì)胞凋亡相關(guān)，Lindstr?m和Nistér（2010）也研究發(fā)現(xiàn)RPS9能激活p53通路，而p53通路與細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究采用酵母雙雜交技術(shù)從構(gòu)建的CEF細(xì)胞cDNA文庫中篩選出4種與ARV σA蛋白相互作用的宿主蛋白，可為后期研究互作蛋白對ARV復(fù)制及凋亡的分子調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

通過SMART技術(shù)構(gòu)建的CEF細(xì)胞cDNA文庫具有較好的庫容和滴度，且從cDNA文庫中篩選出4種與ARV σA相互作用的宿主蛋白，為后續(xù)研究互作蛋白對ARV復(fù)制及凋亡的分子調(diào)控機(jī)制提供了可靠數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）