啶氧菌酯降解菌的分離鑒定及其降解特性研究

祝騰輝 羅香文 李聰 張德詠 劉勇

摘要：【目的】篩選可高效降解啶氧菌酯的微生物資源，并研究其降解特性，為啶氧菌酯等甲氧基丙烯酸酯類農(nóng)藥殘留的微生物修復(fù)提供新資源?！痉椒ā坎捎酶患囵B(yǎng)法分離啶氧菌酯降解菌，以生理生化特征結(jié)合16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定降解菌;利用氣相色譜儀（HPLC）測(cè)定啶氧菌酯殘留量，分析其降解特性;采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GCMS）測(cè)定降解菌降解啶氧菌酯的中間代謝產(chǎn)物，分析降解菌降解啶氧菌酯的代謝途徑?！窘Y(jié)果】分離獲得一株能以啶氧菌酯為唯一碳源的降解菌株（PY3），其生理生化特征結(jié)合16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，PY3菌株屬沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）。PY3菌株最佳生長(zhǎng)條件測(cè)定和降解特性分析結(jié)果表明，PY3菌株生長(zhǎng)和降解啶氧菌酯的最佳條件為pH 6.0、35 ℃，在最佳降解條件下培養(yǎng)11 d，對(duì)50 mg/L啶氧菌酯的降解率可達(dá)72.0%。PY3菌株降解啶氧菌酯的途徑包括苯環(huán)和N雜環(huán)間氧橋鍵斷裂后酯化，以及苯環(huán)和N雜環(huán)開環(huán)反應(yīng)。【結(jié)論】沼澤紅假單胞菌PY3菌株具有高效降解啶氧菌酯的活性和較廣的pH和溫度耐受性，且具有應(yīng)用于農(nóng)田生態(tài)環(huán)境中啶氧菌酯等甲氧基丙烯酸酯類農(nóng)藥殘留物微生物修復(fù)的潛力。

關(guān)鍵詞： 啶氧菌酯;分離;鑒定;沼澤紅假單胞菌;降解特性

中圖分類號(hào)： S481.8;X592? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）06-1256-07

Abstract：【Objective】The microorganisms which could effectively degrade picoxystrobin were selected and their degrading characteristics were analyzed. It would provide new resources for microbial remediation of methoxy acrylates pesticide residue such as picoxystrobin. 【Method】Picoxystrobin degrading strains were isolated by enrichment culture， and the degrading strains were analyzed and identified through physiological， biochemical characteristics and phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences. Residue of picoxystrobin was quantified by gas chromatograph（HPLC）， and the degrading characteristics were also studied. Metabolics of picoxystrobin in degrading process were identified by gas chromatograph-mass spectrometer（GCMS）， and metabolic pathways of degrading process of the strain on picoxystrobin were analyzed. 【Result】A degrading strain PY3 which took picoxystrobin as the only carbon source was isolated. Physiological， biochemical characteristics and phylogenetic analysis of 16S rRNA sequences indicated that strain PY3 was Rhodopseudomonas palustris. The optical growth and degrading picoxystrobin conditions of strain PY3 were pH 6.0 and 35 ℃. Under the optimal degradation conditions， up to 72.0% of 50 mg/L picoxystrobin could be degraded by strain PY3 in 11 d. Metabolic pathways of picoxystrobin degraded by strain PY3 included oxygen bridge bond between benzene ring and N-containing heterocyclic ring braking and ring-opening reaction of benzene ring and N-containing heterocyclic ring. 【Conclusion】R. palustris PY3 has excellent picoxystrobin degradation capacity and broad pH and temperature tolerance. It can be applied to repair of methoxy acrylates pesticide residues such as picoxystrobin in field eco-environment.

Key words： picoxystrobin; isolation; identification; Rhodopseudomonas palustris; degrading characteristics

收稿日期：2018-12-19

作者簡(jiǎn)介：*為通訊作者，劉勇（1966-），博士，研究員，主要從事植物病害綜合防控技術(shù)研究工作，E-mail：haoasliu@163.com。祝騰輝（1993-），研究方向?yàn)檗r(nóng)藥殘留微生物修復(fù)，E-mail：1039711761@qq.com

0 引言

【研究意義】啶氧菌酯是一種高效甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，其作用機(jī)理是通過(guò)抑制病原菌細(xì)胞色素b和C1間的電子轉(zhuǎn)移，從而抑制線粒體的呼吸作用，即線粒體呼吸抑制劑（Guan et al.，2011）。啶氧菌酯的內(nèi)吸活性很強(qiáng)，對(duì)銹病和葉斑病具有優(yōu)異的防控效果（趙平等，2011）。目前，啶氧菌酯在我國(guó)的登記范圍正逐步擴(kuò)大，已登記用于水稻稻曲病等病害的防控（阮宏椿等，2013）。隨著啶氧菌酯應(yīng)用范圍的擴(kuò)展和使用量的上升，其對(duì)環(huán)境中非靶標(biāo)的潛在毒性及生態(tài)環(huán)境安全風(fēng)險(xiǎn)成為業(yè)界關(guān)注的熱點(diǎn)。最新研究表明，啶氧菌酯對(duì)非靶標(biāo)生物蚯蚓具有中等毒性（Wang et al.，2012）;高劑量啶氧菌酯對(duì)家蠶具有記性毒性和發(fā)育毒性（謝道燕等，2014）。除了對(duì)非靶標(biāo)具有急性毒性外，更嚴(yán)重的是，長(zhǎng)期暴露下啶氧菌酯對(duì)非靶標(biāo)生物還具有潛在的慢性毒性。啶氧菌酯對(duì)蟾蜍蝌蚪具有致畸性，48 h的半致畸性濃度低至61.00～84.13 μg/L（Li et al.，2016）。但啶氧菌酯對(duì)非靶標(biāo)的慢性毒性機(jī)制目前尚不明確，因此，啶氧菌酯殘留的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，以及如何消除啶氧菌酯在農(nóng)田生態(tài)環(huán)境中的殘留污染已成為當(dāng)前急需解決的環(huán)境問(wèn)題。【前人研究進(jìn)展】在自然環(huán)境中，甲氧基丙烯酸酯類農(nóng)藥的降解方式主要有光分解、水解和微生物分解等（孫建光等，2008）。關(guān)于甲氧基丙烯酸酯類農(nóng)藥的微生物降解研究中，Hocinatab和Boudemagha（2016）從活性淤泥中篩選到可高效降解多種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的芽孢桿菌屬（Bacillus）菌株。Wo?ejko等（2016）從土壤中篩選到能夠降解啶氧菌酯及其他多種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的復(fù)合微生物菌群，從復(fù)合微生物菌群中還篩選獲得一株高效降解酵母菌;相比復(fù)合微生物菌群，單個(gè)微生物菌株的降解效率更高。此外，采用選擇性培養(yǎng)基篩選到的降解菌還包括假單胞菌屬（Pseudomonas）和蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）等，這些降解菌均能降解包括啶氧菌酯在內(nèi)的多種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑（Howell et al.，2014）。深入的降解機(jī)理研究表明，啶氧菌酯微生物降解的初始步驟為酯鍵斷裂，相應(yīng)的降解酶基因鑒定為甲氧基丙烯酸酯甲基酯酶基因（Clinton et al.，2011）;吳龍飛等（2016）研究也得到相似的結(jié)果，紅假單胞菌降解啶氧菌酯的初始步驟為斷裂其酯鍵。然而，啶氧菌酯降解初始步驟之后的降解步驟尚需進(jìn)一步探究。【本研究切入點(diǎn)】已報(bào)道許多降解菌資源本身可能具有環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，如假單胞菌屬降解菌的生物安全性需進(jìn)一步試驗(yàn)研究，才能應(yīng)用于啶氧菌酯污染的生物修復(fù)。因此，篩選更多優(yōu)異的降解菌資源，將有助于啶氧菌酯等甲氧基丙烯酸酯類農(nóng)藥微生物修復(fù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。此外，對(duì)啶氧菌酯降解初始步驟之后的代謝產(chǎn)物目前研究較少，限制了降解微生物應(yīng)用的環(huán)境安全性分析?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用富集培養(yǎng)法篩選能以啶氧菌酯為唯一碳源的啶氧菌酯降解菌，以生理生化特征結(jié)合16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定降解菌;利用高效液相色譜儀（HPLC）測(cè)定啶氧菌酯殘留量，分析降解菌的降解特性;采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GCMS）測(cè)定降解菌降解啶氧菌酯的中間代謝產(chǎn)物，分析降解菌降解啶氧菌酯的代謝途徑，為農(nóng)田啶氧菌酯殘留的微生物修復(fù)提供新資源。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 主要培養(yǎng)基 篩選和分離培養(yǎng)基（無(wú)碳源MSM培養(yǎng)基）：NH4NO3 1.0 g/L、NaCl 0.5 g/L、（NH4）2SO4 0.5 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、K2HPO4 1.5 g/L、pH 7.0;選擇培養(yǎng)基：在MSM培養(yǎng)基（無(wú)碳源）中分別加入質(zhì)量濃度為50、100和150 mg/L的啶氧菌酯;相應(yīng)的固體培養(yǎng)基為對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中添加1.5%瓊脂糖。

1. 1. 2 主要試劑及儀器設(shè)備 啶氧菌酯原藥（有效成分含量96%，武漢鴻?？翟噭┯邢薰荆?農(nóng)藥殘留萃取及檢測(cè)所用試劑均為色譜純。HPLC（e2695，Waters，美國(guó)），GCMS（Agilent 6890N，美國(guó)）。

1. 2 啶氧菌酯降解菌富集培養(yǎng)及分離純化

從位于湖南長(zhǎng)沙縣春華基地農(nóng)田排水渠采集底泥，取2.0 g底泥添加到120 mL的MSM培養(yǎng)基中，并添加啶氧菌酯使其終濃度為50 mg/L，于35 ℃、3000 lx光照培養(yǎng)至渾濁或有明顯顏色變化，取0.5%菌液接種至終濃度為100 mg/L啶氧菌酯的MSM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同上，重復(fù)以上步驟至啶氧菌酯濃度為150 mg/L。使用終濃度為150 mg/L啶氧菌酯的雙層MSM固體培養(yǎng)基，劃線法分離降解菌。挑取形態(tài)不同的菌落至含150 mg/L啶氧菌酯的MSM液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌液濃度為109 CFU/mL，作為后續(xù)試驗(yàn)的接種液。

1. 3 分離菌株鑒定

1. 3. 1 生理生化特征鑒定 分離菌株的生理生化特征鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定》（蔡妙英和東秀珠，2001）。

1. 3. 2 分離菌株活細(xì)胞吸收光譜測(cè)定 低速離心分離菌株培養(yǎng)液，取沉淀用0.9%生理鹽水洗滌3次，然后用0.9%生理鹽水重懸浮，用分光光度計(jì)測(cè)定分離菌株細(xì)胞在波長(zhǎng)300～900 nm的吸收值。

1. 3. 3 分離菌株16S rRNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析 采用CTAB法提取分離菌株基因組DNA;以細(xì)菌總DNA為模板，用細(xì)菌16S rRNA序列通用引物（27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAg-3';1492R：5'-

GGTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（20.0 μL）：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（10 μmol/L）0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA聚合酶 0.5 μL，ddH2O 15.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃ 50 s，52 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收目的條帶，參照全式金至pEASY-T1 Cloning Kit使用說(shuō)明將目的片段連接gcffpEASY-T1克隆載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性菌落送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。所得基因序列在GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。運(yùn)用ClastW進(jìn)行序列聯(lián)配分析，采用MEGA 7.0構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 4 分離菌株最佳生長(zhǎng)條件測(cè)定

在120 mL的MSM培養(yǎng)基（pH 7.0）中，接種0.5%的分離菌菌液，分別置于15、25、35、45和50 ℃下進(jìn)行光照培養(yǎng)，5 d后測(cè)定菌液在波長(zhǎng)660 nm處的吸光值。分別在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的MSM培養(yǎng)基中接種0.5%的分離菌菌液，35 ℃下光照培養(yǎng)，5 d后測(cè)定菌液在波長(zhǎng)660 nm處的吸光值。每處理3個(gè)重復(fù)。

1. 5 不同初始條件啶氧菌酯降解試驗(yàn)

于120 mL的MSM培養(yǎng)基（pH 7.0）中添加啶氧菌酯至終濃度為50 mg/L，再接種0.5%的分離菌菌液，分別于15、25、35、45和50 ℃光照條件下培養(yǎng)，5 d后萃取啶氧菌酯，采用HPLC檢測(cè)啶氧菌酯殘留量。分別在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的MSM培養(yǎng)基中接種0.5%的分離菌菌液，然后添加啶氧菌酯至終濃度為50 mg/L，35 ℃光照條件下培養(yǎng)，5 d后萃取啶氧菌酯，采用HPLC檢測(cè)啶氧菌酯殘留量。每處理3個(gè)重復(fù)。

1. 6 啶氧菌酯最佳條件下降解動(dòng)態(tài)

于MSM培養(yǎng)基（pH 7.0）中接種0.5%分離菌菌液，添加啶氧菌酯至終濃度為50 mg/L，35 ℃光照條件下培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)1、3、5、7、9 和11 d取樣，采用HPLC檢測(cè)啶氧菌酯殘留量。

1. 7 啶氧菌酯殘留量測(cè)定

采用正己烷萃取凈化啶氧菌酯，HPLC測(cè)定啶氧菌酯殘留量（羅香文等，2016）。柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm，上樣量10 μL，流速1 mL/min，流動(dòng)相30∶70=水∶乙腈。以啶氧菌酯標(biāo)準(zhǔn)品定性定量，所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

1. 8 啶氧菌酯降解中間代謝產(chǎn)物測(cè)定

定期取樣，采用正己烷萃取中間代謝產(chǎn)物，用GCMS進(jìn)行掃描鑒定（吳龍飛等，2016）。儀器鑒定條件：色譜柱為HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;采用全掃描方式，質(zhì)量范圍50～550 eV;電子轟擊能70 eV;進(jìn)樣口溫度220 ℃，氦氣流量1.0 mL/min。升溫程序：初始溫度120 ℃，保持3 min，以10 ℃/min的速度升溫至200 ℃，再以5 ℃/min速度升溫，終止溫度250 ℃，保持5 min;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃。

2 結(jié)果與分析

2. 1 菌株的分離和鑒定結(jié)果

2. 1. 1 菌株分離及形態(tài)和生理生化特征 采用啶氧菌酯為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基篩選獲得一株菌落為紅色的菌株，命名為PY3。革蘭氏染色結(jié)果顯示，PY3菌株為革蘭氏陰性、短桿狀;生理生化鑒定結(jié)果顯示，PY3菌株的甲基紅反應(yīng)和V-P反應(yīng)呈陰性，檸檬酸鹽反應(yīng)和過(guò)氧化氫酶反應(yīng)呈陽(yáng)性，吲哚試驗(yàn)呈陰性，不能水解淀粉。

2. 1. 2 菌體色素掃描結(jié)果 PY3菌株菌體色素掃描結(jié)果如圖1所示，菌體色素在波長(zhǎng)360、590、820和880 nm處有明顯的吸收峰，表明PY3菌株的菌體中存在類胡蘿卜素和菌綠素（Yin et al.，2012）。

2. 1. 3 PY3菌株16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析? PY3菌株測(cè)定獲得的16S rRNA序列長(zhǎng)度為1374 bp（GenBank登錄號(hào)MH997434），與沼澤紅假單胞菌（KF926677）的同源性最高，達(dá)100%。進(jìn)一步的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果（圖2）表明，PY3菌株與Rhodopseudomonas palustris（KF926677）的親緣關(guān)系較近，聚為一個(gè)亞簇。

2. 2 PY3菌株最佳生長(zhǎng)條件測(cè)定結(jié)果

PY3菌株在不同pH和溫度條件下的生長(zhǎng)結(jié)果（圖3和圖4）表明，PY3菌株在25～35 ℃、pH 6～8內(nèi)生長(zhǎng)良好，其最佳生長(zhǎng)條件為pH 6、35 ℃。

2. 3 PY3菌株的降解特性

2. 4 最適條件下啶氧菌酯降解動(dòng)態(tài)

如圖5所示，在最佳降解條件下（pH 6、35 ℃）培養(yǎng)1～5 d時(shí)，PY3菌株的生物量累積較慢，其降解啶氧菌酯的效率較低;培養(yǎng)7 d后，隨PY3菌株的生物量快速增加，其降解啶氧菌酯的效率快速上升;培養(yǎng)11 d時(shí)，接種PY3菌株處理的啶氧菌酯殘留量為12 mg/L，降解率為72%。

2. 5 PY3菌株降解啶氧菌酯的機(jī)制

2. 5. 1 PY3菌株降解啶氧菌酯中間代謝產(chǎn)物分析 采用GCMS掃描鑒定PY3菌株降解啶氧菌酯的中間代謝產(chǎn)物，結(jié)果（圖6）顯示，培養(yǎng)1 d時(shí)，啶氧菌酯快速降解為中間產(chǎn)物峰2，隨后中間產(chǎn)物峰2快速降解，產(chǎn)生中間產(chǎn)物峰3和峰4;與培養(yǎng)1 d相比，培養(yǎng)5 d時(shí)啶氧菌酯的殘留量下降約20%（峰1）。培養(yǎng)5 d時(shí)，GSMS掃描圖上有一些峰的豐度上升，表明這些中間代謝產(chǎn)物的生成量上升。

譜庫(kù)檢索結(jié)果（圖7～圖9）表明，PY3菌株降解啶氧菌酯的中間產(chǎn)物分別為：啶氧菌酯（峰1）、9，12，15-Octadecatrienoic acid（保留時(shí)間10.9363 min，峰2）、Dibutyl phthalate（保留時(shí)間8.711 min，峰3）和3，4-Methylene dioxy-β-nitrostyrene（保留時(shí)間9.902 min，峰4）。

2. 5. 2 推導(dǎo)的降解途徑 依據(jù)GCMS鑒定的中間代謝產(chǎn)物，PY3菌株降解啶氧菌酯推導(dǎo)的降解途徑包括苯環(huán)和N雜環(huán)間氧橋鍵斷裂后酯化，生成產(chǎn)物A;苯環(huán)和N雜環(huán)開環(huán)反應(yīng)，產(chǎn)生中間代謝B和C;中間產(chǎn)物A也可能降解為產(chǎn)物C（圖10）。

3 討論

啶氧菌酯是甲氧基丙烯酸酯類殺蟲劑，目前在我國(guó)的登記范圍和使用量正逐步上升（趙平等，2011），而殘留于農(nóng)田生態(tài)環(huán)境中的啶氧菌酯量也隨之增加，其對(duì)生態(tài)環(huán)境的潛在威脅日益成為業(yè)界關(guān)注的熱點(diǎn)。本研究利用富集培養(yǎng)法分離到一株能以啶氧菌酯為唯一碳源生長(zhǎng)的PY3菌株，鑒定為沼澤紅假單胞菌（R. palustris）。沼澤紅假單胞菌是典型的光合細(xì)菌，現(xiàn)有研究表明，光合細(xì)菌是一類益生菌，在農(nóng)業(yè)部微生物肥料登記的微生物分類中被定義為A.1菌株，無(wú)需進(jìn)行毒理學(xué)試驗(yàn)。光合細(xì)菌在環(huán)境污染物（Haritash and Kaushik，2009）和殺蟲劑（Luo et al.，2018）等修復(fù)方面具有較好的應(yīng)用前景。

本研究結(jié)果表明，PY3菌株生長(zhǎng)和降解啶氧菌酯具有較好的pH和溫度耐受性，與已報(bào)道的降解菌降解特性類似（Howell et al.，2014; Hocinatab and Boudemagha，2016;Wo?ejko et al.，2016;李兵和張博，2017），表明該菌株具有較好的環(huán)境適應(yīng)性，具有應(yīng)用于我國(guó)大部分地區(qū)農(nóng)田生態(tài)環(huán)境中啶氧菌酯殘留微生物修復(fù)的潛力。

對(duì)甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的降解機(jī)理研究表明，微生物降解甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的基因?yàn)榧籽趸┧狨ゼ谆ッ富颍⊿trobilurin me-thyl esterase），酯化啶氧菌酯的-O-鍵（Clinton et al.，2011）。吳龍飛等（2016）研究表明，紅假單胞菌PID-1降解啶氧菌酯的降解途徑包含啶氧菌酯的-O-鍵斷裂和苯環(huán)測(cè)鏈氧化，以及苯環(huán)開環(huán)反應(yīng)等降解步驟。本研究中，PY3菌株降解啶氧菌酯的降解途徑除酯化啶氧菌酯的-O-鍵外，還能將啶氧菌酯的N雜環(huán)打開，表明PY3菌株可能編碼降解啶氧菌酯的新基因，這些新降解基因的克隆與定性研究將是下一步的研究重點(diǎn)，其研究結(jié)果有助于解析PY3菌株降解啶氧菌酯的機(jī)制，也為構(gòu)建高效降解甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留物的工程菌提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

運(yùn)用富集培養(yǎng)法分離到一株能以啶氧菌酯為唯一碳源生長(zhǎng)的光合細(xì)菌PY3菌株，鑒定為沼澤紅假單胞菌。PY3菌株具有高效降解啶氧菌酯的活性和較廣的pH和溫度耐受性，且具有應(yīng)用于農(nóng)田生態(tài)環(huán)境中啶氧菌酯等甲氧基丙烯酸酯類農(nóng)藥殘留物微生物修復(fù)的潛力。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）