正交試驗法優(yōu)選康痔栓的醇沉工藝

王永林 尚榮國 李康樂 竇建衛(wèi)

摘要 目的：通過正交試驗篩選康痔栓的醇沉最佳工藝。方法：采用正交試驗，以含醇量、藥液相對密度、靜置時間為考察因素，以鹽酸小檗堿含量和出膏率為考察指標(biāo)，優(yōu)選醇沉工藝。結(jié)果：康痔栓的最佳醇沉工藝條件為：含醇量為60%，藥液相對密度為1.10～1.20，靜置時間24 h。結(jié)論：通過正交實驗優(yōu)選的康痔栓的醇沉工藝，確定了康痔栓的生產(chǎn)工藝合理、科學(xué)、可行。

關(guān)鍵詞 康痔栓;生產(chǎn)工藝;正交試驗;出膏率;鹽酸小檗堿;高效液相色譜法;驗證試驗;工藝條件

Abstract Objective：To select the optimal alcohol precipitation of Kangzhi suppository by orthogonal test.Methods：The alcohol precipitation was optimized by orthogonal test using alcohol concentration，relative density and standing time as factors，with Berberine Hydrochloride and paste-forming rate as examining indexes.Results：The optimal conditions were as follows，alcohol concentration was 60%，relative density was 1.10-1.20 and standing time was 24 h.Conclusion：The optimized alcohol precipitation process of kangzhi suppository by orthogonal test determined that the productive technology was reasonable，scientific and feasible.

Key Words Kangzhi suppository; Productive technology; Orthogonal test; Paste-forming rate; Berberine hydrochloride; HPLC; Verification test; Process conditions

中圖分類號：R284文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.06.007

痔瘡是一種目前發(fā)病率較高的疾病[1]，痔瘡是人體直腸末端黏膜下和肛管皮膚下靜脈叢發(fā)生擴(kuò)張和屈曲所形成的柔軟靜脈團(tuán)，稱為痔，又名痔核、痔病、痔疾等。由于現(xiàn)代社會節(jié)奏較快，許多人精神一直處于緊張狀態(tài);同時伴隨著生活水平的逐步提高，攝入的食物越來越精細(xì)，蛋白質(zhì)、脂肪等的含量提高，這種生活方式造成飲食不合理;同時一些不好習(xí)慣使的排便時間延長，由于工作等的緣故長時間保持一種狀態(tài)使肛墊中血管回流受阻從而出現(xiàn)瘀血或擴(kuò)張，衛(wèi)生意識淡薄造成肛周不潔等，都是直接或間接導(dǎo)致發(fā)病的原因。目前手術(shù)與藥物是治療痔瘡的主要方式。但手術(shù)容易引起并發(fā)癥，且周期較長，給患者帶來的痛苦較大[2-4]，因此，藥物治療是一種較為理想的治療方式。

中醫(yī)認(rèn)為痔的病因病機(jī)主要有飲食不節(jié)，過食辛辣，久坐負(fù)重，致濕熱、燥熱內(nèi)生入里化熱，下注大腸;或經(jīng)絡(luò)瘀滯等滯于肛門而發(fā)為痔?！夺t(yī)宗金鑒》曰;“久瀉久痢而生痔者”，久瀉久痢故脾氣虧虛，肺氣亦虛，致大腸之氣不足，故氣血流注，濕濁聚于肛門發(fā)為痔。因此對痔瘡治療多主張清熱解毒，涼血祛瘀。

康痔栓處方由黃柏、黃芩、大薊、白及、當(dāng)歸、冰片、雷公藤等組成。具備清熱除濕解毒，活血化瘀止痛，涼血消腫止血等功效，臨床用于治療內(nèi)痔、混合痔濕熱壅滯證。在必康制藥科研基金的資助下，為探討其最佳生產(chǎn)工藝，本實驗采用正交實驗法[5-6]，以鹽酸小檗堿與出膏率為指標(biāo)，篩選醇沉的最佳生產(chǎn)工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 電子天平（日本島津，型號：AUY120）;超聲波清洗機(jī)（深圳深華泰，型號：PS-40）;分析天平（梅特勒-托利多，型號：AB135-S）等。

1.2 試劑 甲醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號：20180823）;乙腈（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20130503）其他試劑全部為分析純。

1.3 分析樣品 鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-201613）購自中國食品藥品檢定研究院;黃柏、黃芩、大薊、白及、當(dāng)歸、冰片等藥材均購買于西安萬壽路中藥材市場，經(jīng)西安交通大學(xué)藥學(xué)院竇建衛(wèi)副教授鑒定均為正品。供試品、陰性樣品全部為自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠;乙腈-0.1%磷酸水溶液（50∶50）;檢測波長265 nm。按鹽酸小檗堿計算理論板數(shù)應(yīng)該大于等于4 000。

2.2 對照品溶液的制備 取一定量鹽酸小檗堿，以甲醇溶液為溶劑，配制成濃度為0.1 mg/mL的溶液，為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品1粒，切碎，稱取約0.2 g，準(zhǔn)確稱量，放置50 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，超聲提取（250 W，40 KHz）20 min，放涼至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm濾膜，為供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備 按上述制備方法，取除黃柏外的陰性樣品適量，制備陰性對照溶液。

2.5 專屬性試驗 對照品溶液（精確量?。?0 μL，進(jìn)行檢測，獲得色譜圖，供試品與陰性對照溶液重復(fù)上述步驟。結(jié)果可知，在色譜峰相對應(yīng)的位置上，陰性樣品無色譜峰被檢出，說明制劑中其他藥材不會干擾鹽酸小檗堿的測定。結(jié)果見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察 稱取一定量鹽酸小檗堿對照品，用甲醇溶液作為溶劑，制備為濃度為9.28、18.56、37.12、55.68、92.8、111.36 μg/mL的溶液，定量吸取上述溶液20 μL進(jìn)行實驗，獲得色譜圖及峰面積積分值，分析得到其回歸方程：y=3 805.3x+5 448（r=0.999 9），在0.185 6～2.227 2 μg范圍內(nèi)，鹽酸小檗堿與峰面積有較好的線性關(guān)系。

2.7 中間精密度試驗 取對照品溶液，進(jìn)行實驗（色譜條件如上），獲得色譜圖，色譜峰面積，以鹽酸小檗堿峰面積進(jìn)行考察，重復(fù)進(jìn)樣6次，計算RSD等于0.46%，結(jié)果可知，該方法精密度良好。

2.8 供試品溶液穩(wěn)定性試驗 在0 h開始，每隔2 h進(jìn)樣1次，共進(jìn)樣6次，10 μL/次，獲得色譜圖，同時測定色譜峰面積，RSD等于0.59%。結(jié)果可知，在10 h內(nèi)，供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗 按以上方法制備供試品溶液6樣份，順次分別取10 μL進(jìn)行分析，獲得色譜圖，計算其中鹽酸小檗堿的含量為24.56 mg/粒，RSD=1.01%。結(jié)果可知，此種方法有很好的重復(fù)性。

2.10 回收率試驗 取6份一定量已知濃度的樣品，各0.1 g，依次分別加入10 mL容量瓶中，分別加以上鹽酸小檗堿對照品約1.20 mg，依以上方法制備、分析，獲得色譜圖，計算樣品中平均回收率為99.4%，RSD為0.8%。

2.11 樣品測定結(jié)果

2.11.1 出膏率測定方法 按處方比例稱取黃柏、黃芩、大薊、白及、當(dāng)歸、冰片等全部藥材，按上述條件安排試驗，收集提取液，濃縮，定容至1 000 mL，備用。精密量取各試驗項下濃縮液50 mL，分別置恒重好的干燥蒸發(fā)皿中水浴蒸干，置烘箱中烘3 h（105 ℃），取出，迅速置干燥器中冷卻30 min，稱重，計算出膏率。

2.11.2 醇沉工藝正交實驗設(shè)計 醇沉的效果與含醇量（A）、藥液相對密度（B）、靜置時間（C）等因素有著至關(guān)重要的聯(lián)系。為了選出對康痔栓最佳的醇沉工藝，采用L9（34）正交設(shè)計表，以出膏率和鹽酸小檗堿的含量作為考察指標(biāo)，進(jìn)行實驗，其影響因素見表1。

2.11.3 醇沉工藝正交實驗結(jié)果 選擇鹽酸小檗堿的提取量與出膏率的綜合評分作為此次試驗的評價指標(biāo)。鹽酸小檗堿的含量權(quán)重系數(shù)定為0.7，出膏量權(quán)重系數(shù)定為0.3。醇沉工藝進(jìn)行了9次試驗，試驗數(shù)據(jù)、方差分析結(jié)果見表2、3。

2.11.4 結(jié)果分析 由上述數(shù)據(jù)分析可得，對康痔栓提取工藝的影響順序為A>C>B，即含醇量>靜置時間>藥液相對密度。方差分析結(jié)果表明：含醇量對評價指標(biāo)有顯著性的影響，由正交試驗結(jié)果可以看出，最佳工藝為A2B2C2，即含醇量為60%，藥液相對密度為1.10～1.20，靜置時間24 h。

2.11.5 驗證實驗 按處方量稱取各藥材，共3份，按照所選提取條件以及醇沉條件試驗，藥液分別濃縮、醇沉，取上清液，定容至1 000 mL，取50 mL按照正交實驗出膏率測定方法測定出膏率;再取100 mL按照水煎煮正交試驗項下含量測定方法進(jìn)行測定，三次驗證試驗表明，結(jié)果接近或者高于正交表中最優(yōu)值，說明優(yōu)選的條件基本可行。

3 討論

康痔栓處方是在古方“痔核散”的基礎(chǔ)上增加止血藥大薊、白及而成的，全方由黃柏、黃芩、大薊、白及、當(dāng)歸、冰片、雷公藤等組成。方中黃柏，功能擅于清熱燥濕，瀉火解毒。《本草新編》[7]謂：“黃柏，味苦、微辛，氣寒，陰中之陰，降也。無毒。乃足少陰妙藥，又入足太陽。專能退火解熱，消渴最效，去腸風(fēng)，止血痢，逐膀胱結(jié)熱”;《本草經(jīng)疏》中記載：“黃檗，主五臟腸胃中結(jié)熱。蓋陰不足，則熱始結(jié)于腸胃;……腸痔漏，亦皆濕熱傷血所致;……乃足少陰腎經(jīng)之要藥，專治明虛生內(nèi)熱諸證，功烈甚偉，非常藥可比也”。

黃芩，具有瀉實火、除濕熱、止血、安胎的功效[8]?！侗静菪戮帯分^：“黃芩，味苦，氣平，性寒，可升可降，陰中微陽，無毒。入肺經(jīng)、大腸。退熱除煩，瀉膀胱之火，止赤痢，消赤眼，善安胎氣，解傷寒郁蒸，潤燥，益肺氣”。野菊花，功能清熱解毒，疏風(fēng)平肝[9]。《本草匯言》中記載：“破血疏肝，解疔散毒。主婦人腹內(nèi)宿血，解天行火毒丹疔。洗瘡疥，又能去風(fēng)殺蟲”。《浙江中藥手冊》中說其可排膿解毒，消腫止痛。治癰腫療毒，天皰濕瘡。《現(xiàn)代實用中藥》中記載，用于癰疽化膿病。大薊，功能涼血止血，行瘀消腫[10]?！度杖A子本草》中記載：大薊“葉，治腸癰，腹藏瘀血，血運撲損，可生研，酒并小便任服;惡瘡疥癬，鹽研窨敷”?！兜崮媳静荨分杏涊d：“其消瘀血，生新血，止吐血、鼻血。治小兒尿血，婦人紅崩下血，生補(bǔ)諸經(jīng)之血，消瘡毒，散瘰疬結(jié)核，瘡癰久不收口者，生肌排膿”?！队窬舅幗狻分杏涊d可治金瘡?！夺t(yī)林纂要》中記載：“堅腎水，去血熱，泄逆氣。治腸風(fēng)，腸癰”。《福建民間草藥》中記載：“涼血止血，消炎退腫。治肺熱咳血，熱結(jié)血淋，疔癤瘡瘍，漆瘡，湯火燙傷”。白及，功能收斂止血;消腫生肌[11]。《本草綱目》中有白及：“性澀而收，故能入肺止血，生肌治瘡也”?！度杖A子本草》中記載：“止驚邪、血邪，癇疾，赤眼，癥結(jié)，發(fā)背，瘰疬，腸風(fēng)，痔瘺，刀箭瘡撲損，溫?zé)岑懠玻?，湯火瘡，生肌止痛，風(fēng)痹”。當(dāng)歸，味甘、辛、苦、性溫。歸肝、心、脾經(jīng)。功能補(bǔ)血和血，調(diào)經(jīng)止痛，潤燥滑腸[12]。臨床上主要用于血虛諸證;月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉、痛經(jīng)、癥瘕結(jié)聚、崩漏、虛寒腹痛、痿痹、肌膚麻木、腸燥便難、赤痢后重、癰疽瘡瘍、跌撲損傷。冰片，通諸竅，散郁火，去翳明目，消腫止痛[13]。可用于瘡瘍腫痛，瘡潰不斂，水火燙傷。本品有清熱解毒、防腐生肌作用，故外用清熱消腫、生肌斂瘡方中均用冰片。雷公藤功能祛風(fēng)除濕;活血通絡(luò);消腫止痛;殺蟲解毒，用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎;風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎;紅斑狼瘡;口眼干燥綜合征;白塞病;濕疹;銀屑病;麻風(fēng)病;疥瘡;頑癬等[14]?！逗纤幬镏尽分^其可：“殺蟲，消炎，解毒”。枯礬，擅長解毒殺蟲，清熱消痰，燥濕止癢。用于濕疹，疥癬，癲癇，中風(fēng)，喉痹[15]。外用可解毒止癢，常制成散劑、洗劑、含嗽劑、注射劑使用，高濃度具有腐蝕性，用于胬肉，痔瘡，脫肛。如消痔液等。

縱觀全方，黃柏、黃芩以清熱燥濕、瀉火解毒為主，野菊花、大薊、白及三味藥材以止血、祛瘀為主，當(dāng)歸、冰片、枯礬針對病癥發(fā)揮其抗菌、鎮(zhèn)痛作用?？傊摲街?jǐn)守病機(jī)，配伍精妙，藥著力宏。全方共奏燥濕、止血、鎮(zhèn)痛之功效。臨床用于熱解毒，祛濕消腫，化瘀止痛，涼血止血。用于內(nèi)痔、混合痔濕熱壅滯證。

栓劑為古老劑型之一，我國使用栓劑已有悠久的歷史?！妒酚洝}公列傳》、張仲景的《傷寒論》、晉·葛洪的《肘后備急方》中都有類似栓劑的記載。在公元前1550年的埃及《伊伯氏草本》中也有記載。栓劑具有以下優(yōu)點：1）藥物不受胃腸pH或酶的破壞，在一定程度上避免了肝臟的首過效應(yīng)，生物利用度高，對肝的不良反應(yīng)小。2）避免了藥物對胃黏膜的刺激，干擾因素少，能促進(jìn)藥物吸收。3）直接作用于病灶、起效快，作用時間長。本方具有清熱解毒，祛濕消腫，化瘀止痛，涼血止血。用于內(nèi)痔、混合痔濕熱壅滯證。栓劑在腔道內(nèi)緩緩融解從而發(fā)揮治療作用，產(chǎn)生持久的藥效，直接接觸病灶，考慮到本方的功能主治和發(fā)病部位的特點以及栓劑的優(yōu)點，選擇栓劑為本方的制劑形式。

本實驗對康痔栓的水提物進(jìn)行醇沉的研究，同時以出膏率和鹽酸小檗堿為考察指標(biāo)。通過實驗得出，含醇量是影響醇沉效果的主要因素。且最終確定康痔栓的醇沉工藝為：即含醇量為60%，藥液相對密度為1.10～1.20，靜置時間24 h。

為了便于該制劑的臨床研究與應(yīng)用，本實驗根據(jù)處方所含藥物的性質(zhì)，采用對應(yīng)的工藝，且對各工藝的參數(shù)進(jìn)行考察，經(jīng)過三批中試試驗研究，實驗結(jié)果表明，三批中試試驗結(jié)果均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，制備工藝重現(xiàn)性好，具有可行性，可以作為放大生產(chǎn)的條件依據(jù)，經(jīng)過對中試產(chǎn)品的質(zhì)量檢驗，符合藥典及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，故制劑工藝是可行的。

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（2018-01-12收稿 責(zé)任編輯：王明）