大狼毒不同部位浸提液對(duì)多年生黑麥草幼苗生長(zhǎng)的化感效應(yīng)及生理機(jī)制

羅 欽,馬祖艷,牛瓊梅,桂寶林,謝 勇,劉 洋,劉 佳,單貴蓮*,初曉輝*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系,云南 昆明 650201;2.尋甸縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局土壤肥料工作站,云南 尋甸 655200;3.云南省昆明市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,云南 昆明 650223;4.云南省林業(yè)與草原局,云南 昆明 650224;5.香格里拉市林業(yè)和草原局,云南 迪慶 674499)

滇西北山地草甸是云南天然草地重要組成部分之一,其在當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)發(fā)展及生態(tài)屏障方面發(fā)揮著巨大的作用[1-2]。然而,由于氣候寒冷及過度放牧等自然和人為因素干擾,導(dǎo)致滇西北高寒草甸出現(xiàn)了以大狼毒(Euphorbiajolkinii)、網(wǎng)脈橐吾(Ligulariadictyoneura)等毒害草擴(kuò)散蔓延為主要特征的草地退化問題[3-5]。

大狼毒屬大戟科多年生草本植物,該物種根系發(fā)達(dá)抗逆性強(qiáng),分枝能力強(qiáng),對(duì)高寒氣候條件有極強(qiáng)的適應(yīng)性,加之全株有毒家畜拒食,因此目前已成為滇西北退化高寒草甸廣泛分布的本土入侵植物[6]及退化指示植物[4]。大狼毒的入侵?jǐn)U散會(huì)引起滇西北高寒草甸物種多樣性的顯著下降,優(yōu)質(zhì)牧草數(shù)量銳減[3-4]。王紫媛等[7]研究發(fā)現(xiàn),大狼毒的化感抑它作用是造成滇西北高寒草甸物種多樣性下降的原因之一。

毒害草化感抑它作用是改變草地生態(tài)系統(tǒng)物種分布格局及驅(qū)動(dòng)群落演替的重要原因[8-14]。劉冠志等[8-10],研究表明,狼毒(Stellerachamaejasme)不同部位水浸液會(huì)對(duì)紫花苜蓿(Medicagosativa)、披堿草(Elymusdahuricus)、冰草(Agropyronmongolicum)、山韭(Alliumsenescens)等伴生植物產(chǎn)生化感抑制作用,主要表現(xiàn)在影響其種子的發(fā)芽和幼苗的生長(zhǎng)上。狼毒對(duì)伴生植物的化感毒性,可能是草地群落結(jié)構(gòu)變化及植被退化的原因之一[11]。王輝等[12]研究發(fā)現(xiàn),舟葉橐吾(Ligulariacymbulifera)水浸液會(huì)抑制白三葉(Trifoliumrepens)、多年生黑麥草(Loliumperenne)、鴨茅(Dactylisglomerata)的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。鄭亞萍等[13-14]研究表明,外來入侵雜草薇甘菊(Mikaniamicrantha)釋放的綠原酸、β-石竹烯等化感物質(zhì)會(huì)影響土壤中氮循環(huán)功能菌的繁殖,促進(jìn)有效氮的生成,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)化感利己作用。

綜上,化感抑它作用作為毒害草入侵的重要“武器”,是造成草地群落演替及物種多樣性降低、數(shù)量減少的重要原因。然而,就滇西北高寒草甸普遍分布的有毒植物大狼毒而言,其對(duì)優(yōu)良禾本科牧草種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的化感效應(yīng)究竟有多強(qiáng)?檢索資料發(fā)現(xiàn)前人以紫花苜蓿、早熟禾(Poaannua)等為受體材料,從種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)方面開展了大狼毒對(duì)優(yōu)良牧草化感效應(yīng)的初步研究,表明化感抑它作用是大狼毒入侵草地物種多樣性下降的原因之一[7,15],但大狼毒浸提液化感脅迫會(huì)引起優(yōu)良牧草幼苗發(fā)生怎樣的生理變化、檢索資料發(fā)現(xiàn)前人尚未開展過系統(tǒng)研究。據(jù)此,本研究以滇西北退化高寒草甸補(bǔ)播治理中常用的‘麥迪’多年生黑麥草(L.perenne‘Mathilde’)為受體材料,開展大狼毒不同部位水浸提液對(duì)其種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、生理及內(nèi)源激素含量影響的系統(tǒng)研究,通過研究探討大狼毒對(duì)優(yōu)良牧草的化感效應(yīng)及生理機(jī)制,研究成果對(duì)揭示大狼毒的入侵?jǐn)U散機(jī)制具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料和受試材料

供試材料為采自滇西北高寒草甸的、生長(zhǎng)高度長(zhǎng)超過50 cm的大狼毒成熟植株。2021年9月,挖取大狼毒植株,洗凈根部泥土,將根、莖葉分開,自然風(fēng)干后粉碎、過篩(孔徑0.45 mm),裝袋密封備用。

受試材料為購(gòu)自北京正道公司的‘麥迪’多年生黑麥草,該品種對(duì)滇西北高寒氣候極為適應(yīng),近年來被廣泛用于滇西北退化高寒草甸的補(bǔ)播治理。

1.2 研究方法

1.2.1浸提液的制備 以風(fēng)干的大狼毒根、莖葉粉碎物為材料,采用蒸餾水浸提法制備大狼毒浸提液。分別稱取大狼毒根、莖葉120 g,放入1 000 mL蒸餾水中,恒溫震蕩12 h后靜置12 h,用定量濾紙和孔徑為0.45 μm的濾膜進(jìn)行二重過濾,得到120 g·L-1的浸提液母液,用蒸餾水稀釋母液,以獲得質(zhì)量濃度為10,20,30,40 g·L-1的浸提液用于種子萌發(fā),以及質(zhì)量濃度為40,80,120 g·L-1的浸提液用于幼苗生長(zhǎng)。浸提液放入4℃的冰箱中冷藏備用[15]。

1.2.2種子發(fā)芽試驗(yàn)及指標(biāo)測(cè)定 采用培養(yǎng)皿濾紙法進(jìn)行種子發(fā)芽試驗(yàn)[9]。將受試種子置于2%的次氯酸鈉溶液消毒20 min,用蒸餾水沖洗洗凈,然后用濾紙吸干種子表面水分。挑選100粒飽滿、無病蟲害的受試種子置于墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿(Φ=9 cm)中,分別加入質(zhì)量濃度為10,20,30,40 g·L-1浸提液5 mL浸潤(rùn)濾紙(對(duì)照組用等量蒸餾水浸潤(rùn),每處理設(shè)3次重復(fù)),置于(25±1)℃,14 h光照/10 h黑暗,光強(qiáng)6 000 lx的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),每天補(bǔ)充1 mL對(duì)應(yīng)濃度溶液以保持濾紙濕潤(rùn)。定時(shí)觀察發(fā)芽情況,從種子萌發(fā)開始統(tǒng)計(jì)每天發(fā)芽種子的數(shù)量,持續(xù)統(tǒng)計(jì)至經(jīng)過3 d再無種子發(fā)芽結(jié)束種子萌發(fā)試驗(yàn),采用郭英姿[16]的方法計(jì)算種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)。

發(fā)芽率(%)=(12 d后長(zhǎng)成正常幼苗數(shù)量/供試種子數(shù)量)×100

發(fā)芽勢(shì)(%)=(5 d后發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子數(shù)量)×100

發(fā)芽指數(shù)(Germination index,GI)=∑(Gt/Dt)

式中：Gt為第t日內(nèi)的發(fā)芽數(shù);Dt是相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù);GI為發(fā)芽指數(shù)。

1.2.3幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn)及指標(biāo)測(cè)定 幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn)采用穴盤法進(jìn)行[15]。采用單孔體積為150 mL的六孔穴盤,于穴盤內(nèi)加入珍珠巖∶蛭石=1∶1的混合基質(zhì),每孔分別播種15粒多年生黑麥草種子(一個(gè)穴盤為一個(gè)重復(fù),每處理設(shè)3次重復(fù)),放在(25±1)℃下,14 h光照/10 h黑暗,光強(qiáng)6 000 lx的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng),每隔一天澆一次1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。出苗后培養(yǎng)30 d左右,待多年生黑麥草生長(zhǎng)到分蘗期,分別用濃度為40,80,120 g·L-1的大狼毒根、莖葉浸提液30 mL澆施多年生黑麥草幼苗,對(duì)照澆施等量蒸餾水(每3 d澆一次浸提液,3 d澆一次營(yíng)養(yǎng)液,澆浸提液與營(yíng)養(yǎng)液時(shí)間不在同一天)。持續(xù)澆施20 d至多年生黑麥草進(jìn)入拔節(jié)期,其植株地上部分長(zhǎng)勢(shì)出現(xiàn)明顯差異時(shí),測(cè)定植株的單株鮮重、株高(垂直高度)和根長(zhǎng)。參照王學(xué)奎等[17]的方法,采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量、NBT光還原法測(cè)定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性、紫外吸收法測(cè)定過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性。參照焦奎等[18]的方法,利用酶聯(lián)免疫法測(cè)定赤霉素(Gibberellic acid,GA)、脫落酸(Abscisic acid,ABA)、吲哚乙酸(Indoleacetic acid,IAA)、玉米素(Zeatin,ZT)、茉莉酸(Jasmonic acid,JA)、水楊酸(Salicylic acid,SA)含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),采用SPSS 26.0進(jìn)行one-way ANOVA方差分析及Duncan多重比較。參照Muhammas等[19]的方法計(jì)算化感效應(yīng)指數(shù)(Allelopathic response index,RI)和綜合化感效應(yīng)(Synthetical effect of allelopathy,SE),計(jì)算公式如下：

RI=1-C/T (T≥C)或RI=T/C-1 (T

SE萌發(fā)=(RI發(fā)芽率+RI發(fā)芽指數(shù))/2

SE幼苗=(RI株高+RI根長(zhǎng)+RI單株干重)/3

式中：C為對(duì)照組,T為處理組。RI和SE反映化感效應(yīng)的強(qiáng)弱,<0表現(xiàn)抑制效應(yīng),>0表現(xiàn)促進(jìn)效應(yīng),絕對(duì)值大小表示作用強(qiáng)度[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大狼毒浸提液對(duì)多年生黑麥草種子萌發(fā)的影響

大狼毒浸提液處理降低了多年生黑麥草種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù),呈現(xiàn)隨浸提液濃度升高而顯著降低的變化趨勢(shì)(10 g·L-1根浸提液處理下發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)測(cè)定結(jié)果除外)(P<0.05)(圖1)。具體為：與CK相比,10,20,30,40 g·L-1根浸提液處理下,多年生黑麥草種子發(fā)芽率分別降低了6.5%,30.6%,46.5%和78.0%,發(fā)芽指數(shù)分別降低了5.2%,37.9%,62.0%和85.3%;10,20,30,40 g·L-1莖葉浸提液處理下,多年生黑麥草種子發(fā)芽率分別降低了10.6%,20.82%,45.3%和60.4%,發(fā)芽指數(shù)分別降低了17.9%,30.0%,54.3%和71.4%。

圖1 大狼毒浸提液對(duì)多年生黑麥草種子萌發(fā)的影響Fig.1 Effects of the extracts of E. jolkinii on seed germination of perennial ryegrass注：不同小寫字母表示同一部位不同處理間在0.05水平下差異顯著。下同Note：Different lowercase letters indicate significant differences between treatments at the 0.05 level.The same as below

由圖2可知,大狼毒浸提液對(duì)多年生黑麥草種子萌發(fā)的綜合化感效應(yīng)指數(shù)(SE)均為負(fù)值,即大狼毒浸提液對(duì)多年生黑麥草種子萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用,抑制強(qiáng)度隨濃度升高而增大。在10 g·L-1濃度下,莖葉浸提液抑制強(qiáng)度大于根浸提液處理,在20～40 g·L-1濃度下,根浸提液抑制強(qiáng)度大于莖葉浸提液處理。

圖2 大狼毒浸提液對(duì)多年生黑麥草種子萌發(fā)綜合化感效應(yīng)Fig.2 Comprehensive allelopathy effect of E. jolkinii extracts on seed germination of perennial ryegrass

2.2 大狼毒浸提液對(duì)多年生黑麥草幼苗生長(zhǎng)的影響

大狼毒根、莖葉浸提液處理顯著降低了多年生黑麥草幼苗的株高、根長(zhǎng)和單株干重(40 g·L-1根、莖葉浸提液處理干重測(cè)定結(jié)果除外)(P<0.05),且降低程度隨浸提液濃度的升高而增加(圖3)。具體為：與CK相比,40,80,120 g·L-1根浸提液處理下,多年生黑麥草幼苗株高分別降低了6.60,11.99,16.63 cm,根長(zhǎng)分別降低了3.16,3.68,4.00 cm,單株干重分別減少了0.01,0.05,0.09 g;40,80,120 g·L-1莖葉浸提液處理下,多年生黑麥草幼苗株高分別降低了7.38,12.56,16.48 cm,根長(zhǎng)分別降低了3.55,3.87,5.78 cm,單株干重分別減少了0.01,0.06,0.06 g。

由圖4所示,大狼毒根、莖葉浸提液對(duì)多年生黑麥草幼苗生長(zhǎng)的綜合化感效應(yīng)指數(shù)<0,表明其對(duì)多年生黑麥草幼苗生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用,抑制強(qiáng)度隨浸提液濃度增加而增強(qiáng),不同部位綜合化感效應(yīng)強(qiáng)度以根>莖葉。

圖3 大狼毒浸提液對(duì)多年生黑麥草幼苗生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of the extracts of E. jolkinii on the growth of perennial ryegrass seedlings

圖4 大狼毒浸提液對(duì)多年生黑麥草幼苗生長(zhǎng)的綜合化感效應(yīng)Fig.4 Comprehensive allelopathy effect of E. jolkinii extracts on growth of perennial ryegrass seedlings

2.3 大狼毒浸提液對(duì)多年生黑麥草幼苗生理的影響

2.3.1對(duì)丙二醛含量和抗氧化酶活性的影響 由圖5(A)可知,隨著大狼毒浸提液濃度的增加,多年生黑麥草幼苗MDA含量顯著增加(P<0.05),浸提液濃度為120 g·L-1時(shí)MDA含量達(dá)最大值。與CK相比,120 g·L-1根、莖葉浸提液處理分別使多年生黑麥草幼苗MDA含量增加了237.6%和196.5%。

由圖5(B,C)可知,大狼毒根、莖葉浸提液化感脅迫使多年生黑麥草幼苗體內(nèi)SOD和CAT活性增加,增加幅度隨浸提液濃度增加而增加。當(dāng)浸提液濃度增加至120 g·L-1時(shí),黑麥草幼苗體內(nèi)SOD和CAT活性增加至最大值與CK相比差異顯著(P<0.05)。與CK相比,120 g·L-1根、莖葉浸提液處理分別使多年生黑麥草幼苗SOD活性提高了24.6%和15.3%,CAT活性提高了43.0%和26.9%。

2.3.2對(duì)內(nèi)源激素含量的影響 由圖7可知,大狼毒根、莖葉浸提液處理使多年生黑麥草幼苗體內(nèi)GA,IAA,ZT,JA,SA含量呈顯著下降的變化趨勢(shì),下降幅度隨浸提液濃度的升高而顯著增加(40 g·L-1莖葉浸提液處理下IAA含量測(cè)定結(jié)果除外)(P<0.05),ABA含量呈上升、下降、再上升的變化趨勢(shì),各處理ABA含量均顯著大于CK(P<0.05)。與CK相比,120 g·L-1濃度處理下,根浸提液處理分別使多年生黑麥草幼苗體內(nèi)GA,IAA,ZT,JA,SA含量下降了43.4%,33.6%,38.4%,52.2%,41.2%,莖葉浸提液處理分別使多年生黑麥草幼苗GA,IAA,ZT,JA,SA含量下降了25.5%,25.3%,24.5%,41.6%,16.0%;根、莖葉浸提液處理分別使多年生黑麥草幼苗ABA含量增加了116.7%,110.1%。

3 討論

植物化感作用是植物與環(huán)境長(zhǎng)期適應(yīng)的結(jié)果,植物產(chǎn)生的次生代謝物可有效提高植物生存競(jìng)爭(zhēng)的能力[20]。自然狀態(tài)下,植物的化感物質(zhì)通過自然途徑進(jìn)入到環(huán)境影響周圍植物的生長(zhǎng),化感物質(zhì)會(huì)伴隨植物整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育周期[21]。植物間的化感作用主要體現(xiàn)在對(duì)受試植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)以及生理的影響,而且這種影響與化感作用的強(qiáng)度與水浸液濃度、化感物質(zhì)種類及受試植物種類相關(guān)[7-9,15,22-23]。

種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)是植物生命史重要的兩個(gè)階段,其萌發(fā)、生長(zhǎng)過程易受到外界環(huán)境變化的影響。本研究結(jié)果表明,在種子萌發(fā)階段,大狼毒根、莖葉浸提液處理抑制了多年生黑麥草種子的萌發(fā),浸提液濃度超過20 g·L-1時(shí),多年生黑麥草種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)顯著降低(P<0.05);在幼苗生長(zhǎng)階段,大狼毒根、莖葉浸提液處理抑制了多年生黑麥草幼苗的生長(zhǎng),浸提液濃度超過80 g·L-1時(shí),多年生黑麥草株高、根長(zhǎng)、單株干重顯著降低(P<0.05)。這一研究結(jié)果與王紫媛等[7]、李彥飛等[15]研究得出大狼毒浸提液對(duì)受體植物種子和幼苗生長(zhǎng)有抑制作用的結(jié)果基本一致。

在逆境脅迫下,植物細(xì)胞膜系統(tǒng)受氧自由基毒害發(fā)生膜脂過氧化作用,其產(chǎn)物MDA含量反映膜脂過氧化程度和膜系統(tǒng)受損程度[24]。SOD和CAT抗氧化酶是植物活性氧(Reactive oxygen species,ROS)清除系統(tǒng)的關(guān)鍵抗氧化酶,用以清除活性氧引起膜脂過氧化對(duì)細(xì)胞造成的傷害,其活性高低也可反映植物受傷害程度[16,24]。本研究結(jié)果顯示,大狼毒浸提液處理使多年生黑麥草幼苗MDA含量顯著提高(P<0.05),表明多年生黑麥草幼苗在大狼毒浸提液化感脅迫下發(fā)生膜脂過氧化作用并生成了有害物質(zhì),導(dǎo)致植物體內(nèi)MDA含量升高,加劇細(xì)胞膜損傷,影響植物幼苗的生長(zhǎng)[16]。大狼毒浸提液處理下多年生黑麥草幼苗的SOD,CAT含量增加,表明多年生黑麥草幼苗為減輕化感脅迫的負(fù)面影響,通過增強(qiáng)SOD和CAT活性以抵抗脅迫損傷,增強(qiáng)抗性。

內(nèi)源激素是植物體自身代謝產(chǎn)生的微量活性物質(zhì),植物通過調(diào)控內(nèi)源激素的合成與代謝應(yīng)對(duì)多種生物、非生物脅迫[25-26]。常見植物激素GA可促進(jìn)植物發(fā)芽、開花、結(jié)果及果實(shí)發(fā)育,IAA可促進(jìn)植物細(xì)胞生長(zhǎng),ZT具有促進(jìn)葉綠素的生物合成,防止葉片老化的作用,SA能誘導(dǎo)植物對(duì)外界脅迫產(chǎn)生抗性,JA可誘導(dǎo)側(cè)根的生長(zhǎng),ABA會(huì)啟動(dòng)植物體內(nèi)一些保護(hù)反應(yīng),從而使植物對(duì)外界脅迫具備一定的適應(yīng)性[18]。眾多研究表明逆境能影響植物內(nèi)源激素的含量及其生物活性,通常表現(xiàn)為ABA等抑制類內(nèi)源激素含量會(huì)顯著增加,而GA,IAA等促進(jìn)類內(nèi)源激素含量則下降,從而調(diào)控植物體內(nèi)的代謝生理過程和抗逆性[27]。單貴蓮等[28]研究指出,在化感物質(zhì)的脅迫下,紫花苜蓿幼苗GA,ZT,IAA合成受阻,激素平衡受到破壞,幼苗生長(zhǎng)受到影響。郭偉等[29]認(rèn)為在化感物質(zhì)的脅迫下,受體植物ABA含量增加抑制IAA的合成,進(jìn)而調(diào)控GA含量下降。本研究表明,大狼毒根、莖葉浸提液處理使多年生黑麥草幼苗GA,IAA,ZT,JA,SA含量下降,ABA含量總體升高,這與單貴蓮等、郭偉等研究結(jié)果基本一致。本研究中,黑麥草ABA含量隨大狼毒浸提液濃度增加表現(xiàn)出上升、下降、再上升的趨勢(shì),可能是低濃度大狼毒浸提液促進(jìn)了多年生黑麥草幼苗ABA合成;隨著浸提液濃度增加,多年生黑麥草為保持自身代謝平衡加快ABA代謝[29-30],因此ABA含量降低;隨著浸提液濃度進(jìn)一步增加,多年生黑麥草內(nèi)源激素平衡被打破[26],ABA代謝受阻,其在幼苗體內(nèi)的積累量增加。ABA含量增加拮抗調(diào)控GA,IAA,ZT,JA,SA等促進(jìn)類內(nèi)源激素合成減少[31],影響多年生黑麥草幼苗對(duì)水分、養(yǎng)分的吸收,進(jìn)而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)分裂,減少葉綠素合成,抑制發(fā)芽分蘗,加快細(xì)胞老化,減弱抗逆性,促進(jìn)脫落與休眠[26],表現(xiàn)為多年生黑麥草幼苗生長(zhǎng)緩慢,甚至衰老死亡。

綜上,大狼毒化感物質(zhì)通過抑制受體植物GA,IAA,ZT,JA,SA等內(nèi)源激素合成,阻礙ABA代謝,增加MDA的含量,打破受體植物的生理平衡,進(jìn)而影響受體植物幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究中,顯著抑制多年生黑麥草幼苗生長(zhǎng)的最低浸提液濃度為40 g·L-1,這一濃度值顯著高于抑制其種子萌發(fā)的最低濃度(10 g·L-1),由此推測(cè)受體植物種子對(duì)大狼毒浸提液反應(yīng)的敏感性強(qiáng)于幼苗,這有待于對(duì)種子內(nèi)部生理變化進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

大狼毒根、莖葉浸提液對(duì)多年生黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)均產(chǎn)生明顯的化感抑制作用(P<0.05),抑制強(qiáng)度隨浸提液濃度升高而增大,以根浸提液抑制強(qiáng)度大于莖葉。在大狼毒的化感脅迫下,多年生黑麥草幼苗MDA含量升高,抗氧化酶POD和CAT活性增加,內(nèi)源激素GA,IAA,ZT,JA,SA含量下降,ABA含量升高,進(jìn)而表現(xiàn)為顯著抑制多年生黑麥草幼苗的生長(zhǎng)(P<0.05)。