甲烷氧化菌的分離鑒定及其發(fā)酵條件優(yōu)化

顧華兵 沈陽(yáng) 周淑鑫 范建華 李尚民 吳兆林 金波 儲(chǔ)衛(wèi)華

摘 要：甲烷氧化菌是一類(lèi)能以甲烷作為唯一碳源和能源進(jìn)行同化和異化代謝的細(xì)菌。本研究從污泥中分離、篩選獲得一株甲烷氧化菌MO-01，根據(jù)該菌株的形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA序列同源性分析，證實(shí)該菌株與Methylobacterium zatmanii菌株有99%的同源性，屬于Methylobacterium屬。甲烷氧化菌MO-01的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件篩選、研究表明，該菌株以甲烷為碳源，最佳培養(yǎng)溫度是37℃，最適PH值為7.0，銅離子濃度為30 umol/L。本研究為今后甲烷氧化菌的放大發(fā)酵培養(yǎng)和動(dòng)物源性單細(xì)胞蛋白的生產(chǎn)奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甲烷氧化菌;菌株篩選;菌種鑒定;16S rDNA

中圖分類(lèi)號(hào)：Q-3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

甲烷氧化菌（Methanotroph）是一種能夠以甲醇、甲烷、甲酸等作為生長(zhǎng)所需的碳源以及能源的一種甲基氧化菌[1]。據(jù)科學(xué)測(cè)定，濕地系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生的90%以上的甲烷氣體都會(huì)被甲烷氧化菌進(jìn)行氧化利用，用于合成自身細(xì)胞中的組成成分[2]。有研究表明甲烷氧化菌能夠用以生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白[3]。單細(xì)胞蛋白又稱(chēng)微生物蛋白，是指從純培養(yǎng)的微生物細(xì)胞中提取得到的總蛋白，可作為人及動(dòng)物蛋白的補(bǔ)充[4]。研究已經(jīng)表明，使用微生物產(chǎn)生的單細(xì)胞蛋白安全無(wú)毒，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸和多種維生素，可以用作飼料促進(jìn)畜禽生產(chǎn)，提高飼料利用率，代替魚(yú)粉、大豆、骨粉、肉類(lèi)和脫脂奶粉等蛋白補(bǔ)充飼料，具有較高的附加值[5]。由細(xì)菌以甲烷為原料生產(chǎn)的新型單細(xì)胞蛋白的蛋白含量69%～80%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于工業(yè)生產(chǎn)飼料15%～20% 的蛋白含量，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益和廣闊的市場(chǎng)空間[6-7]，因此分離出能以甲烷為碳源生長(zhǎng)的甲烷氧化細(xì)菌有著重要的意義。

本研究從污泥中分離了一株能夠以甲烷為碳源和能源的菌株，并對(duì)其生物學(xué)性狀進(jìn)行研究，利用16S rDNA技術(shù)對(duì)篩選的菌株進(jìn)行鑒定，并利用單因子控制的方法對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化篩選，為后期進(jìn)一步放大發(fā)酵培養(yǎng)和甲烷單細(xì)胞蛋白的生產(chǎn)提供良好科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?篩菌土樣

篩菌土樣采集于河床淤泥和生活垃圾填埋場(chǎng)5年以上填埋區(qū)土壤。

1.1.2?初篩選及富集培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方為：Mg SO4·7H2O 0.2 g、 KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 1.5 g、（NH4）2SO4 1.0 g、NaCl 1.0 g。以甲烷作為富集培養(yǎng)基碳源，以0.5 %無(wú)水甲醇作為固體培養(yǎng)基碳源;單一碳源無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基向上述液體培養(yǎng)基中加入1.5%～2%瓊脂。所有培養(yǎng)基配方及配置均由中國(guó)藥科大學(xué)微生物教研室提供。

1.2?方法

1.2.1?甲基氧化菌的富集培養(yǎng)

稱(chēng)取土樣10.0 g，加入到帶玻璃珠的裝有100 mL無(wú)菌蒸餾水的錐形瓶中，30 ℃搖床震蕩30 min，靜置10 min，得到土樣浸出液。取1.0 mL土樣浸出液上清加入到裝有90 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液的100 mL鹽水瓶中，用50升注射器注入甲烷氣體。隨后將鹽水瓶置于恒溫?fù)u床中在150 r/min，30 ℃條件下富集培養(yǎng)，直至錐形瓶中培養(yǎng)液明顯紅色渾濁。選取出現(xiàn)紅色渾濁較快且渾濁度較高的樣品組用于目的菌株的篩選[8]。

1.2.2?甲烷氧化菌的分離純化

甲烷氧化菌同樣能利用甲醇，因此在分離純化甲烷氧化菌時(shí)以甲醇代替甲烷制備固體培養(yǎng)基。以重復(fù)富集3次后獲得的粉紅色富集培養(yǎng)液為材料，采用平板分區(qū)劃線的方法將富集培養(yǎng)液接種于含0.5%甲醇的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～10天，挑取平板上的粉紅色的單菌落接種于新的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，重復(fù)3次，獲得的純化的菌株即為甲烷氧化菌。

1.2.3?分離菌株的生理生化及分子生物學(xué)鑒定

1.2.3.1?生理生化鑒定

參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)獲得的甲基氧化菌MO-01進(jìn)行形態(tài)學(xué)染色、運(yùn)動(dòng)性、生理生化鑒定[9]。

1.2.3.2?16S rDNA鑒定

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′）和1492R（5′- TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）對(duì)提取純化后的DNA進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并利用NCBI的Blast，將測(cè)序結(jié)果與Genbank中公開(kāi)的16S rDNA序列進(jìn)行核苷酸同源性分析，并用MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.4?甲基氧化菌MO-01培養(yǎng)條件優(yōu)化篩選

1.2.4.1?初始pH值對(duì)甲基氧化菌MO-01生長(zhǎng)的影響

將目的菌株接種于無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，設(shè)定初始pH分別為4、5、6、7、8、10，37℃搖床培養(yǎng)96 h后570 nm測(cè)定菌液OD值。

1.2.4.2?溫度對(duì)甲基氧化菌MO-01生長(zhǎng)的影響

將菌液接種于pH7.0的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)選取了20℃，25℃，30℃，37℃，40℃，45℃ 六個(gè)溫度下對(duì)目的菌株進(jìn)行搖床培養(yǎng)后測(cè)定菌液OD570值。

1.2.4.3?銅離子濃度對(duì)甲基氧化菌MO-01生長(zhǎng)的影響

在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基加入濃度為0、5、10、20、30、40 umol/L的CuSO4， 37℃，150 rpm搖床培養(yǎng)96 h后測(cè)定菌液OD570值。

1.2.4.4?不同碳源對(duì)甲基氧化菌MO-01生長(zhǎng)的影響

分別用麥芽糖，蔗糖，葡萄糖，淀粉，甲醇作為碳源，加入上述無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)96 h后570 nm測(cè)定菌液OD值。

2?結(jié)果與分析

2.1?甲烷氧化菌MO-01形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA鑒定

通過(guò)富集培養(yǎng)、利用平板分區(qū)劃線、轉(zhuǎn)接等方法從污泥中分離出10株能夠利用甲烷的細(xì)菌，其中一株在單位時(shí)間內(nèi)消耗甲烷能力最強(qiáng)、生長(zhǎng)速度較快，命名為甲烷氧化菌MO-01，對(duì)MO-01形態(tài)學(xué)和生理生化試驗(yàn)，該菌在以甲醇為碳源的瓊脂平板上經(jīng)48 h培養(yǎng)后菌落為粉紅色，表面光滑，菌落邊緣整齊，直徑0.8～1.2 mm，革蘭氏陰性短桿菌、無(wú)芽孢、無(wú)莢膜，在液體培養(yǎng)基中呈粉紅色菌液（圖1）。甲烷氧化菌MO-01產(chǎn)H2S試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)為陰性;甲基紅試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)和明膠液化試驗(yàn)均為陽(yáng)性。

對(duì)甲烷氧化菌MO-01進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增并測(cè)序，堿基長(zhǎng)度為1 427 bp，與GenBank中公開(kāi)的細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行核苷酸同源性比較，BLAST結(jié)果顯示，MO-01的16S rDNA基因序列與Methylobacterium zatmanii 7211菌株的同源性最高（圖2），達(dá)99%，所以確定該菌為甲基桿菌屬。基于16S rDNA序列、生化鑒定以及表征性狀，確定該分離菌株MO-01為甲基桿菌屬。

2.2?初始pH值對(duì)甲烷氧化菌MO-01生長(zhǎng)的影響

對(duì)不同pH值條件下甲烷氧化菌MO-01生長(zhǎng)情況進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖3所示，MO-01在pH值

4-5時(shí)幾乎停滯生長(zhǎng)，隨著pH值升高，生物量增加，到達(dá)7.0時(shí)最高，隨后隨著pH值升高，生物量有所下降，表明菌株MO-01最適生長(zhǎng)pH值=7.0，屬中性培養(yǎng)菌。而國(guó)內(nèi)鄧永翠[10]從青藏高原濕地分離了2株酸性甲烷氧化菌，江皓[11]等從煤礦土壤中分離的甲烷氧化菌呈堿性。因而甲烷氧化菌的最適PH值大小應(yīng)該與分離菌所在的環(huán)境酸堿條件相關(guān)。

2.3?溫度對(duì)甲烷氧化菌MO-01生長(zhǎng)的影響

在液體培養(yǎng)基pH值為7.0時(shí)，研究溫度對(duì)MO-01生長(zhǎng)的影響，如圖4所示，OD值在37℃時(shí)為最高，說(shuō)明甲烷氧化菌MO-01的最適生長(zhǎng)溫度為37℃，在37～40℃溫度范圍內(nèi)，細(xì)菌的生長(zhǎng)量都比較高，隨后隨著溫度升高而下降。這與趙艮貴[12]等人報(bào)道的最適溫度15～30℃有較大差異，可能與分離菌的原始生長(zhǎng)條件有關(guān)。

2.4?銅離子濃度對(duì)甲烷氧化菌MO-01生長(zhǎng)的影響

如圖5所示，銅離子適量添加，對(duì)甲烷氧化菌

MO-01生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，在30 umol/L CuSO4·5H2O添加量時(shí)，細(xì)菌的生物量達(dá)最高，但隨后又隨著添加量的增加而降低。表明MO-01的生長(zhǎng)明顯受銅離子的調(diào)控。這與王曉麗[13]等報(bào)道的基本一致。

2.5?不同碳源對(duì)甲烷氧化菌MO-01生長(zhǎng)的影響

分別用0.5%的麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉和甲醇作為碳源研究甲烷氧化菌MO-01對(duì)碳源的利用能力，結(jié)果如圖6所示，甲烷氧化菌MO-01對(duì)所提供的碳源都能利用，對(duì)淀粉的利用率最低，對(duì)甲醇最高。這與國(guó)內(nèi)劉曉寧[14]等以甲醇為唯一碳源時(shí)，菌株生長(zhǎng)很快但菌體生物量較低的報(bào)道不一致，可能與分離菌本身固有的特性相關(guān)。

3?結(jié)論

本研究從兩類(lèi)土壤樣品中分離出10株甲烷氧化菌，其中一株甲烷利用能力較強(qiáng)，革蘭氏陰性，這與目前已有報(bào)道的甲烷氧化菌都為革蘭氏陰性菌且沒(méi)有芽孢這一結(jié)果一致[15]。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化實(shí)驗(yàn)與16S rDNA生物學(xué)鑒定，該菌屬于Methylobacterium屬細(xì)菌，并命名為MO-01。

通過(guò)MO-01菌的分離純化、最佳培養(yǎng)條件優(yōu)化篩選研究，結(jié)果表明，MO-01菌在37℃、pH值70、銅離子濃度30 umol/L時(shí)生物量達(dá)到最大，為最適培養(yǎng)條件。

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（責(zé)任編輯：于慧梅）

Isolation， Identification of Methanotrophic Bacteria and

Optimization of its Fermentation Conditions

GU Huabing1， SHEN Yang2， ZHOU Shuxin3， FAN Jianghua1， LI Shangmin1，

WU Zhaolin1， JIN Bo1， ?CHU Weihua3*

（1.Jiangsu Institute of Poultry Sciences，Yangzhou 225125， China; 2.Yangshe Animal Epidemic Prevention Staion， Zhangjiagang 215637， China;

3. China Pharmaceutical University， Nanjing ?210009， China）

Abstract：

Methanotrophs are a kind of bacteria which can use methane as the sole carbon source and energy for their anabolism and catabolism. A strain of methyl oxidizing bacteria was isolated ，named MO-01，and screened by its morphology， physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence homology analysis.The results showed the MO-01 strain had 99% homology with the Methylobacterium zatmani strain， and was proved to belong to the genus Metylobacterium.The strain of the optimum growth condition was PH 7.0，and copperion concentration was 30 umol/L.This experiment laid a good foundation for the amplification of the Mo-01 strain ，and the production of single￣cell protein.

Key words：

methanotrophs bacteria; screening; identification; 16S rDNA