培養(yǎng)基主成分優(yōu)化提高大花金挖耳胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量

李玉平 龔寧

摘 要：【目的】優(yōu)化組合培養(yǎng)基中大量、微量元素及附加激素等培養(yǎng)條件，篩選出大花金挖耳細(xì)胞培養(yǎng)黃酮的生產(chǎn)培養(yǎng)基?！痉椒ā恳訬T+1.0 mg·L-1 NAA + 0.2 mg·L-1 6-BA為基本培養(yǎng)基，先優(yōu)化組合其大量元素NH+4、NO-3、K+，再優(yōu)化組合微量元素MoO2-4、Zn2+、BO3-3、Co2+、Cu2+、I-、Mn2+，最后分別附加2，4-D、KT、GA3，測定大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長、黃酮含量及產(chǎn)量?！窘Y(jié)果】大量元素優(yōu)化、微量元素優(yōu)化及附加激素KT、GA3，大花金挖耳細(xì)胞培養(yǎng)物中黃酮產(chǎn)量均得到了顯著提升（P<0.05），添加2，4-D降低了黃酮產(chǎn)量。本研究篩選得到大花金挖耳細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮類化合物的最佳NT培養(yǎng)基為：大量元素NH+4、NO-3、K+分別為15.46? mmol·L-1、14.10? mmol·L-1、19.10? mmol·L-1，微量元素MoO2-4、Zn2+、BO3-3、Co2+、Cu2+ 、I-、Mn2+分別為3.0 μmol·L-1、0.06 mmol·L-1、0.4 mmol·L-1、0.2 μmol·L-1、0.4 μmol·L-1、10 μmol·L-1、0.2 mmol·L-1，附加KT 0.2 mg·L-1。在此培養(yǎng)條件下，大花金挖耳細(xì)胞培養(yǎng)物中黃酮含量達(dá)到2.05%，是基本培養(yǎng)基的1.68倍;黃酮產(chǎn)量為517.87 mg·L-1，是基本培養(yǎng)基的1.80倍?！窘Y(jié)論】在前期研究的基礎(chǔ)上，通過培養(yǎng)基主成分優(yōu)化，提高了大花金挖耳細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮的產(chǎn)量，初步得到了黃酮生產(chǎn)培養(yǎng)基。

關(guān)鍵詞： 大量元素;微量元素;植物激素;黃酮;大花金挖耳

中圖分類號：Q 813.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1008-0384（2019）06-652-08

Abstract： 【Objective】 Formulation of the medium for Carpesium macrocephalum culture to produce flavonoids was optimized from the one obtained by a previous study.【Method】 Using NT+NAA 1.0 mg·L-1+0.2 mg·L-1? 6-BA as the base， the medium optimizations were firstly carried out on the macro-elements， NH+4， NO-3 and K+， then the micro-elements， MoO2-4， Zn2+， BO3-3， Co2+， Cu2+， I-， and Mn2+ and followed by the added 2，4-D， KT and GA3. The cellular growth as well as the flavonoids yield in the culture suspension were monitored for evaluation. 【Result】 With the optimized addition of the macro- and micro-elements plus KT or GA3， the flavonoids produced by C. macrocephalum culture significantly increased （P<0.05）， but reduced by the presence of 2，4-D. The finalized medium consisted of the base with added 15.46?? NH+4 mmol·L-1，? NO-3 14.10 mmol·L-1， K+ 19.10 mmol·L-1， MoO2-4 3.0 μmol·L-1，? Zn2+ 0.06 mmol·L-1，? BO3-3 0.4 mmol·L-1， Co2+ 0.2 μmol·L-1， Cu2+ 0.4 μmol·L-1， I- 10 μmol·L-1， Mn2+ 0.2 mmol·L-1， and?? KT 0.2 mg·L-1. The resulting flavonoids content in the culture suspension was 2.05%， which was 1.68-fold of control， and the flavonoids yield 517.87 mg·L-1， which was 1.80-fold of control. 【Conclusion】 By further modifying the previously obtained medium， the flavonoids produced from the C. macrocephalum culture significantly increased.

Key words：macroelements; microelements; phytohormone; flavonoids; Carpesium macrocephalum

0 引言

【研究意義】大花金挖耳Carpesium macrocephalum Franch.et Sav.系菊科天名精屬多年生草本植物，具有抗腫瘤、止血等醫(yī)用價(jià)值[1-2]和殺菌、殺蟲及除草等農(nóng)藥活性[3-5]。黃酮類化合物是其主要活性成分之一[6-7]，具有抗菌、抗病毒、抗癌等藥用價(jià)值和病蟲害防御、化感等植保作用[8-9]，具有極大的開發(fā)價(jià)值。【前人研究進(jìn)展】利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮類化合物是解決大花金挖耳野生植物資源短缺和黃酮類化合物人工合成困難等問題的有效手段[10-11]。培養(yǎng)基種類、大量元素、微量元素、植物激素、誘導(dǎo)子、細(xì)胞系、光照、pH等因素都會對植物細(xì)胞生物合成黃酮類化合物產(chǎn)生影響[12]。郭佳祺[13]通過優(yōu)化接種量、培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)速、pH值、無機(jī)鹽濃度、光照周期等培養(yǎng)條件，提高了蒺藜細(xì)胞生物合成黃酮的能力;趙德修等[14]開展了溫度、光照、激素、碳源等不同理化因子對雪蓮培養(yǎng)細(xì)胞生物合成黃酮的研究;陳紅賢等[15]研究發(fā)現(xiàn)碳源、氮源、磷源等大量元素的消耗與國槐槐角種胚細(xì)胞生長和黃酮的積累密切相關(guān)，黃酮的積累和細(xì)胞生長屬于部分生長偶聯(lián)型。李玉平等[11，16-17]研究了大花金挖耳愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖，建立了細(xì)胞懸浮系，并初步開展了培養(yǎng)基、大量元素、微量元素等理化因素對大花金挖耳細(xì)胞培養(yǎng)黃酮類化合物的研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在前期研究中，采取單因素試驗(yàn)已篩選出了對大花金挖耳細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮類化合物有顯著影響的大量元素[17]和微量元素[18]中各元素的最適濃度，亟待進(jìn)一步優(yōu)化組合相關(guān)理化因子及培養(yǎng)條件，提高大花金挖耳培養(yǎng)細(xì)胞的黃酮產(chǎn)量。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究遴選對大花金挖耳培養(yǎng)細(xì)胞生長和黃酮含量增加有貢獻(xiàn)的硝酸鉀（KNO3）、硝酸銨（NH4NO3）、鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）、硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）、硫酸銅（CuSO4·5H2O）硼酸（H3BO3）等大量、微量元素化合物進(jìn)行組合優(yōu)化，并分別附加激素2，4-D、KT、GA3，旨在篩選黃酮生產(chǎn)培養(yǎng)基，提高細(xì)胞黃酮產(chǎn)量，為大花金挖耳工廠化細(xì)胞培養(yǎng)黃酮類化合物提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞懸浮系

大花金挖耳細(xì)胞懸浮系由西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心篩選獲得[16]，繼代培養(yǎng)于基本培養(yǎng)基NT0（NT+1.0 mg·L-1 NAA + 0.2 mg·L-1 6-BA+40 g·L-1蔗糖）。繼代培養(yǎng)時(shí)間為7～10 d（細(xì)胞生長的對數(shù)期），培養(yǎng)條件：pH 5.8、搖床120 r·min-1、（25±2）℃，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx、光照12 h·d-1，下同。

1.1.2 儀器和試劑

主要儀器：EBP-190S電子天平（Sartorius公司）;S-315Tomy High-pressure steam sterilizer（Tomy KOGYO CO.LTD.Nerima Tokyo.Japan）;UV1102紫外/可見分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）;PHS-25型酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）; ZRD-5030全自動鼓風(fēng)干燥箱（上海智誠分析儀器制造有限公司）; HZT2雙層振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）。

主要試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）;萘乙酸（NAA）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）、二氯苯氧乙酸（2，4-D）、芐氨基腺嘌呤（KT）、赤霉酸（GA3）（美國Sigma 公司）;培養(yǎng)基中添加的蔗糖、肌醇及NT[19]培養(yǎng)基中添加的各種化合物均為分析純;丙酮為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長及黃酮累積的優(yōu)化試驗(yàn)

將基本培養(yǎng)基（NT0）中培養(yǎng)7～10 d的細(xì)胞接種40 g·L-1鮮重于試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基中，試驗(yàn)均采用250 mL三角瓶，每瓶100 mL液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件同上?？疾齑罅俊⑽⒘吭貎?yōu)化及附加激素2，4-D、KT、GA3對懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長及黃酮累積的影響。

向培養(yǎng)基NT0中添加KNO3和NH4NO3，對大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長和黃酮含量增加有顯著影響的大量元素NH+4、NO-3、K+進(jìn)行優(yōu)化組合（表1），其他大量元素為NT培養(yǎng)基固有濃度[19]，以NT0為對照（CK），考察大量元素優(yōu)化組合對大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長和黃酮合成的影響，并得到生產(chǎn)培養(yǎng)基NT1; 在大量元素優(yōu)化組合的基礎(chǔ)上，選取前期試驗(yàn)中對大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長和黃酮含量增加最為顯著的MoO2-4、Zn2+兩種微量元素進(jìn)行優(yōu)化組合（表2），BO3-3、Co2+、Cu2+、I-、Mn2+等微量元素離子濃度依次為：0.4? mmol·L-1 、0.2 μmol·L-1、0.4 μmol·L-1、10 μmol·L-1、0.2? mmol·L-1，以NT1為對照（CK），考察微量元素優(yōu)化組合對大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長和黃酮合成的影響，并得到生產(chǎn)培養(yǎng)基NT2; 在大量元素和微量元素優(yōu)化組合培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以NT2為對照（CK），再分別添加2，4-D（0、0.1、0.2、0.5、1.0? mg·L-1）、KT（0、0.1、0.2、0.5、1.0? mg·L-1）和GA3（0、0.1、0.2、0.3、0.5? mg·L-1），進(jìn)一步研究激素對細(xì)胞生長和黃酮產(chǎn)量的影響。

1.2.2 生物量的測定

將上述不同試驗(yàn)處理培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)20 d左右的褐化細(xì)胞進(jìn)行真空抽濾，所得細(xì)胞60℃烘干，細(xì)胞干重DW（g·L-1）為培養(yǎng)細(xì)胞的生長指標(biāo)。細(xì)胞凈生長量=收獲時(shí)細(xì)胞干重-接種時(shí)細(xì)胞干重。

1.2.3 黃酮含量的測定和產(chǎn)量的計(jì)算

總黃酮含量測定參考文獻(xiàn)[18]。以蘆丁為標(biāo)品，確定檢測波長為510 nm，以蘆丁質(zhì)量濃度L（mg·mL-1）對吸光值A(chǔ)進(jìn)行線性回歸，得方程L=0.0768 A-0.0004（r=0.999 7）。將上述各試驗(yàn)處理中懸浮培養(yǎng)20 d的細(xì)胞抽濾、烘干、粉碎，以丙酮為溶劑，取適量過60目篩的粉碎細(xì)胞干粉，振蕩提取3次，每次24 h，合并提取液，濃縮后用30%乙醇定容至0.50 g·mL-1，取適量供試液，測定總黃酮含量（X%），X% = V×Y/N×M×10-1，V為提取液體積（mL），Y為供試液總黃酮質(zhì)量濃度（mg·mL-1），N為細(xì)胞質(zhì)量（g），M為稀釋倍數(shù)。總黃酮產(chǎn)量（mg·L-1） =黃酮含量（%）×細(xì)胞生長量（g·L-1）×1000。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上試驗(yàn)重復(fù)3次，采用DPS數(shù)據(jù)分析軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan分析（P=0.05）。2 結(jié)果與分析

2.1 大量元素優(yōu)化組合對懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長和黃酮累積的影響

如圖1所示，大量元素優(yōu)化組合后的培養(yǎng)基對大花金挖耳培養(yǎng)細(xì)胞的生長和黃酮化合物的累積均有顯著的影響。從細(xì)胞生長量上看，處理Ⅱ和Ⅲ顯著高于對照，處理Ⅳ、Ⅴ顯著低于對照（P<0.05），以處理Ⅲ（15.46 mmol ·L-1NH+4+ 18.79 mmol ·L-1NO-3 +23.79 mmol ·L-1K+ ）所得細(xì)胞凈干重最高，為22.70 g·L-1，是對照的1.05倍;NT1中懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞呈黃色，明顯深于NT0（圖2）。從黃酮含量和黃酮產(chǎn)量上看，所有處理均高于對照，其中處理Ⅱ和處理Ⅲ的黃酮含量和產(chǎn)量均顯著高于對照（P<0.05），黃酮含量是對照的1.20～1.21倍，黃酮產(chǎn)量是對照的1.26倍;處理Ⅱ（NH+4 15.46 mmol·L-+ NO-3 14.10? mmol·L-1+K+ 19.10? mmol·L-1）所得黃酮含量最高，為1.48%（P<0.05），產(chǎn)量也最高，為363.95 mg·L-1。因此，以處理Ⅱ試驗(yàn)組為大量元素優(yōu)化組合提高培養(yǎng)細(xì)胞生物合成黃酮類化合物的最適培養(yǎng)基NT1。

2.2 微量元素優(yōu)化組合對懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長和黃酮累積的影響

如圖3所示，在優(yōu)化大量元素培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，研究發(fā)現(xiàn)微量元素優(yōu)化組合后的培養(yǎng)基對大花金挖耳培養(yǎng)細(xì)胞黃酮化合物的累積有顯著的影響。從細(xì)胞生長量上看，4個處理均較對照有一定的增高，但差異不顯著;從黃酮含量上看，處理A、B、C顯著高于對照（P<0.05），以處理A最高，達(dá)1.89%，是對照的1.55倍;從黃酮產(chǎn)量上看，所有處理均高于對照，處理A、B差異顯著（P<0.05），以處理A（3.0 μmol·L-1 MoO2-4+ 0.06 mmol·L-1 Zn2+ +0.4 mmol·L-1 BO3-3+ 0.2 μmol·L-1 Co2+ + 0.4 μmol·L-1 Cu2+ + 10 μmol·L-1 I-+ 0.2 mmol·L-1Mn2+ ）最高（P<0.05），達(dá)476.97 mg·L-1，是對照的1.66倍。因此，認(rèn)為處理A試驗(yàn)組為微量元素優(yōu)化組合提高培養(yǎng)細(xì)胞生物合成黃酮類化合物的最適培養(yǎng)基NT2。

2.3 2，4-D對懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長和黃酮類化合物累積的影響

如圖4所示，2，4-D在0.0～1.0 mg·L-1時(shí)，對大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞黃酮生物合成有顯著影響。培養(yǎng)基中添加2，4-D降低了培養(yǎng)細(xì)胞的干重收獲量和黃酮產(chǎn)量;低濃度2，4-D（0.1 mg·L-1）有助于黃酮生物合成，含量為2.08%，是對照的1.10倍（P<0.05），但此時(shí)黃酮產(chǎn)量僅為464.62 mg·L-1，與對照差異不顯著。

2.4 KT對懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長和黃酮類化合物累積的影響

如圖5所示，KT在0.0～1.0 mg·L-1時(shí)，對懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長影響顯著，黃酮含量顯著升高，黃酮產(chǎn)量差異不顯著。細(xì)胞生長量先增后降，KT質(zhì)量濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞干重收獲量最大，為25.56 g·L-1。隨培養(yǎng)基中KT濃度的增加，細(xì)胞黃酮含量隨之增加，黃酮含量達(dá)2.00%～2.07%，是對照的1.06～1.10（P<0.05）;KT在0.1～1.0 mg·L-1時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞黃酮產(chǎn)量先升后降，但變化不顯著，KT質(zhì)量濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，黃酮產(chǎn)量最高，達(dá)517.87 mg·L-1。

2.5 GA3對懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長和黃酮類化合物累積的影響

如圖6所示，GA3在0.0～0.5 mg·L-1時(shí)，對懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長和黃酮生物合成產(chǎn)生了顯著的影響。細(xì)胞生長量先增后降，GA3質(zhì)量濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞干重收獲量最大，為25.29 g·L-1，比對照高了0.12 g·L-1，差異不顯著;低質(zhì)量濃度GA3（0.1 mg·L-1）有助于黃酮生物合成，含量高達(dá)2.05%，是對照的1.08倍（P<0.05），隨培養(yǎng)基中GA3質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞黃酮含量顯著降低;GA3為0.1 mg·L-1時(shí)，黃酮產(chǎn)量最高，達(dá)516.06 mg·L-1，是對照1.08倍（P<0.05），繼續(xù)增加GA3質(zhì)量濃度，培養(yǎng)細(xì)胞的黃酮產(chǎn)量顯著降低。

3 討論與結(jié)論

植物細(xì)胞培養(yǎng)黃酮化合物受培養(yǎng)基組分、激素、物理?xiàng)l件等多方面因素的影響，目前沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)條件適于所有的植物細(xì)胞培養(yǎng)，這就需要研究者對不同植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮的最佳條件進(jìn)行研究[12]。培養(yǎng)基組分是植物培養(yǎng)細(xì)胞生長和次生代謝物積累中最直接、最重要的影響因素[19]。本文主要圍繞提高大花金挖耳培養(yǎng)細(xì)胞黃酮產(chǎn)量的大量、微量元素及激素優(yōu)化組合進(jìn)行討論分析。

相對于高鹽培養(yǎng)基MS和低鹽培養(yǎng)基White，NT屬于中等無機(jī)鹽培養(yǎng)基，其中的N、P、Ca、Mg、K等大量元素對大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長和黃酮合成均產(chǎn)生了影響。本研究選取前期試驗(yàn)[17]中對大花金挖耳細(xì)胞培養(yǎng)有顯著貢獻(xiàn)的NH+4、NO-3、K等大量元素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化組合，發(fā)現(xiàn)當(dāng)NT培養(yǎng)基中NH+4、NO-3、K+濃度依次為15.46、14.10、19.10 mmol·L-1時(shí)，顯著提高了黃酮含量和產(chǎn)量，分別為1.48%和363.95 mg·L-1，分別是對照的1.21和1.26倍?？梢姡{(diào)節(jié)NT中總氮濃度或銨態(tài)氮與硝態(tài)氮的比例可顯著促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞生長和黃酮生物的合成，這與水母雪蓮、銀杏、草莓等植物細(xì)胞培養(yǎng)黃酮的研究相似[12]。分析國槐槐角[15]、茶條槭[20]、玫瑰茄[21]細(xì)胞培養(yǎng)次生代謝物中氮源消耗的規(guī)律，不難推斷，氮源消耗的前期主要用于細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸等結(jié)構(gòu)性組分的合成，后期主要用于各種與次級代謝相關(guān)酶的合成[22];銨態(tài)氮與細(xì)胞生長密切相關(guān)，硝態(tài)氮與黃酮、紫杉醇、沒食子酸等次生代謝物的合成相關(guān)[15，20-23];鉀離子在細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)揮著“離子泵”的作用，對細(xì)胞滲透壓及營養(yǎng)物質(zhì)的吸收具有調(diào)節(jié)作用[24]。

微量元素是植物細(xì)胞酶的組成分子或活化劑，具有重要的生理生化作用[18，25-26]。筆者前期系統(tǒng)研究了NT培養(yǎng)基中MoO2-4、Zn2+、BO3-3、Co2+、Cu2+、I-、Mn2+、Fe2+等8種微量元素單一因素對大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長和黃酮合成的影響，本研究選取前期試驗(yàn)中對大花金挖耳細(xì)胞培養(yǎng)有顯著貢獻(xiàn)的MoO2-4、Zn2+等微量元素進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化組合，發(fā)現(xiàn)大量元素優(yōu)化后的NT培養(yǎng)基中MoO2-4、 Zn2+、BO3-3、Co2+、Cu2+ 、I-、Mn2+等微量元素濃度依次為3.0 μmol·L-1、 0.06 mmol·L-1、0.4 mmol·L-1、0.2 μmol·L-1、0.4 μmol·L-1、10 μmol·L-1、0.2 mmol·L-1時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞的黃酮含量和產(chǎn)量可分別達(dá)到1.89%和476.97 mg·L-1，較優(yōu)化大量元素的NT1培養(yǎng)基再次提高了黃酮的含量和產(chǎn)量?？梢?，微量元素含量雖少，但調(diào)節(jié)NT中微量元素濃度及其配比仍可顯著促進(jìn)細(xì)胞生長和黃酮生物的合成，說明微量元素在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，既獨(dú)立發(fā)揮各自生理生化作用，同時(shí)又與大量元素及其他微量元素相互作用協(xié)同促進(jìn)了大花金挖耳懸浮細(xì)胞的光合、呼吸、氮代謝等初生代謝，并提升了培養(yǎng)細(xì)胞黃酮類等化合物的生物合成能力。

不同種類、不同濃度的植物生長素和細(xì)胞分裂素及其配比對植物細(xì)胞的生長和次生代謝產(chǎn)物的積累有著顯著的影響[27]。本研究以NT+1.0 mg·L-1 NAA + 0.2 mg·L-1 6-BA為基本培養(yǎng)基，在大量元素和微量元素優(yōu)化組合的基礎(chǔ)上，再分別添加2，4-D、KT和GA3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低質(zhì)量濃度2，4-D（0.1 mg·L-1）有助于黃酮生物合成，2，4-D抑制黃酮的生物合成，添加2，4-D抑制了細(xì)胞的生長，總體降低了黃酮的產(chǎn)量，這與2，4-D在許多植物細(xì)胞培養(yǎng)中抑制次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)生的研究結(jié)論相一致[27]。另外，低質(zhì)量濃度KT（0.1 mg·L-1）有助于細(xì)胞的生長，高質(zhì)量濃度（>0.1 mg·L-1）抑制了細(xì)胞的生長，附加KT（0.1～1.0 mg·L-1）黃酮含量增加顯著，0.2 mg·L-1 KT時(shí)，黃酮產(chǎn)量最高達(dá)517.87 mg·L-1，是對照1.09倍，可見附加不同濃度KT對細(xì)胞生長和黃酮合成效果不同，這與KT在紅花細(xì)胞生長及紅花色素合成中發(fā)揮的作用相似[28]。低濃度GA3促進(jìn)了細(xì)胞生長和黃酮的生物合成，高濃度GA3抑制了細(xì)胞黃酮的合成，這可能與GA3抑制查爾酮合成酶有關(guān)[29-30]。

總之，在前期研究的基礎(chǔ)上，通過NT培養(yǎng)基中大量元素、微量元素逐步優(yōu)化及添加激素等試驗(yàn)手段，大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞黃酮含量和產(chǎn)量顯著高于對照，影響順序?yàn)椋捍罅?、微量元素?yōu)化，并附加KT的NT培養(yǎng)基>大量、微量元素優(yōu)化的NT培養(yǎng)基>大量元素優(yōu)化的NT培養(yǎng)基，黃酮含量大小依次是：2.05%、1.89%、1.48%，黃酮產(chǎn)量大小依次為：517.87、476.97、363.95 mg·L-1。本研究系統(tǒng)優(yōu)化了NT培養(yǎng)基中對大花金挖耳細(xì)胞培養(yǎng)有促進(jìn)作用的相關(guān)因子，初步篩選得到了黃酮生產(chǎn)培養(yǎng)基，為實(shí)現(xiàn)大花金挖耳細(xì)胞培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)黃酮提供了試驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]中國科學(xué)院中國植物志編委會.中國植物志[M]，北京：科學(xué)出版社，1989：295-296.

Chinese Academy of Sciencer Chinese Flora Writers.Flora of China[M].Beijing：Sciene Press，1989：295-296.（in Chinese）

[2]謝宗萬，余友芩.全國中草藥名鑒[M].上海：人民衛(wèi)生出版社，1996：756.

XIE Z W，YU Y Q.Appraisal of Traditional Chinese Medical Herbs in China[M].Beijing：People′s Medical Publishing House，1996：756.（in Chinese）

[3]李玉平，慕小倩，馮俊濤，等.幾種菊科植物殺菌活性的初步研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，30（1）：68-72.

LI Y P，MU X Q，F(xiàn)ENG J T，et al.Primary study on the fungicidal activity of compositae plants[J].Journal of Northwest A&F University （Natural Science Edition），2002，30（1）：68-72.（in Chinese）

[4]郝雙紅，祝木金，馮俊濤，等.35種菊科植物除草活性初步測定[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，32（5）：22-26.

HAO S H，ZHU M J，F(xiàn)ENG J T，et al.Preliminary study on the herbicidal activity of composite plants[J]. Journal of Northwest A&F University （Natural Science Edition），2005，32（5）：22-26.（in Chinese）

[5]張宏利，馮俊濤，陳安良，等.秦嶺山區(qū)204種植物對粘蟲生物活性測定[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，19（3）：92-94.

ZHANG H L，F(xiàn)ENG J T，CHEN A L，et al.Insecticidal activity of 204 plants to Mythimna separata in the Qinling Mountains[J]. Journal of Northwest Forestry University，2004，19（3）：92-94.（in Chinese）

[6] KIM M R，LEE S K，KIM C S，et al. Phytochemical constituents of Carpesium macrocephalum[J].Archives of Pharmacal Research， 2004， 27（10）：1029-1033.

[7]王俊儒，胡志彬，馮俊濤，等.大花金挖耳不同部位揮發(fā)油化學(xué)成分比較分析[J].西北植物學(xué)報(bào)，2008，28（6）：1239-1245.

WANG J R，HU Z B，F(xiàn)ENG J T，et al.Chemical constituents of essential oil from different parts of Carpesium macrocephalum[J].Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，2008，28（6）：1239-1245.（in Chinese）

[8]周明，沈勇根，朱麗琴，等.植物黃酮化合物生物合成、積累及調(diào)控的研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2016，37（18）：216-221.

ZHOU M，SHEN Y G，ZHU L Q，et al.Research progress on biosynthesis，accumulation and regulation of flavonoids in plants[J].Food Research and Development，2016，37（18）：216-221.（in Chinese）

[9]楊才瓊，楊文鈺，劉江.植物類黃酮的化學(xué)生態(tài)學(xué)意義[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2018，30（11）：2009-2016.

YANG C Q，YANG W Y，LIU J.Advances on chemical ecology of plant flavonoids[J].Natural Product Research and Development，2018，30（11）：2009-2016.（in Chinese）

[10]陳月華，朱艷，張翔，等.植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中次生代謝產(chǎn)物積累的研究進(jìn)展[J].中國野生植物資源，2016，35（3）：41-48.

CHEN Y H，ZHU Y，ZHANG X，et al.Research progress in plant cell suspension culture for production of secondary metabolites[J].Chinese Wild PlantResources，2016，35（3）：41-48.（in Chinese）

[11]李玉平，姜在民，馮俊濤，等.不同培養(yǎng)條件對大花金挖耳愈傷組織生長及黃酮產(chǎn)量的影響[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，22（3）：286-290.

LI Y P，JIANG Z M，F(xiàn)ENG J T，et al.Effects of different cultural conditionson callus growth and flavonoid yield of Carpesium macrocephalum[J].Journal ofNuclear Agricultural Sciences，2008，22（3）：286-290.（in Chinese）

[12] 李燕，王春蘭，郭順星，等.植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)物中黃酮類物質(zhì)積累影響因素的研究進(jìn)展[J].中國藥學(xué)雜志，2006，41（9）：651-655.

LI Y，WANG C L，GUO S X，et al.Advances in studies on factors affecting the accumulation of flavonoids in plant tissues and cell cultures[J].Chinese Journal of Pharmaceuticals，2006，41（9）：651-655.（in Chinese）

[13]郭佳祺.蒺藜懸浮培養(yǎng)體系建立及不同因子對黃酮醇含量影響[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

GUO J Q.Establishment of Tribulus terrestris L.suspension culture system and effects of different factors on flavonoids content [D].Changchun：Jilin Agricultural University，2017.（in Chinese）

[14]趙德修，汪沂，趙敬芳.不同理化因子對雪蓮培養(yǎng)細(xì)胞中黃酮類形成的影響[J].生物工程學(xué)報(bào)，1998（3）：24-29.

ZHAO D X，WANG Y，ZHAO J F.Effect of Physical and Chemical factors on callus growth and flavonoids biosynthesis in the callus cultures of Saussurea medusa[J].Chinese Journal of Biotechnology，1998（3）：24-29.（in Chinese）

[15]陳紅賢，于笑笑，王晨陽，等.國槐槐角種胚細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的動力學(xué)研究[J].浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2016， 33（2）： 272-279.

CHEN H X，YU X X，WANG C Y，et al.Kinetics of Sophora japonica embryo cells in a suspension culture system

[J].Journal of Zhejiang A & F University，2016， 33（2）：272-279.（in Chinese）

[16]李玉平，龔寧，王永宏，等.大花金挖耳細(xì)胞懸浮系的建立及黃酮類化合物的產(chǎn)生[J].食品科學(xué)，2010，31（21）：239-243.

LI Y P，GONG N，WANG Y H，et al.Optimization of cell suspension culture of Carpesium macrocephalum for flavonoid production[J]. Food science，2010，31（21）：239-243.（in Chinese）

[17]李玉平，張妮，陳曉旭，等.大花金挖耳細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及其胞內(nèi)代謝產(chǎn)物化感潛力的研究[J].草地學(xué)報(bào)，2010，18（5）：708-713.

LI Y P，ZHANG N，CHEN X X，et al.Allelopathy potential of intracellular secondary metabolic products and cell suspension culture of Carpesium macrocephalum Franch.et Sav[J]. Acta Agrestla Sinica，2010，18（5）：708-713.（in Chinese）

[18]李玉平，李惟雄.微量元素對大花金挖耳細(xì)胞生長和黃酮含量積累的影響[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，34（1）：1-8.

LI Y P，LI W X.Effects of trace elements in culture medium on growth， flavonoids content and intracellular metabolite allelopathy of Carpesium macrocephalum[J].Fujian Journal of Agricultural Sciences，2019，34（1）：1-8.（in Chinese）

[19]朱至清.植物細(xì)胞工程[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：20，209.

ZHU Z Q.Plant Cell Engineering[M].Beijing：Chemical Industry Press，2003：20，209.（in Chinese）

[20]董杰，詹亞光，任健.茶條槭懸浮培養(yǎng)的動力學(xué)[J].林業(yè)科學(xué)，2012，48（10）：18-23.

DONG J，ZHAN Y G，REN J.Kinetics in suspension culture of Acer ginnala[J].Scientia Silvae Sinicae，2012，48（10）：18-23.（in Chinese）

[21]阮茜，郭勇.磷限制培養(yǎng)中玫瑰茄細(xì)胞生長及花青素形成動力學(xué)[J].華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1999，27（1）：86-90.

RUAN Q，GUO Y.Kinetics on growth of Roselle cells and anthocyanin formation in phosphorus limiting cultures[J].Journal of South China University of Technology（Natural Science Edition），1999，27（1）：86-90.（in Chinese）

[22]李春，李娟，沈慧慧，等.肉蓯蓉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的代謝動力學(xué)研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2007，19（2）：193-197.

LI C，LI J，SHEN H H，et al.Metabolic Kinetics dynamic of suspension culture of Cistanche deserticola[J].Natural

Product Research and Development，2007，19（2）：193-197.（in Chinese）

[23]仇燕，王麗，劉子會，等.對數(shù)期繼代對南方紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)動力學(xué)的影響[J].中草藥，2003，34（9）：849-852.

QIU Y，WANG L， LIU Z H，et al.Effect of subculture at logarithmic phase on kinetics of cell cultures of Taxus chinensis var. mairei[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs，2003，34（9）：849-852.（in Chinese）

[24]郭志剛，都軍，劉瑞芝.紫杉細(xì)胞生長過程與營養(yǎng)物質(zhì)消耗的動態(tài)研究[J].清華大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，5（42）：599-602.

GUO Z G，DU J，LIU R Z.Kinetic investigation of Taxus cell growth and nutrient consumption[J].J Tsinghua Univ （Natural Science Edition），2002，5（42）：599-602.（in Chinese）

[25]李琰，張朝紅，馬希漢.培養(yǎng)基成分對杜仲愈傷組織生長及次生代謝產(chǎn)物含量的影響[J].武漢植物學(xué)研究，2004，22（4）：359-363.

LI Y，ZHANG Z H，MA X H.Effects of medium concentration on callus growth and secondary metabolites of Eucommia ulmoides[J].Journal of Wuhan Botanical Research，2004，22（4）：359-363.（in Chinese）

[26]鄭成木，劉進(jìn)平.熱帶亞熱帶植物微繁殖[M].長沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，2001：59-66.

ZHENG C M，LIU J P.Micropropagation of Tropical and Subtropical Plants[M].Changsha：Hunan Science and Technology Press，2001：59-66.（in Chinese）

[27]呂春茂，范海延，姜河，等.植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)合成次生代謝物質(zhì)研究進(jìn)展[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，12（1）：1-7.

LV C M，F(xiàn)AN H Y，JIANG H.Research Advances on synthesis of secondary Metabolities by plant cell culture[J].Journal of Yunnan Agricultural University，2007，12（1）：1-7.（in Chinese）

[28]GAO W Y， FAN L， PAEK K Y. Yellow and red pigment production by cell cultures of Safflower （Carthamus tinctorius L.） in a Bioreactor [J]. Plant Cell Tiss Organ Culture， 2000， 60： 95-100.

[29]王軍妮，黃艷紅，牟志美，等.植物次生代謝物黃酮類化合物的研究進(jìn)展[J].蠶業(yè)科學(xué)，2007（3）：499-505.

WANG J N，HUANG Y H，MOU Z M，et al.Research progress on flavonoid of the plant secondary metabolites[J].Canye Kexue，2007，（3）：499-505.（in Chinese）

[30]李琳玲，程華，程水源，等.銀杏查爾酮合成酶基因啟動子（GbCHSP）調(diào)控元件及功能分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2010，37（12）：1919-1928.

LI L L，CHENG H，CHEN S Y，et al.Regulatory elements and functional analysis of chalcone synthase gene promoter from Ginkgo biloba L[J].Acta Horticulturae Sinica，2010，37（12）：1919-1928.（in Chinese）

（責(zé)任編輯：張 梅）