中藥強(qiáng)心方對(duì)超負(fù)荷所致大鼠心力衰竭模型的療效研究

楊明

摘要 目的：探究對(duì)于超容量負(fù)荷作用下的大鼠心力衰竭模型使用中藥強(qiáng)心方在急性期與慢性期的相關(guān)影響。方法：取45只SD大鼠隨機(jī)均分為A組（假手術(shù)組）、B組（單純?cè)殳浶呐K超負(fù)荷組）與C組（心臟超負(fù)荷+強(qiáng)心方觀察組），制備超容量負(fù)荷大鼠心力衰竭模型，并給予相應(yīng)的處理與干預(yù)措施，急性期（3 d）進(jìn)行氧化應(yīng)激、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）等生物化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)，遠(yuǎn)期（8周）評(píng)價(jià)左心室的大小與功能。結(jié)果：B組大鼠的左心室肥大細(xì)胞密度顯著高于A組與C組（P<0.05）;B組大鼠肥大細(xì)胞密度增加與基質(zhì)金屬蛋白酶2（Matrix Metalloprotein2，MMP2）活性增加呈顯著相關(guān)性;容量超載使大鼠心肌氧化應(yīng)激水平顯著升高，B組平均水平顯著高于A組與C組（P<0.05），心室的重量顯著大于A組（P<0.05）。與A組大鼠比較，右心室與肺組織重量亦顯著增加，然而C組顯著降低左右心室與肺組織的重量增加;與B組比較，C組大鼠整體的體質(zhì)量降低（P<0.05）。與A組大鼠V0數(shù)據(jù)比較，B組大鼠存在顯著左心室擴(kuò)張（P<0.05）;強(qiáng)心方治療能夠顯著降低左心室容積增加的程度（P<0.05）;心肌順應(yīng)性結(jié)果顯示強(qiáng)心方可使其增加程度顯著降低，與B組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;收縮期的壓力-容積數(shù)據(jù)提示隨心臟超負(fù)荷的持續(xù)加載可見心室內(nèi)收縮顯著受抑制（P<0.05），C組大鼠收縮功能與A組基本一致。結(jié)論：本研究中結(jié)果初步顯示對(duì)于超容量負(fù)荷作用下誘導(dǎo)的大鼠心力衰竭動(dòng)物模型，強(qiáng)心方具有明顯的功能性心臟保護(hù)作用，并且這種保護(hù)作用可能與MMP活性與氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制相關(guān)。

關(guān)鍵詞 強(qiáng)心方;中藥;大鼠;心力衰竭;超負(fù)荷

Abstract Objective：To explore the effects of applyingQiangxin Formula of traditional Chinese medicine（TCM）in acute and chronic phases of rat heart failure models under overload.Methods：A total of 45 Sprague-Dawley（SD）rats were randomly divided into 3 groups：group A（sham operation），group B（simple ostomy cardiac overload）and group C（cardiac overload+Qiangxin Formula treatment）.The model of heart failureinduced by overload was made and the corresponding treatment were applied.Biochemical indexes such as oxidative stress and matrix metalloproteinases were detected in the acute phase（3 days），and the left ventricular size and function were evaluated in the long term（8 weeks）.Results：The density of left ventricular mast cells in the group B was significantly higher than that in the group A and C（P<0.05）.The increase of mast cell density in the group B was significantly correlated with the increase of MMP-2 activity.The level of oxidative stress was increased significantlyunderoverload，in which the average level of the groupB was significantly higher than that of the group Aand C.The weight of the ventricle was significantly higher than that of the groupA; the weight of the right ventricle and the lung tissue was also significantly increased compared with the groupA，however，Qiangxin Formula could significantly reduce the weight gain of the left and right ventricles and lungs; Qiangxin Formula could reduce the overall body weight of the rat compared with the group B（P<0.05）.Compared with the V0 data of the group A，there was significant left ventricular dilatation in the group B; Qiangxin Formula could significantly reduce the increase of left ventricular volume（P<0.05）; myocardial compliance showed that Qiangxin Formula could reduceitsincrease（P<0.05 compared withthe group B）.The systolic pressure-volume data suggested that the ventricular contraction was significantly inhibited as the cardiac overload was continuously loading（P<0.05），and thecontractive functionsof rats in the groupC andA were basically the same.Conclusion：The preliminary results of the study showed that Qiangxin Formula has a significant functional cardioprotective effect on rat models of heart failure induced by overload，and this protective effect may be related to the inhibition of MMP activity and oxidative stressreaction.

Key Words Qiangxin Formula; TraditionalChinese medicine; Rat; Heart failure model; Overload

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.07.012

容量超負(fù)荷是心力衰竭病程進(jìn)展中主要的伴隨現(xiàn)象，患者出現(xiàn)心力衰竭的臨床癥狀前，容量超負(fù)荷即已存在，其可導(dǎo)致室壁張力增加，不僅左室形狀改變（由橢圓變?yōu)閳A形，心肌重塑）導(dǎo)致二尖瓣關(guān)閉不全，還可形成心內(nèi)膜下心肌缺血，導(dǎo)致心肌壞死/凋亡和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的激活，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[1-3]。目前研究顯示，肥大細(xì)胞在心室不良重塑中發(fā)揮著重要作用，在心臟超負(fù)荷作用下急性期可伴隨發(fā)生心臟肥大細(xì)胞密度增加，基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloprotein，MMP）激活及膠原蛋白的降解，因此對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒的有效抑制能夠在一定程度上減輕心室的擴(kuò)張與功能障礙[4-5]。強(qiáng)心方是主要針對(duì)心力衰竭的中藥方，以利水消腫、益氣溫陽為根本，通脈活血，臨床中對(duì)改善心力衰竭患者生命質(zhì)量具有積極的作用[6-7]，但對(duì)于其在大鼠模型中的應(yīng)用和急性期細(xì)胞分子生物學(xué)水平上的改變目前研究尚少，因此本文以此為目的展開研究，以期為臨床診療和科研提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 研究選用8周雄性SD大鼠（購自北京華阜康生物科技股份有限公司，醫(yī)動(dòng)字第20-050號(hào)），總計(jì)45只，于我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)飼養(yǎng)條件為：溫度20～24 ℃，濕度約為50% ～60%，光照與否循環(huán)時(shí)間為12 h，滅菌飼料和飲用水由動(dòng)物中心統(tǒng)一提供并由飼養(yǎng)者自行用。

1.1.2 藥物 葶藶子（批號(hào)：201806）、大棗（批號(hào)：201805）、甘遂（批號(hào)：201804）、桂枝（批號(hào)：201803）和芫花（批號(hào)：2018002）均購自市中藥材批發(fā)市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為十字花科葶藶屬植物葶藶的種子，鼠李目鼠李科棗屬植物的果實(shí)、大戟科大戟屬植物的根、樟科植物肉桂的干燥嫩枝及瑞香科植物芫花的干燥花蕾。中藥強(qiáng)心方組成：葶藶子40 g、大棗40 g、甘遂2 g、桂枝2 g、芫花2 g;藥物制備：使用砂鍋水煎熬制藥物，加水600 mL，用竹筷攪動(dòng)后侵泡0.5 h，然后大火熬制15 min后，中小火熬制50 min后去渣，藥物濃縮為1.5 g～3.0 g/mL，放置4 ℃冰箱備用。

1.1.3 試劑與儀器 T400型動(dòng)物用多普勒超聲（美國Transonic Systems公司），Gel Doc XR圖像分析儀（美國BioRad公司），BL-420F生物功能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)/生物信號(hào)采集與分析系統(tǒng)/多道生理記錄儀（成都泰盟軟件有限公司）。異氟醚（上海倍卓生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20180011，4%濃度下進(jìn)行誘導(dǎo)，維持濃度2.5%，供氧平衡），鹽酸丁丙諾非（天津藥物研究院藥業(yè)有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號(hào)：20180201，國藥準(zhǔn)字H12020275，皮下注射）;戊巴比妥鈉（北京華業(yè)寰宇化工有限公司，批哈01703，腹腔注射），丙二醛（批號(hào)：20180102）、MMP-2（批號(hào)：20181112）和MMP-9（批號(hào)：20181201）試劑盒，均購自上海信帆生物科技有限公司。甲醇（批號(hào)：201803）、乙酸（批號(hào)：201804）均購自市化學(xué)試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 心臟超負(fù)荷誘導(dǎo)：按照先前文獻(xiàn)中報(bào)道的方法建立大鼠腹主動(dòng)脈腔靜脈瘺，將大鼠麻醉后腹腔打開，顯現(xiàn)主動(dòng)脈與下腔靜脈，將18號(hào)針插入腎動(dòng)脈下腹主動(dòng)脈內(nèi)并沿著內(nèi)側(cè)壁深入至腔靜脈內(nèi)造瘺，將針取出后穿刺部位使用氰基丙烯酸鹽粘合劑密封，如果可見腔靜脈內(nèi)搏動(dòng)的含氧血液則提示造瘺成功。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)對(duì)每只大鼠進(jìn)行稱重與麻醉，打開腹腔，直視下查看瘺管是否暢通;行氣管切開術(shù)，將大鼠連接至呼吸機(jī)上，開胸暴露心臟，使用動(dòng)物用多普勒超聲探頭檢測(cè)心輸出量，之后分離心臟評(píng)估左心室大小和功能;功能評(píng)估后去除心房和大血管，分離并稱重剩余的左右心室與室間隔部分組織;將食管與氣管剪掉后胸膜表面吸干測(cè)量肺濕重。本研究所有操作與相關(guān)內(nèi)容均經(jīng)我院倫理委員會(huì)知情同意。將制好的模型大鼠分為均分B組（單純?cè)殳浶呐K超容量負(fù)荷組）與C組（心臟超容量負(fù)荷+強(qiáng)心方觀察組），實(shí)施假手術(shù)的大鼠為A組（假手術(shù)組），每組各15只。

1.2.2 給藥方法 3組動(dòng)物均在制模成功后，第2天給藥。C組動(dòng)物給予中藥強(qiáng)心方煎劑灌胃治療，給藥劑量為30 g/100 g，將藥物濃縮膏稀釋為1 mL含有3 g生藥量，給藥容積為：10 mL/100 g，1次/d。A組合B組動(dòng)物給與等量蒸餾水灌胃，連續(xù)給藥8周。給藥期間實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均自由飲水并用普通飼料喂養(yǎng)。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1）急性期分子生物學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)：a.肥大細(xì)胞密度：福爾馬林固定的左心室組織切片進(jìn)行PE染色，其可選擇性地對(duì)肥大細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分;以mm2區(qū)域?yàn)閱卧?jì)數(shù)其中的肥大細(xì)胞數(shù)量;b.氧化應(yīng)激反應(yīng)監(jiān)測(cè)：脂質(zhì)過氧化的程度，通過檢測(cè)氧化應(yīng)激的副產(chǎn)物丙二醛（MDA）來間接反映，先前研究已證實(shí)脂質(zhì)過氧化物與硫代巴比妥酸的反應(yīng)是測(cè)定組織中氧化應(yīng)激較為敏感的指標(biāo);c.MMP活性檢測(cè)：每例標(biāo)本內(nèi)提取30 μg蛋白質(zhì)在含8%SDS-PAGE的非還原條件下進(jìn)行明膠電泳，之后將凝膠置于2.5%Triton X-100中室溫下洗滌2次，每次30 min;在37 ℃下底物緩沖液中溫育18 h（50 mmol/L Tris-HCl，0.15 mol/L NaCl，5.0 mmol/L CaCl2和0.05% Brij 35，pH=7.5）;孵育結(jié)束后凝膠使用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色并后續(xù)使用甲醇、乙酸脫色;使用圖像分析儀測(cè)量明膠溶解帶，并從中測(cè)定MMP-2和MMP-9活性，A組設(shè)定為100%。2）遠(yuǎn)期心室大小與功能評(píng)價(jià)：體外通過血液灌注分離的心臟評(píng)估大鼠左心室的體積和功能，取出心臟之前首先結(jié)扎頸動(dòng)脈，將導(dǎo)管插入胸主動(dòng)脈并用絲線固定，盡快進(jìn)行冠狀動(dòng)脈的逆行灌注，取出心臟并予以固定后通過支持大鼠頸動(dòng)脈的動(dòng)脈血加壓逆行灌注分離的大鼠心臟，使冠狀動(dòng)脈灌注壓力維持在（100±5）mmHg，通過導(dǎo)管將靜脈血流返回至支持大鼠內(nèi);左心室內(nèi)的壓力通過連接乳膠氣球的壓力傳感器通過二尖瓣深入至左心室內(nèi)進(jìn)行連續(xù)記錄。當(dāng)心臟形成穩(wěn)定的等容收縮，記錄使左心室終末舒張壓（EDP）為0 mmHg時(shí)的球囊體積（V0），后逐漸增大球囊使左心室的EDP達(dá)到25 mmHg，排空球囊并重復(fù)相同操作3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較使用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性期（3 d超負(fù)荷）評(píng)價(jià) 組織采集之前直視下顯示急性期大鼠模型的造瘺效果均較為滿意，B組大鼠的左心室肥大細(xì)胞密度為（4.4±0.6）個(gè)細(xì)胞/mm2，顯著高于A組（2.5±0.3）個(gè)細(xì)胞/mm2、C組（2.2±0.2）個(gè)細(xì)胞/mm2（P<0.05），提示強(qiáng)心方治療可有效阻止瘺管所誘導(dǎo)的心臟肥大細(xì)胞密度增加。

各組大鼠左心室脂質(zhì)過氧化程度MDA濃度檢測(cè)，結(jié)果顯示容量超載使大鼠心肌氧化應(yīng)激水平顯著升高，B組平均為（0.38±0.11）nM/mg，顯著高于A組（0.18±0.08）nM/mg與C組（0.16±0.07）nM/mg水平;如圖1所示B組大鼠肥大細(xì)胞密度增加與MMP-2活性增加呈顯著相關(guān)性，62 kDa條帶顯示B組（170.9±16.4）ng/mL比A組（101.2±15.8）ng/mL增加68.9%（P<0.05），C組（99.6±8.4）ng/mL中無顯著性改變，因此MMP-2活性可被強(qiáng)心方所抑制;MMP-9活性在各組內(nèi)呈現(xiàn)多樣化，B組（147.5±12.8）ng/mL亦顯著高于A組（106.5±25.0）ng/mL，C組則顯著偏低（68.4±6.9）ng/mL，組間比較顯示強(qiáng)心方能夠使其活性顯著降低（P<0.05）。見圖1。

2.2 遠(yuǎn)期（8周超負(fù)荷）評(píng)價(jià)

2.2.1 心臟結(jié)構(gòu)改變?cè)u(píng)估 B組的心臟體積宏觀上顯著大于其他2組。大鼠的平均心輸出量增加4～5倍;B組與C組大鼠造瘺后左心室的重量顯著高于A組;與A組大鼠比較，B組與C組大鼠右心室與肺組織重量亦顯著增加，然而強(qiáng)心方治療能夠顯著降低左右心室與肺組織的重量增加（P<0.05）;與B組比較，C組大鼠整體體質(zhì)量降低（P=0.0.06）。見圖2、表1。

2.2.2 左心室功能性分析 與A組大鼠V0數(shù)據(jù)比較，B組大鼠存在顯著左心室擴(kuò)張（P<0.05）;強(qiáng)心方治療能夠顯著降低左心室容積增加的程度（P<0.05）;心肌順應(yīng)性體現(xiàn)在使EDP由0 mmHg上升至25 mmHg的體積變化，結(jié)果顯示B組大鼠最高（均P<0.05），提示強(qiáng)心方可使其增加程度顯著降低，與B組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;收縮期的壓力-容積數(shù)據(jù)提示隨心臟超負(fù)荷的持續(xù)加載可見心室內(nèi)收縮顯著受抑制（P<0.05），C組大鼠收縮功能與A組基本一致。見表2。

3 討論

目前臨床上高血壓與高血脂的發(fā)病率逐漸增加，大部分患者均存在不良生活習(xí)慣并且無規(guī)律藥物治療病史，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化后發(fā)生的心肌缺血與梗死使得局部的心肌細(xì)胞發(fā)生不可逆性損害，從而影響正常的心臟神經(jīng)電生理功能而發(fā)生心肌重塑與心力衰竭[8]。充血性心力衰竭是最常見的類型，患者的日?；顒?dòng)嚴(yán)重受到影響，同時(shí)合并其他系統(tǒng)的并發(fā)癥使得治療難度較大，單純的西醫(yī)藥物治療存在患者耐受性差及療效不理想等[9-10]，對(duì)新型治療方案的研究因此具有十分重要的意義。中醫(yī)在這方面具有較為豐富的經(jīng)驗(yàn)，其中強(qiáng)心方是以十棗湯為基礎(chǔ)的中西醫(yī)結(jié)合的專門用于改善心力衰竭患者臨床癥狀的湯劑，起效較快，是一種攻補(bǔ)結(jié)合的中藥復(fù)方制劑，具有泄臟腑水濕、清熱平喘、消腫利水以及消胸伏飲痰瘀的效果，并且大棗性甘溫，可輔助養(yǎng)心安神、補(bǔ)氣益血，彌補(bǔ)了其他藥物性情峻烈所對(duì)正氣產(chǎn)生的損傷。研究[11]結(jié)果顯示強(qiáng)心方對(duì)于多種心臟疾病模型均具有較為明顯的保護(hù)作用，對(duì)去除卵巢的雌性大鼠在長(zhǎng)期心臟超負(fù)荷作用下使用強(qiáng)心方能夠有效削弱左心室的肥厚與擴(kuò)張，維持心臟功能，預(yù)防充血性心力衰竭（CHF）。本研究中除了評(píng)價(jià)強(qiáng)心方對(duì)慢性心臟超負(fù)荷下的相關(guān)影響以外，還對(duì)急性期的相關(guān)機(jī)制和改變進(jìn)行初步的探究與觀察，結(jié)果均于已報(bào)道的結(jié)果一致，體現(xiàn)出強(qiáng)心方的積極作用。

急性期的反應(yīng)主要體現(xiàn)在肥大細(xì)胞的激活與密度的增加，導(dǎo)致心肌MMP活性增加與細(xì)胞外膠原蛋白的降解，后者可直接影響心室的擴(kuò)張。本研究中顯示未觀察組大鼠的左心室肥大細(xì)胞密度顯著增肌，并且伴隨MMP-2活性增加以及膠原的明顯降解，這些由于心臟超負(fù)荷所引發(fā)的不利事件均可被強(qiáng)心方不同程度進(jìn)行抑制，造瘺所誘發(fā)的結(jié)構(gòu)性的心室擴(kuò)張同時(shí)減弱，與諸文獻(xiàn)的報(bào)道結(jié)果基本一致[12-13]，強(qiáng)心方能夠預(yù)防肥大細(xì)胞脫粒后的膠原蛋白降解。

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是充血性心力衰竭與心室重塑發(fā)展過程中的關(guān)鍵機(jī)制[14]，未觀察組內(nèi)持續(xù)的超負(fù)荷使心肌的氧化應(yīng)激水平顯著增加，而強(qiáng)心方觀察組則無明顯變化，文獻(xiàn)報(bào)道氧化應(yīng)激可激發(fā)肥大細(xì)胞激活，與MMPs的機(jī)制基本類似。因此強(qiáng)心方抑制超負(fù)荷所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可能是其心臟保護(hù)的主要機(jī)制之一。MDA方法確定氧化應(yīng)激的一個(gè)缺點(diǎn)在于無法確定其來源，此外藥物可通過基因組與非基因組途徑的調(diào)控影響心血管及相關(guān)的系統(tǒng)效應(yīng)，研究中難以逐一進(jìn)行評(píng)價(jià)分析。相關(guān)的功能性受體目前已被證實(shí)存在于多種心肌細(xì)胞中，包括心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞、血管平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞[15]，因此除了肥大細(xì)胞與細(xì)胞外膠原蛋白機(jī)制以外可能還存在其他的調(diào)節(jié)機(jī)制關(guān)于強(qiáng)心方對(duì)心室重塑的影響。例如已知的對(duì)血管內(nèi)皮及一氧化氮合酶活性的影響，其中一氧化氮已顯示能夠抑制非心臟肥大細(xì)胞激活和肥大細(xì)胞依賴性炎性反應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示，未觀察組大鼠發(fā)生雙心室的肥大，左心室擴(kuò)張，對(duì)超容量負(fù)荷室腔的順從性增加，使用強(qiáng)心方干預(yù)后能夠顯著減輕這種不良重塑的程度。部分研究顯示對(duì)于卵巢切除患者的心肌病理性肥厚強(qiáng)心方能夠產(chǎn)生一定的積極影響[15];強(qiáng)心方治療能夠顯著降低大鼠在心臟超負(fù)荷與心肌梗死下的心肌肥厚程度，與之相類似地，對(duì)于自發(fā)性高血壓性心力衰竭使用強(qiáng)心方能夠有效阻止高血壓的進(jìn)展，心肌肥厚的形成及心力衰竭的發(fā)生。收縮期大鼠壓力-容積曲線所顯示的室腔內(nèi)收縮力改變是未治療大鼠心室過分舒張與順從性改變的主要原因，強(qiáng)心方正是由于可有效阻止心室腔收縮性從而避免了心臟的不良特征改變。另一方面本研究中還顯示強(qiáng)心方能夠有效減緩為期8周的心肌超負(fù)荷下的肺水腫程度，同時(shí)維持心臟的收縮功能，因此提示強(qiáng)心方能夠有效阻止心肌失代償及心力衰竭的進(jìn)展。強(qiáng)心方通過對(duì)一氧化氮合酶的影響，降低血管的通透性，尤其見于肺組織內(nèi)，雖然長(zhǎng)期來看強(qiáng)心方對(duì)心室重構(gòu)的抑制作用是較為明顯的，但在急性期使用強(qiáng)心方是否對(duì)長(zhǎng)期的預(yù)后有利目前仍不明確[17]。結(jié)構(gòu)性心室擴(kuò)張程度的降低表示心臟面臨容量負(fù)荷增加的情況下調(diào)節(jié)能力增加，從而使心臟保持足夠的功能，防止負(fù)擔(dān)過重所致的心力衰竭加重。

綜上所述，本研究結(jié)果初步顯示對(duì)于超容量負(fù)荷作用下誘導(dǎo)的大鼠心力衰竭動(dòng)物模型，強(qiáng)心方具有明顯的功能性心臟保護(hù)作用，并且這種保護(hù)作用可能與MMP活性與氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制相關(guān)。

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（2018-12-02收稿 責(zé)任編輯：芮莉莉）