不同重金屬脅迫對鹽生草種子萌發(fā)特性的影響

胡娜，李葆春，姚立蓉，汪軍成，邊秀秀，侯靜靜，司二靜，楊軻，孟亞雄，馬小樂，王化俊*

(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室，甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，甘肅 蘭州730070;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州730070;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070)

近年來隨著城市化、工業(yè)化進(jìn)程不斷加快，重金屬在土壤中大量富集，其不但破壞生態(tài)環(huán)境，還影響植物生長發(fā)育，進(jìn)入食物鏈最終危害人體健康[1-2]。目前全世界約1×107hm2的土壤遭受重金屬污染，我國受重金屬污染的耕地約占總耕地面積的1/6，由重金屬污染導(dǎo)致的作物產(chǎn)量下降超過1×108t·yr-1，造成經(jīng)濟損失達(dá)2×1010元[3-4]。因此，充分利用土地資源，進(jìn)行經(jīng)濟有效的土壤重金屬污染修復(fù)，對改善生態(tài)環(huán)境，保證農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和人類健康具有重要意義。

重金屬是指密度大于5的金屬元素，主要包括鎘(Cd)、砷(As)、鉛(Pb)、鉻(Cr)、汞(Hg)以及有一定毒性的銅(Cu)、鋅(Zn)、鎳(Ni)等[5]。重金屬污染具有富集性、不可逆性和難治理等特點，目前國際上治理土壤重金屬污染的方法主要有物理化學(xué)修復(fù)、微生物修復(fù)、植物修復(fù)和農(nóng)業(yè)措施修復(fù)等[6-8]。相較于其他修復(fù)方法，植物修復(fù)法具有保護(hù)土壤微環(huán)境、耗費低、適應(yīng)性強、無二次污染物等優(yōu)點[9]，因此，通過種植綠色植物來隔離或解毒土壤重金屬污染似乎有望比傳統(tǒng)技術(shù)更經(jīng)濟，更有效，更環(huán)保。近年來，植物修復(fù)土壤重金屬污染的研究方興未艾，例如景天科的東南景天(Sedum alfredii)是一種已被鑒定的鋅和鎘超積累植物，能在富含鋅、鎘、鎳的土壤上正常生長[10]。相對甜土植物，鹽生植物在進(jìn)化上形成特殊的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和離子運輸調(diào)控機制[11]，在土壤鹽堿地改良、重金屬污染修復(fù)等方面發(fā)揮著重要作用[12]。

種子在不同重金屬脅迫狀況下的萌發(fā)特性以及萌發(fā)期對不同重金屬的耐性程度直接影響著植株的生長發(fā)育，因此，植物的早期生長階段是決定重金屬對植物毒性作用的重要指標(biāo)。當(dāng)植物體內(nèi)重金屬過量、超過某一臨界值，會對植物產(chǎn)生脅迫作用，導(dǎo)致其體內(nèi)代謝紊亂，生長發(fā)育受到抑制，研究表明，Zn2+對紫花苜蓿(Medicago sativa)種子萌發(fā)和幼苗生長具有“低促高抑”的毒物刺激效應(yīng)，且對幼苗根生長的抑制程度大于幼苗芽的生長[13]。Cu2+導(dǎo)致野生賴草(Leymus secalinus)胚芽中MDA含量升高，對胚芽產(chǎn)生損害作用[14]。高濃度Cd2+、Zn2+對煙草(Nicotiana tabacum)種子造成氧化損傷，使其抗氧化酶活性降低，代謝紊亂[15]。禾本科植物在高濃度Cu2+、Cd2+和Pb2+脅迫下出現(xiàn)“無根苗”[16]。

鹽生植物鹽生草(Halogeton glomeratus)，隸屬藜科(Chenopodiaceae)鹽生草屬(Halogeton)，是一年生草本植物。為干旱、半干旱區(qū)廣布的荒漠物種，主要生長于蒙古、中亞及我國西北旱區(qū)等地[17-18]，地上多分枝的肉質(zhì)化莖、葉組織具有耐鹽抗旱、富集重金屬等特性。本實驗室前期研究表明，鹽生草通過將鹽分區(qū)隔在液泡內(nèi)而具有較強的耐鹽特性，其不但在鹽漬地生長良好，且為金屬礦區(qū)優(yōu)勢種群[19-20]，是理想的進(jìn)行土壤重金屬污染修復(fù)的野生資源，但關(guān)于鹽生草萌發(fā)期對不同重金屬的耐性還未知。鑒于此，本研究從修復(fù)重金屬污染土壤角度出發(fā)，以我國西北旱區(qū)特色鹽生植物鹽生草為材料，模擬土壤重金屬污染，對鹽生草種子進(jìn)行不同類型及濃度的重金屬脅迫，研究其在不同重金屬脅迫下的種子萌發(fā)及幼苗生長特性，并結(jié)合聚類分析和主成分分析，探索其萌發(fā)期對不同重金屬的耐受性以及各指標(biāo)的相對貢獻(xiàn)率，以期進(jìn)一步提高鹽生草利用價值，并為重金屬污染土壤改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018年7-9月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室麥類遺傳育種實驗室進(jìn)行，供試材料為2017年采集于甘肅省民勤縣戈壁灘的鹽生草種子，千粒重為0.38 g，室溫干燥保存。

1.2 供試試劑

硫酸銅(CuSO4·5H2O)、硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)、氯化鎳(NiCl2·6H2O)、硫酸鎘(Cd3O12S3·8H2O)、氯化鉛(PbCl2)，次氯酸鈉溶液(NaOCl，有效氯≥8.0%)，2，3，5-三苯基四唑氯化物(2，3，5-Triphenyl-2H-tetrazolium chloride，TTC)，乙酸乙酯，95%、75%乙醇，所用試劑均為分析純試劑。

1.3 試驗方法

1.3.1 濃度設(shè)置 前期對鹽生草種子進(jìn)行萌發(fā)預(yù)試驗，根據(jù)萌發(fā)情況篩選不同重金屬濃度梯度，最終設(shè)定濃度梯度分別為:Cu2+(0.00，0.10，0.30，0.50，1.00，3.00，5.00，10.00，20.00，30.00，50.00，100.00 mmol·L-1);Zn2+和 Ni2+(0.00，0.10，0.30，0.50，1.00，3.00，5.00，10.00，20.00，30.00，50.00 mmol·L-1);Cd2+(0.00，0.05，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00，4.00 mmol·L-1);Pb2+(0.00，0.10，0.30，0.50，1.00，3.00，5.00，8.00，10.00 mmol·L-1)。用蒸餾水進(jìn)行上述溶液配制。

1.3.2 種子消毒 選取適量均勻一致飽滿的種子于2 m L離心管中，用75%酒精準(zhǔn)確消毒30 s，蒸餾水清洗3次，再用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為2%的次氯酸鈉溶液反復(fù)顛倒清洗1.5 min后，用蒸餾水清洗4次，再于離心管中吸入2 m L蒸餾水，迅速倒于經(jīng)滅菌的含有兩層濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中，待用[21]。

1.3.3 萌發(fā)試驗 選取經(jīng)高壓滅菌的含有2層定性濾紙(90 mm)的玻璃培養(yǎng)皿作為鹽生草種子的發(fā)芽床，移液槍吸取5 m L不同濃度的重金屬溶液于上述培養(yǎng)皿中，用消毒的鑷子挑取處理后的鹽生草種子，將其整齊排列在上述培養(yǎng)皿中，每盤培養(yǎng)皿60粒種子，每個處理5次生物學(xué)重復(fù)，以蒸餾水為對照，記號筆標(biāo)記，封口膜封口。將培養(yǎng)皿置于12 h光照/12 h黑暗，溫度25℃，光照強度4000 Lx，相對濕度80%的環(huán)境下進(jìn)行萌發(fā)試驗[22]。

1.3.4 發(fā)芽指標(biāo)測定 以種子露白為標(biāo)準(zhǔn)[18]，按7 d發(fā)芽率，3 d發(fā)芽勢進(jìn)行發(fā)芽種子數(shù)統(tǒng)計，計算種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢。計算公式如下:

發(fā)芽率=(露白種子粒數(shù)/供試種子粒數(shù))×100%(7 d)

發(fā)芽勢=(露白種子粒數(shù)/供試種子粒數(shù))×100%(3 d)

1.3.5 株高掃描 用Win RHIZO圖像掃描儀對生長7 d的幼苗進(jìn)行株高掃描，每盤培養(yǎng)皿隨機選取6株幼苗，平均值作為株高指標(biāo)。

1.3.6 生物量測定 以每盤培養(yǎng)皿為一個單位，將所有發(fā)芽種子于蒸餾水中輕輕漂洗數(shù)秒鐘，以除去幼苗表面黏附的多余重金屬離子，后將幼苗置于干凈的定性濾紙上，待水分吸干后測量鮮重(fresh weight，F(xiàn)W)，然后將幼苗裝入信封袋，置于60℃ 烘箱中，3 d后用1/10000分析天平進(jìn)行干重(dry weight，DW)稱量。

1.3.7 根系活力測定 將新鮮植株(0.2 g)浸泡于2.5 m L的100 mmol·L-1磷酸鉀緩沖液(p H 7.0)和2.5 m L的0.4%TTC中，黑暗下于25℃溫浴13 h，除去TTC溶液，用5 m L蒸餾水洗滌根系，將減少的TTC用5 m L 95%乙醇代替在60℃下提取30 min，并在485 nm處讀取吸光度[23]。

1.3.8 重金屬含量測定 以各重金屬的不同處理濃度為一個單位，將發(fā)芽幼苗放入干凈研缽中，將其研至粉末狀，裝入PCR管，用原子吸收分光光度法[24]進(jìn)行不同重金屬離子含量測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用Genstat 19th Edition(64 bit)軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，采用Duncan’s多重比較的方法統(tǒng)計處理間差異顯著性(P＜0.05)，所有結(jié)果由平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(means±standard error)表示;通過SPSS 20.0進(jìn)行聚類分析和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu2+對鹽生草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

低濃度Cu2+對鹽生草種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢無明顯影響，高濃度則產(chǎn)生抑制作用(表1)。發(fā)芽率在3.00 mmol·L-1Cu2+脅迫下顯著低于對照(P＜0.05)，而發(fā)芽勢在Cu2+≥1.00 mmol·L-1時較對照顯著降低(P＜0.05)，二者均在最大脅迫濃度(100.00 mmol·L-1)下達(dá)到最低值，此時發(fā)芽率為81.67%，較對照降低11.64%，發(fā)芽勢為77.50%，較對照降低15.25%。

對生長7 d的鹽生草幼苗進(jìn)行株高、干鮮重、根系活力和組織內(nèi)離子含量測定，發(fā)現(xiàn)隨處理濃度的升高，株高、干鮮重和根系活力均呈降低趨勢，組織內(nèi)Cu2+含量呈上升趨勢。其中，低濃度Cu2+(0.10 mmol·L-1)對株高和鮮重抑制作用顯著(P＜0.05)，當(dāng)Cu2+濃度為3.00 mmol·L-1時，株高和鮮重分別較對照降低78.24%和79.03%(圖1a，b);低濃度Cu2+(0.10～1.00 mmol·L-1)處理對幼苗干重?zé)o顯著影響(P＞0.05)，高濃度Cu2+(3.00～100.00 mmol·L-1)則產(chǎn)生抑制作用(圖1b);根系活力呈現(xiàn)與株高、鮮重相同的趨勢，即隨處理濃度的升高先迅速降低后趨于穩(wěn)定，在3.00 mmol·L-1Cu2+脅迫下僅為對照的18.02%(圖1c);在低濃度Cu2+(0.10～1.00 mmol·L-1)脅迫下，組織內(nèi)Cu2+含量保持較低水平，而3.00 mmol·L-1Cu2+處理下迅速上升至15.67 g·kg-1，在30.00 mmol·L-1時達(dá)到最大值(圖1d)，說明在重金屬Cu2+脅迫下，各指標(biāo)的降低與組織內(nèi)Cu2+含量有一定的相關(guān)性。

圖1 Cu2+對鹽生草株高、鮮重、干重、根系活力及離子含量的影響Fig.1 Effect of Cu2+on the plant height,fresh weight,dry weight,root activity and ion content of H.glomeratus

為進(jìn)一步明確鹽生草幼苗對重金屬Cu2+的耐性程度，對以上種子萌發(fā)和幼苗生長指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，得出在歐式距離為15時，將Cu2+處理下的12個濃度梯度聚為兩類，其中以0.00～1.00 mmol·L-1為第Ⅰ類，3.00～100.00 mmol·L-1為第Ⅱ類(圖2);對1.00 mmol·L-1Cu2+處理下的各指標(biāo)進(jìn)行主成分分析(表2)，提取了2個主成分，主成分1貢獻(xiàn)率為62.73%，主成分2貢獻(xiàn)率為37.27%，累計貢獻(xiàn)率達(dá)100.00%，其中主成分1在鮮重上具有最高載荷(0.99)，其次是根系活力(0.97)，主成分2在株高上具有最高載荷(0.95)，考慮主成分1的貢獻(xiàn)率約為主成分2貢獻(xiàn)率的2倍，因此生物量可首選為評價鹽生草萌發(fā)期耐重金屬Cu2+的重要參數(shù)。

2.2 Zn2+對鹽生草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

在Zn2+脅迫下，鹽生草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢隨重金屬濃度的升高呈現(xiàn)先緩慢上升而后降低的趨勢，均在0.30 mmol·L-1時達(dá)到最大值，分別為93.93%和93.44%，但與對照差異不顯著(P＞0.05)(表1);在不同濃度的Zn2+脅迫下，鹽生草種子發(fā)芽率較高，且差異不顯著(P＞0.05)，分布在93.93%～89.23%，與低濃度Zn2+(0.30 mmol·L-1)處理相比，發(fā)芽勢在Zn2+濃度高于10.00 mmol·L-1時受到顯著性抑制(P＜0.05)，且于50.00 mmol·L-1Zn2+脅迫下抑制效果最明顯，發(fā)芽勢為84.69%，相比0.30 mmol·L-1Zn2+處理降低8.75%。

表2 不同重金屬對鹽生草影響的主成分分析Table 2 Principal components of the effects of different heavy metals on H.glomeratus

圖2 不同濃度Cu2+對鹽生草影響的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of the effects of different concentrations of Cu2+on H.glomeratus

Zn2+對鹽生草幼苗生長影響較小，各指標(biāo)在低濃度Zn2+脅迫下與對照差異不顯著(P＞0.05)，高濃度則產(chǎn)生明顯抑制作用，其中，株高、鮮重和根系活力均于0.50 mmol·L-1Zn2+時開始顯著低于對照(P＜0.05)，當(dāng)Zn2+濃度為1.00 mmol·L-1時，上述指標(biāo)分別降低為對照的68.34%、76.66%和80.52%，3.00 mmol·L-1Zn2+處理下為對照的44.04%、54.29%和59.10%，而干重受其影響小，僅在最大Zn2+濃度(50.00 mmol·L-1)下顯著低于對照(P＜0.05)(圖3a，b，c);通過測定離子含量，發(fā)現(xiàn)組織內(nèi)Zn2+含量隨處理濃度的升高呈上升趨勢，1.00 mmol·L-1Zn2+脅迫下其體內(nèi)Zn2+含量為3.31 g·kg-1，3 mmol·L-1Zn2+脅迫下顯著升高，后呈直線上升趨勢(圖3d)。

圖3 Zn2+對鹽生草株高、鮮重、干重、根系活力及離子含量的影響Fig.3 Effect of Zn2+on the plant height,fresh weight,dry weight,root activity and ion content of H.glomeratus

對以上數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)在歐式距離為20時將Zn2+處理下的不同濃度聚為兩類，以0.00～3.00 mmol·L-1為第Ⅰ類，5.00～50.00 mmol·L-1為第Ⅱ類(圖4)，說明鹽生草幼苗在一定濃度的Zn2+脅迫下可以正常生長，但當(dāng)Zn2+≥5.00 mmol·L-1時，植株生長受到影響;對3.00 mmol·L-1Zn2+處理下的各指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果顯示提取了1個主成分，其特征值為5.58，貢獻(xiàn)率高達(dá)92.95%，在發(fā)芽勢和發(fā)芽率上具有最高載荷，均為0.99(表2)，可見發(fā)芽勢和發(fā)芽率可首選為評價鹽生草萌發(fā)期耐重金屬Zn2+的重要參數(shù)。

圖4 不同濃度Zn2+對鹽生草影響的聚類分析Fig.4 Cluster analysis of the effects of different concentrations of Zn2+on H.glomeratus

2.3 Ni2+對鹽生草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

發(fā)芽率、發(fā)芽勢在整個Ni2+處理濃度范圍內(nèi)均低于對照，但低濃度脅迫下與對照差異均不顯著(P＞0.05)，僅在高濃度時產(chǎn)生抑制作用(表1)。發(fā)芽率僅在Ni2+脅迫濃度≥10.00 mmol·L-1時與對照差異顯著(P＜0.05)，后處理間無明顯差異;而發(fā)芽勢在3.00 mmol·L-1Ni2+處理下顯著低于對照(P＜0.05)，后隨處理濃度的升高緩慢降低，當(dāng)Ni2+濃度為50.00 mmol·L-1時，發(fā)芽勢為83.70%，相比對照降低9.44%。由此可知，重金屬Ni2+對鹽生草種子萌發(fā)影響較小，在整個脅迫濃度下均保持較高的發(fā)芽勢和發(fā)芽率，種子活力較高。

Ni2+對株高、干鮮重和根系活力均有明顯抑制作用，隨處理濃度的升高先顯著降低后趨于平緩(圖5a，b，c)。在0.10～1.00 mmol·L-1Ni2+處理下，株高從對照的91.13% 降低至66.43%，鮮重從對照的84.09%降低至52.40%，株高和鮮重均在3.00 mmol·L-1Ni2+下降低最為顯著(P＜0.05)，分別為對照的33.18%和26.97%，后處理間差異不顯著(P＞0.05);干重在0.50 mmol·L-1Ni2+處理下較對照顯著降低(P＜0.05)，之后無明顯變化;根系活力隨Ni2+濃度的升高呈降低趨勢，在1.00和3.00 mmol·L-1Ni2+處理下分別為對照的71.66%和46.30%;組織內(nèi)Ni2+含量在低濃度(0.10～1.00 mmol·L-1Ni2+)處理下相對較低，且增加緩慢，3.00 mmol·L-1Ni2+脅迫下急速上升至11.92 g·kg-1，約為1.00 mmol·L-1Ni2+處理下的4倍，后隨處理濃度的增大緩慢升高(圖5d)。

圖5 Ni2+對鹽生草株高、鮮重、干重、根系活力及離子含量的影響Fig.5 Effect of Ni2+on the plant height,fresh weight,dry weight,root activity and ion content of H.glomeratus

聚類分析結(jié)果顯示，在歐式距離為15時，將Ni2+處理下的11個濃度梯度聚為兩類，0.00～1.00 mmol·L-1為第Ⅰ類，3.00～50.00 mmol·L-1為第Ⅱ類(圖6)，說明當(dāng)Ni2+濃度≥3.00 mmol·L-1時會嚴(yán)重影響鹽生草種子萌發(fā)和幼苗的正常生長;對1.00 mmol·L-1Ni2+處理下的各指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，提取了2個主成分，主成分1特征值為4.36，貢獻(xiàn)率為72.60%，其在發(fā)芽勢上具有最大載荷，主成分2特征值為1.64，貢獻(xiàn)率為27.40%，累計貢獻(xiàn)率達(dá)100.00%，其在發(fā)芽率上具有最高載荷(表2)，而發(fā)芽勢和發(fā)芽率均屬于種子萌發(fā)指標(biāo)，所以在重金屬Ni2+脅迫下，種子萌發(fā)越整齊，萌發(fā)數(shù)越多，則表現(xiàn)為對其耐性越強。

圖6 不同濃度Ni2+對鹽生草影響的聚類分析Fig.6 Cluster analysis of the effects of different concentrations of Ni2+on H.glomeratus

2.4 Cd2+對鹽生草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

由表3可知，Cd2+對鹽生草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢有不同程度的影響，其中，發(fā)芽率在低濃度(0.05～0.10 mmol·L-1Cd2+)時略高于對照，但差異不顯著(P＞0.05)，當(dāng)Cd2+≥1.00 mmol·L-1時，發(fā)芽率顯著降低，其中在4.00 mmol·L-1Cd2+脅迫下達(dá)最低，為86.02%，較對照降低6.49%，發(fā)芽勢在0.20 mmol·L-1Cd2+處理下較對照顯著降低(P＜0.05)，后處理間差異不顯著，在最大濃度(4.00 mmol·L-1Cd2+)時達(dá)最低，為84.33%，較對照降低7.95%;說明重金屬Cd2+在一定程度上抑制了鹽生草種子活力，使其萌發(fā)率降低。

表3 Cd2+和Pb2+對鹽生草種子萌發(fā)的影響Table 3 Effects of Cd2+and Pb2+on the seed germination of H.glomeratus(%)

Cd2+脅迫下，株高和干鮮重隨處理濃度的升高而降低，低濃度Cd2+(0.05～0.10 mmol·L-1)顯著(P＜0.05)抑制了幼苗生長和生物量的積累，0.20 mmol·L-1Cd2+處理下抑制效果最明顯，株高、鮮重、干重分別較對照降低47.01%，65.04%和39.52%，后隨處理濃度的升高，株高和鮮重有不同程度的降低，但干重在不同水平間差異不顯著(P＞0.05)，與種子發(fā)芽指標(biāo)相比，幼苗生長對重金屬Cd2+的濃度更敏感(圖7a，b)。對根系活力測定發(fā)現(xiàn)，低濃度處理下幼苗根系仍保持較高活力，0.20 mmol·L-1Cd2+脅迫下迅速降低為對照的一半(49.26%)，后隨處理濃度的升高而降低(圖7c);組織內(nèi)Cd2+含量在低濃度(0.05～0.10 mmol·L-1)脅迫下相對較低，0.20 mmol·L-1Cd2+處理下迅速升高至3.78 g·kg-1，后以劑量依賴性方式增大，當(dāng)處理濃度≥2.00 mmol·L-1時組織內(nèi)Cd2+含量緩慢降低趨于穩(wěn)定(圖7d)，說明鹽生草對Cd2+具有一定耐性，且能富集一定濃度的Cd2+于體內(nèi)。

圖7 Cd2+對鹽生草株高、鮮重、干重、根系活力及離子含量的影響Fig.7 Effect of Cd2+on the plant height,fresh weight,dry weight,root activity and ion content of H.glomeratus

對以上指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)在歐式距離為15時將Cd2+處理下的濃度聚為兩類，0.00～0.10 mmol·L-1為第Ⅰ類，0.20～4.00 mmol·L-1為第Ⅱ類(圖8)，說明鹽生草幼苗在Cd2+濃度≤0.10 mmol·L-1時能維持正常生長，高于此濃度則植株生長代謝受阻，進(jìn)一步對0.10 mmol·L-1Cd2+處理下的萌發(fā)指標(biāo)和幼苗生長指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，提取了2個主成分，主成分1貢獻(xiàn)率為56.59%，在發(fā)芽勢和干重上具有較高載荷，主成分2貢獻(xiàn)率為43.41%，在鮮重上載荷最高，兩者累計貢獻(xiàn)率為100.00%(表2)，說明在0.10 mmol·L-1Cd2+脅迫下，種子萌發(fā)越整齊，生物量積累越多，則表現(xiàn)為對重金屬Cd2+耐性越強。

2.5 Pb2+對鹽生草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

Pb2+脅迫下，鹽生草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢隨處理濃度的升高呈先升高后降低的趨勢，0.10～1.00 mmol·L-1Pb2+處理下，發(fā)芽率和發(fā)芽勢略高于對照，但差異不顯著(P＞0.05)，均在1.00 mmol·L-1Pb2+脅迫下達(dá)到最大值94.82%，分別較對照增加2.54%和3.67%，3.00 mmol·L-1Pb2+處理下顯著降低(P＜0.05)，后隨處理濃度的升高，各處理間差異不顯著(P＞0.05)(表3)。由此可見，一定濃度的Pb2+更有利于鹽生草種子萌發(fā)。

在Pb2+脅迫下，株高、干鮮重和根系活力隨處理濃度的升高先平穩(wěn)變化后顯著降低(P＜0.05)。其中，株高、干重和根系活力在0.10 mmol·L-1Pb2+處理下達(dá)到最大值，鮮重在0.50 mmol·L-1Pb2+處理下達(dá)到最大值，1.00 mmol·L-1Pb2+處理下，株高、根系活力分別為對照的70.60%和89.15%(圖9a，c)，而干鮮重和對照差異不顯著(P＞0.05)，但在3.00 mmol·L-1Pb2+脅迫下時各指標(biāo)均顯著降低(P＜0.05)，株高、鮮重和根系活力分別為對照的42.25%、53.58%和50.22%，此時組織內(nèi)Pb2+含量也迅速升高(圖9d)，相比較而言，根系活力對高濃度Pb2+更敏感，可能是因為環(huán)境中過多的Pb2+首先富集在植物根部，對其造成嚴(yán)重毒害，導(dǎo)致根系活力迅速降低，從而進(jìn)一步影響其他生理代謝，最終影響植物生長。

圖8 不同濃度Cd2+對鹽生草影響的聚類分析Fig.8 Cluster analysis of the effects of different concentrations of Cd2+on H.glomeratus

圖9 Pb2+對鹽生草株高、鮮重、干重、根系活力及離子含量的影響Fig.9 Effect of Pb2+on the plant height,fresh weight,dry weight,root activity and ion content of H.glomeratus

根據(jù)鹽生草萌發(fā)和幼苗生長指標(biāo)，對以上處理濃度進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)在歐式距離為15時，將其聚為兩類，以0.00～1.00 mmol·L-1為第Ⅰ類，以3.00～10.00 mmol·L-1為第Ⅱ類(圖10)，說明鹽生草幼苗在一定濃度Pb2+脅迫下能保持正常生長，濃度過高幼苗生長則受到顯著抑制;進(jìn)一步對1.00 mmol·L-1Pb2+處理下的各指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)提取了1個主成分，其特征值為5.76，貢獻(xiàn)率高達(dá)92.93%，其中發(fā)芽勢和發(fā)芽率載荷最高(表2)，說明發(fā)芽勢和發(fā)芽率可作為評價鹽生草萌發(fā)期耐重金屬Pb2+的重要參數(shù)。

圖10 不同濃度Pb2+對鹽生草影響的聚類分析Fig.10 Cluster analysis of the effects of different concentrations of Pb2+on H.glomeratus

3 討論

Cu作為植物所必需的微量元素之一，植物體內(nèi)Cu2+含量過多、過少都會對植物生長產(chǎn)生影響，過少會影響植物體內(nèi)多種氧化還原反應(yīng)和光合電子傳遞，過多則會對植物產(chǎn)生銅鹽毒害，導(dǎo)致植株生長緩慢，甚至枯萎死亡[25]。本研究結(jié)果表明，低濃度Cu2+對鹽生草種子萌發(fā)影響較小，高濃度則產(chǎn)生抑制作用，這與Zhou等[26]研究結(jié)果一致。株高、干鮮重和根系活力均隨Cu2+處理濃度的升高而降低，且于3.00 mmol·L-1時降低最為顯著，各幼苗生長指標(biāo)均低于對照的40%，同時組織內(nèi)Cu2+含量在低濃度脅迫下相對較低，3.00 mmol·L-1Cu2+脅迫下則迅速升高，這可能是因為溶液中Cu2+最先接觸植物根部，致使根尖細(xì)胞分裂速度減慢，達(dá)到某一臨界值時對植物根系產(chǎn)生嚴(yán)重毒害，導(dǎo)致其活力降低，從而嚴(yán)重抑制幼苗生長和生物量積累[27]。聚類分析和主成分分析表明，鹽生草在Cu2+≥3.00 mmol·L-1脅迫下生長受到嚴(yán)重抑制，生物量可首選為評價鹽生草萌發(fā)期耐重金屬Cu2+的重要參數(shù)。

Zn是植物生長發(fā)育必需的微量營養(yǎng)元素，在維持和穩(wěn)定生物膜功能完整性，保證葉綠素的形成以及6大類功能酶(氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶和合成酶)活性等方面發(fā)揮著重要作用[28]。研究表明，植物體內(nèi)一定濃度的Zn2+對植物生長發(fā)育有促進(jìn)作用，當(dāng)超過某一臨界值時便會對植物產(chǎn)生毒害，主要體現(xiàn)在萌發(fā)受阻，生長抑制，光合、呼吸作用減弱等方面[29]。本研究中，在低濃度Zn2+脅迫下，鹽生草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、株高、干鮮重和根系活力均高于對照，高濃度則產(chǎn)生抑制作用，這與陳俊任等[30]研究結(jié)果相似。萌發(fā)和幼苗生長指標(biāo)在5.00 mmol·L-1Zn2+處理下均低于對照的55%，同時組織內(nèi)Zn2+含量在此時也顯著升高，說明各指標(biāo)的降低與組織內(nèi)Zn2+含量有一定相關(guān)性，可能是體內(nèi)過多的Zn2+破壞了植物代謝平衡，導(dǎo)致生長受阻。聚類分析和主成分分析結(jié)果表明，鹽生草在Zn2+≥5.00 mmol·L-1脅迫下無法正常生長，發(fā)芽指標(biāo)可首選為評價鹽生草萌發(fā)期耐重金屬Zn2+的重要參數(shù)。值得注意的是，與Ni2+和Cu2+相比，各萌發(fā)指標(biāo)和幼苗生長指標(biāo)在Zn2+脅迫下最高，其次是Ni2+和Cu2+，說明鹽生草對這3種金屬的耐性順序為:Zn2+＞Ni2+＞Cu2+，有研究證明，相比其他金屬，Zn2+對植物的毒害作用最弱[30-31]，這可能是因為Zn2+參與多種代謝途徑，植物對Zn2+的需求量大于其他微量元素，此外，金屬的價態(tài)不同也會導(dǎo)致其對植物的毒害強度不同，高濃度Se能顯著抑制煙草的農(nóng)藝性狀，且Se(VI)抑制效果大于Se(IV)，同時煙草體內(nèi)Se(VI)積累量明顯高于Se(IV)[32]。

Ni對植物新陳代謝起著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)，Ni2+毒害會嚴(yán)重抑制植物側(cè)根的形成及生長，影響其對水分和養(yǎng)分的吸收，進(jìn)一步引起植物生理代謝失調(diào)[33]。本研究中，發(fā)芽率和發(fā)芽勢在低濃度Ni2+(0.00～1.00 mmol·L-1)處理下與對照差異不顯著，高濃度時受到顯著抑制作用，這與龔磊等[34]的研究結(jié)果一致。株高、鮮重和根系活力隨處理濃度的增大而降低，在3.00 mmol·L-1Ni2+處理下差異最顯著，各指標(biāo)均低于對照的46%，同時，組織內(nèi)Ni2+含量在此脅迫濃度下升高幅度最大，結(jié)合聚類分析和主成分分析結(jié)果，推測鹽生草幼苗在Ni2+≥3.00 mmol·L-1脅迫下無法正常生長，發(fā)芽指標(biāo)可首選為評價鹽生草萌發(fā)期耐重金屬Ni2+的重要參數(shù)。

在所有重金屬中，Cd是最受關(guān)注的元素之一，在大量關(guān)于Cd毒性的研究中，已報道Cd2+對不同物種的毒性最大。本研究中，低濃度Cd2+延緩鹽生草種子萌發(fā)，高濃度則產(chǎn)生抑制作用，可能是因為Cd2+抑制種子內(nèi)儲藏淀粉和蛋白質(zhì)的分解，從而影響種子萌發(fā)所需的物質(zhì)和能量，致使種子萌發(fā)受阻[35]。植物受Cd2+毒害時，線粒體和葉綠體受到破壞，導(dǎo)致呼吸、光合作用減弱，葉片發(fā)黃，生物量下降[36]。本研究中，鹽生草幼苗在0.00～0.10 mmol·L-1Cd2+脅迫下能維持正常生長，0.20 mmol·L-1處理下，株高、鮮重和根系活力均迅速降低，同時Cd2+含量也急速升高，這說明鹽生草幼苗在Cd2+≥0.20 mmol·L-1時生長嚴(yán)重受阻，而強耐Cd2+植物柳枝稷(Panicum virgatum)在0.01 mmol·L-1Cd2+脅迫下便受到顯著抑制[37]，說明鹽生草對Cd2+的耐性更強，這可能是因為鹽生草長期在干旱、半干旱環(huán)境下生長，其體內(nèi)形成特殊的重金屬離子解毒機制，存在與重金屬轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因。聚類和主成分分析結(jié)果表明，生物量可首選為評價鹽生草萌發(fā)期耐重金屬Cd2+的重要參數(shù)。

Pb是植物非必需元素，其在植物體內(nèi)的過量積累不但會對植株產(chǎn)生毒害，進(jìn)入食物鏈還會對人體的多個器官和系統(tǒng)造成損傷，是人類可能的致癌物質(zhì)[38]。本研究中，在低濃度Pb2+脅迫下，鹽生草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、株高、干鮮重和根系活力略高于對照，高濃度處理下則顯著降低，且在3.00 mmol·L-1Pb2+處理下各指標(biāo)顯著低于對照的52%，組織內(nèi)Pb2+含量也在低濃度脅迫下相對較低，3.00 mmol·L-1Pb2+脅迫下顯著升高，并具有濃度效應(yīng)，這說明鹽生草對重金屬Pb2+具有一定耐性，而低濃度下出現(xiàn)升高可能是植物對生長環(huán)境變化時產(chǎn)生的一種應(yīng)激反應(yīng)，但這種刺激作用受到濃度的限制[39]。聚類和主成分分析結(jié)果表明，鹽生草在Pb2+≥3.00 mmol·L-1時無法正常生長，發(fā)芽指標(biāo)可首選為評價鹽生草萌發(fā)期耐重金屬Pb2+的重要參數(shù)。

在以上5種不同重金屬脅迫下，與種子萌發(fā)相比，幼苗生長對重金屬濃度更敏感，這可能是因為在充足的氧氣和適宜的溫度環(huán)境下，水分是種子萌發(fā)的另一重要因素，健康種子得到足夠的水分便能迅速發(fā)芽，并且種皮對種胚具有一定的保護(hù)作用，研究發(fā)現(xiàn)，被重金屬處理過的種子，經(jīng)蒸餾水洗滌后其發(fā)芽率高于未洗滌的種子，說明種皮表面對重金屬離子具有一定的黏附作用，可以適當(dāng)減少進(jìn)入種胚的金屬離子[40]。幼苗是植株生長最脆弱的時期，其抗逆能力最弱，種子萌發(fā)后，胚芽和胚根極易受金屬離子毒害[40]，少量的金屬離子脅迫便能使胚芽和胚根生長能力減弱，進(jìn)一步使幼苗生長受阻，這便導(dǎo)致即使在逆境中種子能正常萌發(fā)，也不能成苗。

4 結(jié)論

鹽生草種子萌發(fā)和幼苗生長指標(biāo)隨著重金屬脅迫濃度的提高而呈現(xiàn)出不同程度的下降趨勢，其中，在重金屬Zn2+濃度低于3.00 mmol·L-1，Cu2+、Ni2+和Pb2+濃度低于1.00 mmol·L-1，Cd2+濃度低于0.10 mmol·L-1的處理環(huán)境下，其對鹽生草種子萌發(fā)和幼苗生長的影響較小;發(fā)芽指標(biāo)可首選為評價鹽生草萌發(fā)期耐重金屬Zn2+、Pb2+和Ni2+的重要參數(shù)，生物量可首選為評價鹽生草萌發(fā)期耐重金屬Cu2+和Cd2+的重要參數(shù)。本研究在一定程度上揭示了鹽生草萌發(fā)期對重金屬Cu、Zn、Ni、Cd、Pb的耐性程度，為土壤重金屬污染修復(fù)提供了參考依據(jù)，但關(guān)于其耐重金屬脅迫的生理和分子機制需要進(jìn)一步研究。