浙貝母黑斑病病原真菌的藥敏性研究

溫思思 徐云飛 鄒真瑤 趙偉春

摘要：目的：通過檢測浙貝母黑斑病病原真菌對常用殺菌劑的敏感性，篩選抑菌效果好的藥劑用于田間防治。方法：采用菌絲生長速率法和抑菌圈法測定鏈格孢菌Alternaria alternata和細極鏈格孢菌Alternaria tenuissima的菌絲和孢子對咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、異菌脲的敏感性。結果：經(jīng)生長速率法檢測，咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、異菌脲對鏈格孢菌菌絲的 EC50（concentration for 50% of maximal effect，半最大效應濃度）分別為0.798μg/mL、1.023 μg/mL和0.015 μg/mL，對細極鏈格孢菌的 EC50分別為0.976 μg/mL、0.948 μg/mL和0.014 μg/mL。經(jīng)抑菌圈法檢測，兩種致病菌孢子對咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑和異菌脲的最低敏感濃度分別為3.75μg/mL、2.50μg/mL和31.25μg/mL。結論：異菌脲對鏈格孢菌和細極鏈格孢菌菌絲生長的抑制作用最強，咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑?qū)︽咦用劝l(fā)的抑制率較強。

關鍵詞：浙貝母;黑斑病;鏈格孢菌;細極鏈格孢菌;藥物敏感性

中圖分類號：S435.67 ? ? ? 文獻標識碼：A 文章編號：1003-2177（2019）08-0121-04

浙貝母黑斑病是危害浙貝母的真菌性病害，受害植株提早枯死，地下鱗莖瘦小，造成嚴重減產(chǎn)，多雨年份發(fā)病尤其嚴重[1]。生產(chǎn)上主要以化學防治為主，輔以生物及生態(tài)防治[2]。然而目前還未有防治浙貝母黑斑病的登記藥劑，生產(chǎn)中盲目用藥的現(xiàn)象十分普遍[3， 4]。因此，急需篩選出有效的針對浙貝母黑斑病的高效藥劑。通過對磐安縣浙貝母種植區(qū)的田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、異菌脲是目前常用的3種殺菌劑。本實驗采用生長速率法[5]和抑菌圈法[6-7]對浙貝母黑斑病病原真菌鏈格孢菌和細極鏈格孢菌與咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、異菌脲3種殺菌劑的藥物敏感性進行研究，為浙貝母黑斑病防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鏈格孢菌和細極鏈格孢菌均由本實驗室提供。45%咪鮮胺水乳劑：斯特貝爾作物保護有限公司，批號：HNP37295-C1827;10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑：山東貴合生物科技有限公司，批號：SNA8C00115;500g/L異菌脲懸浮劑：蘇州富美實植物保護劑有限公司，批號：HNP32126-D4092。

1.2 方法

1.2.1 病原真菌懸液制備

將鏈格孢菌、細極鏈格孢菌分別接種于PDA培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)5d。用無菌的PBS洗滌培養(yǎng)基上的菌絲和孢子，收集于50mL離心管中，收集孢子時先用無菌紗布過濾，再用無菌的PBS洗滌離心兩次后計數(shù)，備用。

1.2.2 藥物敏感性檢測

（1）生長速率法：用無菌水將3種試驗藥液配制成7個不同濃度，隨后將PDA培養(yǎng)基冷卻至60℃，并按照藥液：培養(yǎng)基=1：9的配比，配置出新的含藥培養(yǎng)基，空白對照組加等量無菌水的培養(yǎng)基。用無菌打孔器（直徑為9 mm）從生長狀態(tài)良好的菌落邊緣打下菌餅，將菌餅的菌絲面朝下接種到各含藥液及空白對照培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)3～4d。十字交叉法測量各菌落的直徑，每處理重復6次，取平均值（mm），計算菌絲的生長抑制率和EC50（SPSS軟件計算）。

生長抑制率（%）=[（1-（處理菌落直徑-菌餅直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）] ×100

（2）抑菌圈法：吸取孢子懸液100μL，均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上，使用無菌打孔器在平板上打直徑6mm的孔5個，用無菌針頭挑出孔內(nèi)瓊脂。向孔內(nèi)加入100μL一定濃度的藥液（濃度見表1），以無菌水作為空白對照，28℃培養(yǎng)3-4天后觀察抑菌圈大小，每處理重復4次，求平均值（mm）。

2 結果

2.1 生長速率法測定不同藥劑對菌絲生長的影響

結果見圖1-圖3。當咪鮮胺濃度在0.012～12μg/mL時，對鏈格孢菌和細極鏈格孢菌菌絲的抑制率分別為 4.56%～90.01%和5.00%～85.70%，EC50分別為 0.798和0.976μg/mL;當苯甲醚環(huán)唑濃度在 0.0002～200μg/mL時，其對兩種真菌的抑制率分別為3.45%～81.92%和4.12%～82.82%，EC50分別為1.023和0.948μg/mL;當異菌脲濃度在0.00005～50μg/mL時，其對兩種真菌的抑制率分別為15.71%～94.83%和16.19%～94.76%，EC50分別為0.015和0.014μg/mL。3種藥劑對鏈格孢菌的毒力回歸方程的斜率分別為0.9724、0.4602和0.4194，對細極鏈格孢菌的毒力回歸方程的斜率分別為0.9092、0.4679和0.4155。表明異菌脲對鏈格孢菌的毒力活性最強，鏈格孢菌對咪鮮胺的敏感性最好，其次為苯醚甲環(huán)唑。

2.2 抑菌圈法測定不同藥劑對真菌孢子的抑制作用

結果見表1。咪鮮胺在3.75～120μg/mL時，對鏈格孢菌和細極鏈格孢菌的抑菌圈分別為5.25～21.25和5.00～23.25mm，抑制程度均從不敏到極敏;苯醚甲環(huán)唑在2.5～80μg/mL時，對兩種真菌的抑菌圈分別為8.00～26.00和8.50～27.25mm，抑制程度均從低敏到極敏;異菌脲在31.25～1000μg/mL時，抑菌圈分別為9.75～24.25和9.75～23.25mm，抑制程度均從低敏到極敏。因此，苯醚甲環(huán)唑?qū)︽湼矜呔图殬O鏈格孢菌的抑制作用最強，其次為咪鮮胺。

3 討論

從生長速率法和抑菌圈法所測的結果可知，咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、異菌脲等三種藥劑對浙貝母黑斑病病原真菌鏈格孢菌與細極鏈格孢菌的菌絲生長速率與孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用。其中兩種病原真菌對同一種殺菌劑的敏感性差別不大，田間用藥時不必考慮該病的真菌種類。

在生長速率法測定中，EC50值大小為衡量藥劑毒力大小的重要指標，其值越與藥劑的毒力成反比。殺菌劑室內(nèi)毒力測定中EC50值越小、斜率越大，則說明病原菌對藥劑的反應靈敏度越高，即隨著濃度的增加，抑制率明顯增大[8]。本實驗中，就不同殺菌劑而言，異菌脲的EC50小、斜率大，對菌絲生長速率的抑制率最強。

在抑菌圈法的結果中，咪鮮胺與苯醚甲環(huán)唑?qū)︽咦用劝l(fā)的抑制率明顯優(yōu)于異菌脲，此種情況與3種藥劑不同的作用機制有關。咪鮮胺通過抑制麥角甾醇的生物合成，從而使菌體細胞膜功能受破壞而起作用，在植物體內(nèi)有一定的內(nèi)吸傳導作用。苯醚甲環(huán)唑具有保護、治療和內(nèi)吸活性，是甾醇脫甲基化抑制劑，抑制細胞壁甾醇的生物合成，阻止真菌的生長。異菌脲能抑制蛋白激酶，控制許多細胞功能的細胞內(nèi)信號，包括碳水化合物結合進入真菌細胞組分的干擾作用[9-11]。因此可以嘗試將咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑用于鏈格孢屬菌引起的浙貝母黑斑病的預防和早期防治，并建 議在生產(chǎn)中可交替使用苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺，以便更好地控制病害的發(fā)生，減少抗藥性的產(chǎn)生;異菌脲則用于黑斑病的中晚期，以便控制菌絲大量生長。同時3種藥劑毒力回歸方程的斜率都低于1，病原真菌是否已經(jīng)產(chǎn)生一定的抗藥性，田間生產(chǎn)是否可以考慮敏感性更高的藥劑用于鏈格孢屬引發(fā)的浙貝母黑斑病的防治。由于藥劑的劑型不同，考慮的溶解度、濾紙片吸附性、操作便捷等因素，并結合預實驗結果，此次抑菌實驗擯棄濾紙片法和牛津杯法，而是采用平皿打孔法技術[9]。

本實驗結果僅為室內(nèi)測定結果，只能說明咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑和異菌脲3種藥劑在離體條件下對病原真菌的直接作用，并不能準確反映其在田間的防治效果，因此，有待進一步的田間試驗，以便在生產(chǎn)上更好的推廣和使用。

此外本次實驗我們實驗室只采用三種黑斑病防治常用藥劑，文獻表明，腐霉利、三唑酮、啶菌惡唑、嘧菌酯等藥劑對黑斑病病原菌也有抑制作用，若想對浙貝母黑斑病進行有效防治，應結合現(xiàn)有數(shù)據(jù)，對其他藥劑綜合研究。

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