連續(xù)施用沼液水稻油菜輪作耕層土壤的細菌多樣性PCR-DGGE分析

馮丹妮 伍鈞 楊虎德

摘要：采用PCR-DGGE克隆測序技術，分析沼液連續(xù)施用水稻油菜輪作耕層土壤細菌群落結構、豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)等。通過DGGE圖譜分析得出，沼液連年施用不利于豐富土壤細菌群落多樣性，當連續(xù)3 a沼液施用總量控制為339.31～396.81 t/hm2時，細菌群落多樣性增加，種群功能豐富、信息復雜、種群穩(wěn)定，過高或過低施用沼液都會顯著降低細菌群落多樣性;通過UPGMA分析表明，長期連續(xù)施用沼液后土壤細菌遺傳相似性降低，細菌種群結構變化越來越大。

關鍵詞：水稻;油菜;輪作;沼液施用量;土壤細菌多樣性;PCR-DGGE

中圖分類號：S154.32? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? 文章編號：1001-1463（2019）08-0041-09

Abstract：PCR-DGGE cloning sequencing technology was used to analyze and compare the bacterial community structure，richness index and diversity index of soil bacteria in rice-rape rotation cultivation layer. Through the analysis of the DGGE profiles concluded that biogas slurry in successive years application does not favor the rich soil bacterial community diversity， when biogas slurry application of total amount controled in 339.31～396.81 t/hm2， bacterial community diversity increases， bacterial population feature rich， complicated information and population stable， too high or too low application of biogas slurry can significantly reduce the bacterial community diversity; According to UPGMA analysis， the genetic similarity of soil bacteria decreased after long-term continuous application of biogas slurry， and the bacterial population structure changed bigger and bigger.

Key words：Rice;Rape;Rotation;Amount of biogas slurry;Bacterial community diversity;PCR-DGGE

隨著規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，畜禽糞便等廢棄物排放成為突出的環(huán)境問題，沼氣工程是處理畜禽糞便等廢棄物最有效的途徑，為此國家增加投入建設沼氣工程，隨之產生大量的沼液。沼液中含有氮、磷、鉀等作物生長必須的營養(yǎng)元素和鐵、鋅、錳等多種微量元素[1 ]，同時富含各類氨基酸、維生素、蛋白質、生長素等有益的有機成分，對提高農產品品質、改良土壤有積極作用[2 - 4 ]。但現(xiàn)代規(guī)模化養(yǎng)殖為加快畜禽生長速度及提高飼料利用率和預防疾病，常在飼料中添加激素類、抗生素等物質，它們大部分殘留于畜禽糞便中，對沼液的資源化利用提出了新的挑戰(zhàn)，不合理地施用沼液可能提高農業(yè)面源污染風險。

微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中最活躍的部分，受土壤環(huán)境條件影響較為敏感。越來越多的研究表明，土壤微生物多樣性在評價土壤生態(tài)系統(tǒng)功能、 維護土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡及促進土壤可持續(xù)利用等方面發(fā)揮著重要作用[5 - 6 ]。近年來，分子生物學分析方法不斷進步，并被廣泛應用于微生物生態(tài)學研究，使土壤微生物多樣性研究有了突破式的進展。多聚酶擴增-變性梯度電泳法（PCR-DGGE）在土壤微生物多樣性分析中應用的較為成熟，可以較好的反映土壤微生物的結構變化[7 - 8 ]。我們于2009 — 2012年以資源化、無害化處理沼液，防止其造成面源污染為目的，在四川南方山丘區(qū)水稻油菜輪作土壤中進行連續(xù)3 a施用沼液試驗，通過監(jiān)測0～20 cm耕層土壤細菌群落多樣性，評價長期施用沼液對土壤細菌群落多樣性的影響，以期為沼液的農田消解方式提供更全面的參考和理論依據(jù)。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗地概況

試驗設在四川省邛崍市固驛鎮(zhèn)黑石村，地勢平坦向陽，排灌方便。供試土壤為黃壤性水稻土。原始耕層土壤肥力中等，含全氮2.11 g/kg、堿解氮173.4 mg/kg、有機質35.65 g/kg、速效磷57.32 g/kg、速效鉀31.48 mg/kg，pH為4.8。

1.2? ?供試材料

指示水稻品種為秈型水稻，油菜品種為宜油15。供試沼液為四川金利有限公司生豬黑石養(yǎng)殖場以通威飼料養(yǎng)殖的豬場糞尿經厭氧發(fā)酵完全的沼液，其成分含量為全氮876.23 mg/L、銨態(tài)氮 634.7 mg/L、硝態(tài)氮 7.27 mg/L、全磷83.19 mg/L、全鉀378.5 mg/L。供試化肥為尿素（含N≥46%）、含有機質磷肥（速效磷≥12%，有機質≥3.0%）、氯化鉀（K2O≥60%）、硼肥（硼酸鈉鹽含量99%，純硼含量15%）、有機復合肥（N- P2O5-K2O為20-20-10）。

1.3? ?試驗設計

試驗采用水稻油菜輪作。自2009年播種水稻至2012年收割油菜，連續(xù)3 a種植6季作物（水稻油菜輪作），每季作物根據(jù)其生長所需養(yǎng)分及以往施肥經驗確定不同的沼液施用量。設置12個處理（表1），包括1個清水對照（CK1）、1個常規(guī)施肥對照（CK2）和10個純沼液處理（BS1～BS10）。隨機區(qū)組排列，3次重復，小區(qū)面積20 m2（5 m×4 m），處理間間隔40 cm，重復間間隔50 cm，四周設保護行。水稻、油菜種植均按當?shù)爻Ｒ?guī)方法育苗，水稻4月播種，5月移栽，按寬窄行移栽，每小區(qū)定植288穴;油菜9月份播種，10月份移栽，株距35 cm，每小區(qū)種植168株。

1.4? ?樣品采集

連續(xù)3 a 6季水稻油菜輪作，油菜收割后分小區(qū)多點采集0～20 cm土樣，混勻，四分至1 kg左右，用滅菌鑷子去除植物根系、石礫等雜物，將土樣收集于無菌封口袋中，密封帶回實驗室儲存于-70 ℃冰箱備用。

1.5? ?分析方法

1.5.1? ? 土壤總DNA提取? ? 采用美國MOBIO公司的PowerSoilTM DNA Isolation Kit（DNA 強力提取試劑盒）提取，依照試劑盒設計，土壤加樣量設定為0.25 g，提取完畢用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行質量檢測。

1.5.2? ? PCR-DGGE分析? ? PCR擴增：選用細菌16S rDNA V6-V8區(qū)通用引物（上海生工生物工程技術服務有限公司合成），具體引物名稱與序列見表2[9 - 10 ]。PCR擴增采用Nested-PCR（巢式PCR）程序。為減少擴增過程中產生非特異性產物，試驗采用Touch- down反應程序。

第1次PCR反應體系：PCR Master Mix （TIANGEN BIOTECH， BEIJING） 25 μL，引物BSF8/20和BSR1541/20各0.5 μL，DNA模板8 ng，加ddH2O至50 μL。反應程序：94 ℃變性10 min，隨后94 ℃變性1 min、65～55 ℃退火50 s（每次循環(huán)降低0.5 ℃）、72 ℃延伸90 s，循環(huán)20次，而后94 ℃變性1 min、55 ℃退火50 s、72 ℃延伸90 s，15個循環(huán)，最后在72 ℃條件下再延伸10 min，產物保存于4 ℃。

第2次PCR擴增：將第1輪PCR擴增產物1∶10稀釋液作為DNA模板。體系為：25 μL PCR Master Mix，引物GC-968F和1401R各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 23 μL（總體系為50 μL）。反應體系在第1次PCR程序基礎上，退火溫度20個循環(huán)改為63～53 ℃、15個循環(huán)改為53 ℃，其他條件不變。

1.5.3? ? 變性凝膠梯度電泳（DGGE）? ? 凝膠制備：按DGGE濃度8%、變性劑高低濃度40%～55%，并分別加入25 μL TEMED、50 μL 10%過硫酸銨溶液，搖勻，迅速手動灌膠，插入梳子，置于50 ℃烘箱30 min，而后置于水平桌面過夜。

1.5.4? ? 電泳? ? 輕輕拔出梳子并用緩沖液清洗點樣孔，安裝膠板并置于裝有預熱（60 ℃）的1×TAE緩沖液的電泳槽中，按電壓50 V電泳30 min，再按電壓180 V電泳7 h。

1.5.5? ? 染色與成像? ? 電泳結束之后，采用銀染法對 DGGE 凝膠進行染色。其主要流程如下：①固定：將凝膠置于1 L固定液中（10%無水乙醇，0.5%冰醋酸），水平振蕩15 min;②染色：取出膠片用去離子水沖洗凝膠2～3次，然后加入1 L銀染液（0.2% AgNO3，200 μL 甲醛），避光水平振蕩20 min;③顯色：倒棄銀染液用去離子水沖洗凝膠2～3次，加入1 mL顯色液（1.5% NaOH，2 mL甲醛），振蕩至出現(xiàn)較清楚條帶;④再固定：倒棄顯色液放入1 L固定液（可重復使用）固定10 s;⑤清洗膠片。

成像：將膠片平整放在膠片觀察燈上，用相機清晰拍下膠片。

1.5.6? ? DGGE圖譜分析? ? DGGE凝膠上的每個條帶都代表一個單獨的序列類型或系統(tǒng)發(fā)育類型。采用所得圖像用Bio-Rad Quantuty One 4.62 對DGGE圖譜進行定量分析，如條帶位置、相對亮度等。采用Excel 2007計算 Simpson 指數(shù)、 Shannon-Wiener 指數(shù)和均勻度指數(shù)（EH）。

式中Ni為第i種物種的光密度值，N為所有條帶的總光密度值。

根據(jù)條帶的出現(xiàn)或消失來建立二元矩陣，經 NTSYS 軟件計算得出 Jaccard 系數(shù)，并用 UPGMA（Unweighted pair group method using arithmetic averages）進行聚類分析。

1.6? ?數(shù)據(jù)處理

將Quantity One定量分析數(shù)據(jù)拷貝到Excel 2007中進行轉換運算，再由SPSS18.0進行統(tǒng)計分析，用鄧肯（Duncan’s test）檢測法檢驗其差異顯著性水平（P < 0.01）。

2? ?結果與分析

2.1? ?土壤微生物總DNA提取與PCR擴增

采用DNA強力提取試劑盒提取土壤微生物總DNA，所提取DNA溶液濃度為6.61～14.11 ng/μL（表3）。第1輪PCR擴增應用細菌通用引物BSF8/20和BSR1541/20獲取DNA模板，將其稀釋10倍，取1 μL稀釋液于50 μL體系，采用GC-968F和1401R引物對進行第2輪擴增得到目標片段，取3 μL第二輪PCR產物，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測， PCR產物片段大小均勻，特異性高（圖1），無需純化適合進行DGGE操作。

2.2? ?DGGE圖譜分析

根據(jù)DGGE原理，DGGE圖譜中每個條帶大致代表一種微生物優(yōu)勢菌群，條帶染色后，條帶強度代表該菌種相對豐度，條帶數(shù)多寡則代表細菌種群多樣性高低。由圖2可以看出，不同處理樣品泳道間的公共條帶代表供試樣品中存在共有細菌，說明該種細菌類群穩(wěn)定，不易受土壤環(huán)境變化影響;不同處理樣品泳道DGGE條帶數(shù)量、遷移位置、亮度和粗細均存在差異，說明不同處理樣品中細菌類群種類和數(shù)量差異較大。與CK1相比，CK2樣品中部分條帶亮度減弱或消失;沼液施用處理樣品中雖有部分條帶消失，同時也有新的條帶出現(xiàn)，隨沼液施用量增加條帶位置和亮度逐步發(fā)生明顯變化。

2.3? ?細菌群落結構分析

應用 Quantity One 4.62對 DGGE 圖譜進行數(shù)字化處理，計算不同處理樣品泳道的豐富度指數(shù)、Shannon-Wiener 指數(shù)、Simpson 指數(shù)和均勻度指數(shù)等。

從表4可以看出，清水處理（CK1）土壤細菌豐富度為30、Shannon-Wiener 指數(shù)3.390，極顯著高于化肥處理和多數(shù)BS處理，說明清水處理土壤中細菌類群繁多、功能性強。長期施用化肥的CK2處理土壤中細菌類群豐富度和多樣性指數(shù)極顯著小于清水對照處理。長期施用沼液處理土壤細菌類群也發(fā)生明顯變化，隨沼液施用量增加，土壤細菌種群豐富度、多樣性指數(shù)大體呈先升高后降低的趨勢，并以BS4處理（沼液施用總量396.81 t/hm2）達最大值，其中豐富度為32、多樣性指數(shù)為3.470，極顯著大于CK1、CK2和其他BS處理（BS3除外）。當沼液施用量低于396.81 t/hm2時（即BS1、BS2處理），土壤細菌豐富度和多樣性指數(shù)極顯著小于CK1、大于CK2，高于該施用量（即BS5、BS6、BS8、BS9、BS10）的處理細菌種群豐富度和多樣性逐漸降低且極顯著小于CK1、CK2，說明長期不合理的施用沼液會導致土壤細菌豐富度和多樣性指數(shù)減小。

各處理土壤 Simpson 指數(shù)呈完全相反變化規(guī)律。當土壤細菌 Shannon-Wiener指數(shù)較高時，Simpson 指數(shù)較低;Shannon- Wiener 指數(shù)降低時 Simpson 指數(shù)升高。說明土壤細菌類群繁多時優(yōu)勢類群不突出，土壤細菌類群數(shù)量減少時優(yōu)勢類群明顯。

不同處理條件下細菌種群均勻度差異不顯著，說明連續(xù)3 a施肥處理存活的土壤細菌類群通過群落結構的不斷變化來優(yōu)化群落的整體功能，從而適應環(huán)境條件，降低物種奇異度。

2.4? ?細菌群落相似性分析

通過 UPGMA 方法對不同施肥處理土壤細菌 16S rRNA DGGE 圖譜條帶進行群落結構相似性聚類分析。Lane1—Lane36每3條為同一處理土壤樣品，依次代表BS10～BS1、CK2、CK1處理土壤樣品。由圖3可知，不同處理土壤細菌群落結構有明顯變化，CK1與CK2處理土壤細菌群落相似度大于70%;CK1與BS1、BS2沼液處理相似度高于67%，與BS3、BS4、BS5、BS6相似度僅37%，與BS7、BS8、BS9、BS10相似度僅34%。說明經長期不同施肥處理，土壤細菌類群繁育會出現(xiàn)差異，以適應不同的土壤環(huán)境。

隨沼液施用量增加，土壤細菌群落結構逐步發(fā)生變化。根據(jù)相似度大小將BS處理樣品分組，表明沼液施用量相近的土壤細菌種群相似度較高，其中BS1與BS2（Lane7- 12）聚為一類，為Ⅰ組，BS3、BS4、BS5、BS6（Lane13-24）聚類為Ⅱ組，BS7、BS8、BS9、BS10（Lane25-36）聚類為Ⅲ組。不同組別之間相似度范圍在34%～37%，其中BS1、BS2、BS3、BS4、BS5、BS6（Ⅰ組、Ⅱ組）與BS7、BS8、BS9、BS10（Ⅲ組）之間相似性最小，僅34%。說明不同沼液施用量對土壤細菌群落相似性影響很大。

3? ?小結與討論

通過試驗得出，長期施用化肥導致土壤中某些細菌類群消失，但遺傳相似性較高，說明細菌群落穩(wěn)定性較好;長期施用沼液土壤中不僅有某些細菌類群消失，同時伴有新的類群出現(xiàn)，遺傳相似性降低。適量施用沼液能夠提高土壤細菌豐度和Shannon-Wiener指數(shù)，過多則效果降低，在本研究條件下，連續(xù)3 a沼液施用總量為339.31～396.81 t/hm2較適宜。

通過DGGE圖譜分析得出，不同處理泳道中多數(shù)條帶相同，說明這些細菌種群穩(wěn)定，不易受到土壤環(huán)境變化的影響，但同時也有部分條帶缺失或特異性條帶出現(xiàn)。Marschner P等[11 ]研究指出，不同肥料種類、用量及配施方式均可改變土壤養(yǎng)分含量及組成等，進而對土壤微生物產生影響。通過DGGE圖譜的數(shù)字化分析看出，不同施肥處理耕層土壤細菌豐富度、Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)差異極顯著，均勻度指數(shù)差異不顯著。本研究中，經化肥長期施用土壤中細菌豐富度、Shannon-Wiener指數(shù)極顯著小于清水處理，與李英秀等[12 ]、徐永剛? ? ?等[13 ]研究結論一致;沼液處理土壤細菌豐富度和多樣性指數(shù)多小于清水處理，與朱金山等[14 ]的研究結果相似。化肥和沼液的大量施用有效增加了土壤有機質、堿解氮、有效磷、速效鉀等養(yǎng)分含量，刺激喜富營養(yǎng)微生物生長繁育，但土壤自然條件下該類微生物種類較少，從而導致群落多樣性降低;相反，貧營養(yǎng)微生物和土著微生物種類繁多，在清水處理和低沼液處理的養(yǎng)分較低的土壤中迅速繁衍，使得土壤細菌種群多樣性提高。同時，土壤養(yǎng)分本底值含量也是影響細菌種群豐富度的重要因素，如在土壤有機質本底值含量較高時施入有機肥，其土壤微生物細菌多樣性低于在低有機質含量土壤中施入有機肥[15 - 16 ]，連續(xù)的施肥處理不斷向較高養(yǎng)分含量土壤中施入更多養(yǎng)分，會導致土壤細菌種群多樣性降低。

隨沼液施用量增加，土壤細菌多樣性差異極顯著。當沼液施用量低于396.81 t/hm2時，土壤細菌群落豐度、多樣性指數(shù)極顯著高于清水處理和常規(guī)施肥處理，超過此沼液施用量則土壤細菌群落多樣性減小，甚至低于化肥處理，這與黃繼川等[17 ]研究結果相同。土壤微生物群落結構與土壤pH、有機質、土壤養(yǎng)分及土壤酶活性密切相關，這些因素的變化均能影響土壤微生物群落結構，改變微生物群落組成和數(shù)量[18 - 19 ]。李忠佩等[20 ]通過擬合稻田土壤中細菌Shannon-Wiener指數(shù)與速效磷的一元二次方程發(fā)現(xiàn)，土壤速效磷對土壤細菌多樣性影響存在明顯轉折點，即在速效磷含量超過37.8～49.3 mg/kg時土壤細菌多樣性指數(shù)下降。

相應地，細菌Simpson指數(shù)與豐富度和Shannon-Wiener指數(shù)呈反比，當豐富度與多樣性指數(shù)增大時細菌種群功能多樣、信息復雜，優(yōu)勢類群不突出;當豐富度和多樣性指數(shù)降低時一些細菌種群消失，使適應環(huán)境的細菌種群有更充足的養(yǎng)分、生長繁殖旺盛，成為優(yōu)勢種，優(yōu)勢度較高。

為進一步了解各處理土壤細菌群落結構的變化，本研究通過UPGMA方法對樣品DGGE圖譜進行聚類分析。結果表明，長期施用化肥土壤中細菌種群遺傳相似性高達67%，這與孟慶杰等[21 ]、Zhong W H等[22 ]的結果一致。隨沼液施用量增加，土壤細菌遺傳相似性呈階段性變化，聚為一類的組內處理細菌群落相似度均高于50%，組間相似性逐級降低。不同處理土壤微生物群落結構受土壤C/N比影響深刻，不同施肥方式下的不同微域生態(tài)環(huán)境也會導致微生物群落結構變化。在研究中，隨沼液施用量增加，土壤養(yǎng)分含量、水熱狀況、微生物區(qū)系組成等存在差異，土壤中存活的優(yōu)勢細菌種群通過改變群落結構、優(yōu)化群落功能來適應新的環(huán)境條件，從而導致代謝功能變化、遺傳相似性降低。

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（本文責編：陳? ? 偉）