“鉤藤石菖蒲”藥對對TS模型大鼠神經(jīng)遞質(zhì)及行為活動(dòng)的影響

張雪榮 鄧麗華 陳格格

摘要 目的：探討“鉤藤-石菖蒲”藥對對TS模型大鼠神經(jīng)遞質(zhì)及行為活動(dòng)的影響。方法：將雄性SD大鼠32只隨機(jī)分為正常組、模型組、實(shí)驗(yàn)組、泰必利組，每組8只。造模的同時(shí)開始灌胃給藥，正常組與模型組給予蒸餾水，其余各組給予相應(yīng)藥物，1次/d，連續(xù)給藥4周。觀察各組大鼠神經(jīng)遞質(zhì)含量變化情況及各組大鼠在造模第7天及灌胃第14天、21天、28天刻板行為、運(yùn)動(dòng)行為、自主活動(dòng)次數(shù)的情況，并分別進(jìn)行評分。結(jié)果：與正常組比較，模型組多巴胺、多巴胺D2受體均無明顯變化（P>0.05）;與模型組比較，泰必利組、實(shí)驗(yàn)組多巴胺、多巴胺D2受體含量均有下降（P<0.05）;實(shí)驗(yàn)組、泰必利組二組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。通過對各組TS大鼠刻板行為評分比較，實(shí)驗(yàn)組在治療21天以后，大鼠刻板行為減少優(yōu)于泰必利組及模型組（P<0.05）;通過對各組TS大鼠運(yùn)動(dòng)行為的評分比較，泰必利組與實(shí)驗(yàn)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;實(shí)驗(yàn)組、泰必利組大鼠的活動(dòng)次數(shù)較模型組均減少，二者均有治療效果。結(jié)論：“鉤藤-石菖蒲”藥對具有抑制多巴胺受體超敏感、促進(jìn)多巴胺代謝的作用，從而抑制TS大鼠的刻板行為，減少TS大鼠的活動(dòng)次數(shù)。

關(guān)鍵詞 “鉤藤-石菖蒲”藥對;TS模型大鼠;神經(jīng)遞質(zhì);行為活動(dòng)

Abstract Objective：To investigate the effects of drug pair of “Ramulus Uncariae Cum Uncis and Rhizoma Acori Tatarinowii” on neurotransmitters and behavioral activities in TS rats.Methods：A total of 32 male SD rats were randomly divided into a normal group，a model group，an experimental group and a tabilium group，with 8 rats in each group.Intragastric administration of drugs was given when model establishing.At the same time，the normal group and the model group were given distilled water，and the other groups were given corresponding drugs，once per day，for 4 weeks.The changes of neurotransmitter content in each group of rats were observed，and the stereotyped behaviors，motor behaviors and autonomous activity times of each group of rats were evaluated on the 7th day of modeling and the 14th，21st and 28th day of instillation.Results：Compared with the normal group，there were no significant changes in dopamine and D2 receptors in the model group（P>0.05）.Compared with the model group，the levels of dopamine and dopamine D2 receptor in the tabilium group，the experimental group all decreased（P<0.05）.There was no significant difference between the experimental group and the tabilie group（P>0.05）.By comparing the scores of stereotyped behaviors of TS rats in each group，after 21 days of treatment，the reduction of stereotyped behaviors of the experimental group was better than that of the tabilie group and the model group（P<0.05）.By comparing the scores of exercise behaviors of TS rats in each group，there was no statistical significance between the tabilium group and the experimental group（P>0.05）.The activity frequency of rats in the experimental group and the tabilium group decreased compared with the model group，and both of them had therapeutic effect.Conclusion：Drug pair of “Ramulus Uncariae Cum Uncis and Rhizoma Acori Tatarinowii” can inhibit the hypersensitivity of dopamine receptor and promote the metabolism of dopamine，thus inhibiting the stereotypical behavior of TS rats and reducing the activity frequency of TS rats.

Key Words drug pair of “Ramulus Uncariae Cum Uncis and Rhizoma Acori Tatarinowii”; TS model rats; Neurotransmitters; Activities

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.08.020

多發(fā)性抽動(dòng)癥（Tourette Syndrome，TS）是一種慢性神經(jīng)精神疾病，其患病率在1%～4%之間，且有逐年增高的趨勢[1]。至今為止，西醫(yī)對此病尚無根治方法，目前以氟哌定醇、泰必利為代表的多巴胺受體阻滯劑是公認(rèn)有效治療藥物，但不良反應(yīng)明顯，如錐體外系反應(yīng)、認(rèn)知遲鈍等。而中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“肝常有余”是小兒重要的生理病理機(jī)制，情志不舒，肝氣郁結(jié)，日久化火，火極生風(fēng)，風(fēng)陽鼓動(dòng)，則肝風(fēng)挾痰循經(jīng)而上，出現(xiàn)面部肌肉、四肢的抽動(dòng)及怪聲連連等癥狀。小兒又“脾常不足”，運(yùn)化維艱，肝氣旺盛常易乘脾犯胃，則脾胃愈虧，脾虛木亢，則肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)愈甚。且怪病多責(zé)之于痰，風(fēng)與痰關(guān)系密切，既可因風(fēng)而生痰，亦可因痰而生風(fēng)，風(fēng)痰合邪橫串經(jīng)絡(luò)，可使氣阻竅閉而發(fā)病。故“脾虛肝旺、痰熱動(dòng)風(fēng)”為本病的基本病機(jī)。本研究為了探討“鉤藤-石菖蒲”藥對對TS模型大鼠神經(jīng)遞質(zhì)及行為活動(dòng)的影響，進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SD大鼠32只，3周齡，清潔級，體質(zhì)量在（20±2）g，雄性。

1.1.2 藥物 受試藥物：鉤藤、石菖蒲（飲片），由江陰天江藥業(yè)有限公司提供。陽性藥物：泰必利，由山東健康藥業(yè)有限公司提供。造模藥物：亞氨基二丙腈（IDPN，90%），為上海至鑫化工有限公司提供。

1.1.3 試劑及儀器 臺式冰凍離心機(jī)（美國BECKMAN公司GS-15R型），Thermo超低溫冰箱（美國REVCO公司），移液器（加樣器）（德國Eppendorf），電子天平（FA.1104型，上海天平儀器廠），恒冷冰凍切片機(jī)（德國Leica-CM1900），Real-timePCR擴(kuò)增儀（7500型，美國AppliedBiosystems公司產(chǎn)品）、紫外分光光度計(jì)（752.C型，上海產(chǎn)）、恒溫水浴箱（江蘇太倉醫(yī)用儀器廠，DSHZ-300型）等。30%三氯乙酸、生理鹽水、PVDF膜、、焦碳酸二乙酯、0ligo（dT）15、DNTPs（10 mM）、乙醇、M-MLV 5×Buffer、10×Buffer、M-MLV RT、DNA Taq polymerase、cDNA、TRIzol試劑、RT-PCR試劑盒等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

應(yīng)用IDPN造模，將IDPN溶于0.9%生理鹽水中，使其終濃度為22 mg/mL，每只大鼠腹腔注射IDPN 330 mg/（kg·d），連續(xù)注射7 d。對照組腹腔注射等量生理鹽水7 d。

1.2.2 給藥方法

將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分組，每組大鼠8只。正常組：腹腔注射生理鹽水15 mL/（kg·d），共注射7 d，自注射當(dāng)日起蒸餾水按20 mL/（kg·d）連續(xù)灌胃4周;模型組、泰必利組、實(shí)驗(yàn)組均予IDPN 330 mg/（kg·d），配置成15 mL/（kg·d）的劑量，連續(xù)腹腔注射7 d;自注射當(dāng)日起泰必利組予含泰必利30 mg/（kg·d）的溶液，按20 mL/（kg·d）連續(xù)灌胃4周。實(shí)驗(yàn)組自造模當(dāng)日起予含生藥10%的“鉤藤-石菖蒲”藥對溶液，按20 mL/（kg·d）連續(xù)灌胃4周。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 神經(jīng)遞質(zhì)含量的測定

灌胃結(jié)束的第2天斷頭處死各組大鼠（處死前24 h禁食不禁水），在冰盒上快速剝離大鼠腦黑質(zhì)-紋狀體，將其一部分放到玻璃勻漿器中，快速勻漿，吸取勻漿液，離心后，取上清液待測，另一部分放入冰箱中冷凍。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測實(shí)驗(yàn)28 h后大鼠腦組織多巴胺系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)DA、DRD2的含量。

1.2.3.2 模型動(dòng)物行為學(xué)觀察

由不明確實(shí)驗(yàn)分組的實(shí)驗(yàn)人員參與TS大鼠行為活動(dòng)評分，分別觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠在造模第7天及灌胃第14天、21天、28天刻板行為、運(yùn)動(dòng)行為、自主活動(dòng)次數(shù)的情況，并分別進(jìn)行評分。1）刻板行為測試：將大鼠放入一較大的觀察籠內(nèi)，大鼠適應(yīng)5 min后，參照杜淑娟等[2]動(dòng)物模型中對刻板行為的評分方法，在每周灌胃后1 h，進(jìn)行雙盲觀察1 h，5 min記錄1次，并記錄總分。評分標(biāo)準(zhǔn)及方法：0分：無刻板行為;1分：旋轉(zhuǎn)行為;2分：頭和頸部的上下運(yùn)動(dòng)過多;3分：頭、頸部的上下運(yùn)動(dòng)過多加旋轉(zhuǎn)行為;4分：頭向側(cè)擺合并頭和頸部的上下運(yùn)動(dòng)過多。2）運(yùn)動(dòng)行為評分：刻板行為評分結(jié)束后，立即將大鼠放入一較大的觀察籠內(nèi)，大鼠適應(yīng)后，以抽動(dòng)癥動(dòng)物模型中對運(yùn)動(dòng)行為的評分方法，進(jìn)行雙盲觀察1 h，記錄5 min/次，并記錄總分。評分標(biāo)準(zhǔn)及方法：0分：安靜或正?；顒?dòng);1分：能過度興奮;2分：探究行為增加;3分：跑;4分：跑和跳。3）自主活動(dòng)次數(shù)測定：參照Wei[3]等報(bào)道的方法，運(yùn)動(dòng)行為評分結(jié)束后立即應(yīng)用大鼠自主活動(dòng)程序儀進(jìn)行大鼠自發(fā)活動(dòng)計(jì)數(shù)，當(dāng)計(jì)算機(jī)進(jìn)入測定程序后，將大鼠放入活動(dòng)箱中（高13 cm，直徑25 cm），由計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄大鼠活動(dòng)情況，測定每只大鼠5 min內(nèi)的活動(dòng)次數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其中計(jì)數(shù)資料以（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

3 討論

小兒多發(fā)性抽動(dòng)癥屬于中醫(yī)學(xué)中“瘛疭”“慢驚風(fēng)”“肝風(fēng)證”等范疇。臨床多表現(xiàn)為眨眼、擠眉、皺鼻、搖頭、咧嘴等。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為小兒“肝常有余”“脾常不足”“腎常虛”的生理特點(diǎn)是發(fā)為本病的病機(jī)所在。其病因可責(zé)之先天稟賦不足，產(chǎn)傷，外傷等多種因素。小兒稚陰稚陽之體，腎常虛，腎虛則肝木無制，陰虛則筋脈失養(yǎng)[4]。小兒情志不舒，肝氣郁結(jié)，日久化火，火極生風(fēng)，風(fēng)陽鼓動(dòng)，則肝風(fēng)挾痰循經(jīng)而上，出現(xiàn)面部肌肉、四肢的抽動(dòng)及怪聲連連等癥狀。小兒“脾常不足”，運(yùn)化維艱，肝氣旺盛常易乘脾犯胃，則脾胃愈虧，脾虛木亢，則肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)愈甚。加之“怪病多為痰作祟”，故本病的病機(jī)為“脾虛肝旺、痰熱動(dòng)風(fēng)”，病變臟腑在于肝脾，涉及胃，病理產(chǎn)物責(zé)之于風(fēng)痰。

TS發(fā)現(xiàn)至今已有200多年的歷史，其病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚，但普遍認(rèn)為其發(fā)病與遺傳因素、中樞神經(jīng)遞質(zhì)失衡、神經(jīng)生化異常和精神因素等諸多方面有關(guān)[5]。但TS患者紋狀體內(nèi)多巴胺神經(jīng)過度支配或突觸后受體超敏感是目前公認(rèn)的TS發(fā)病的神經(jīng)生物化學(xué)因素[6]。多巴胺（DA）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，占所有腦內(nèi)兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)總含量的80%。學(xué)者多認(rèn)為本病存在與基底節(jié)紋狀體的DA神經(jīng)元活動(dòng)過度及突觸DA受體超敏感相關(guān)，TS患兒紋狀體內(nèi)DA能系統(tǒng)存有活動(dòng)過度現(xiàn)象。多巴胺受體DRD2被認(rèn)為與TS間存在密切關(guān)聯(lián)。有實(shí)驗(yàn)顯示，IDPN誘導(dǎo)的模型鼠的DRD2mRNA表達(dá)較正常小鼠明顯升高[7]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示在造模后模型組、實(shí)驗(yàn)組、泰必利組大鼠腦組織中DA、多巴胺受體DRD2的含量均升高，提示TS大鼠DA能系統(tǒng)存在過度活化的現(xiàn)象，符合理論研究。實(shí)驗(yàn)研究的目的在于通過藥物干預(yù)使DA缺乏，從而DRD2由腦內(nèi)最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸激活，通過間接通路，對丘腦-皮質(zhì)投射產(chǎn)生抑制作用，從而降低運(yùn)動(dòng)興奮性，從而較少改善刻板運(yùn)動(dòng)。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示在對TS模型大鼠進(jìn)行中藥（“鉤藤-石菖蒲”）及西藥（泰必利）干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)組及泰必利組DA、多巴胺受體DRD2的含量較模型組均下降（P<0.05），說明“鉤藤-石菖蒲”藥對與泰必利均可降低DRD2mRNA表達(dá)及抑制DA的過度活化;將實(shí)驗(yàn)組和泰必利組DA、多巴胺受體DRD2的含量進(jìn)行比較，2者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05），說明“鉤藤-石菖蒲”藥對及泰必利二者在療效上無明顯優(yōu)劣之分。

通過對各組TS大鼠刻板行為的評分比較，在治療后實(shí)驗(yàn)組、泰必利組TS大鼠的刻板行為較模型組均減少，說明二者均有治療效果，但對實(shí)驗(yàn)組及泰必利組TS大鼠刻板行為的評分進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)組在治療21 d以后，大鼠刻板行為較泰必利組減少，說明中藥組在優(yōu)于泰必利組及模型組（P<0.05）。通過對各組TS大鼠運(yùn)動(dòng)行為的評分比較，泰必利組在治療14 d后運(yùn)動(dòng)行為減少，而在治療28 d后運(yùn)動(dòng)行為再次增多;而實(shí)驗(yàn)組在治療21 d后運(yùn)動(dòng)行為持續(xù)減少，說明二者在起效時(shí)效上泰必利組優(yōu)于實(shí)驗(yàn)組，而在藥效維持時(shí)間上實(shí)驗(yàn)組優(yōu)于泰必利組。通過對各組TS大鼠活動(dòng)次數(shù)的比較，模型組在治療各階段無明顯變化，實(shí)驗(yàn)組大鼠活動(dòng)次數(shù)呈逐漸下降趨勢，而在治療21 d后活動(dòng)次數(shù)呈現(xiàn)明顯下降趨勢，泰必利組大鼠活動(dòng)次數(shù)呈現(xiàn)時(shí)少時(shí)多的波動(dòng)趨勢，在治療第7～14天，活動(dòng)次數(shù)較實(shí)驗(yàn)組明顯減少，而在治療14 d后又呈現(xiàn)活動(dòng)次數(shù)增多的趨勢，且在治療21 d后活動(dòng)次數(shù)高于實(shí)驗(yàn)組，這也再次證明了泰必利治療TS大鼠起效快，但藥效維持時(shí)間弱于實(shí)驗(yàn)組。但總體而言實(shí)驗(yàn)組、泰必利組大鼠的活動(dòng)次數(shù)較模型組均減少，說明二者均有治療效果。

綜上所述“鉤藤-石菖蒲”藥對具有抑制多巴胺受體超敏感、促進(jìn)多巴胺代謝的作用，從而改善TS大鼠的刻板行為及減少其活動(dòng)次數(shù)。

鉤藤可清熱平肝，熄風(fēng)止痙，為治療驚風(fēng)之良藥。鉤藤中主要有效成分生物堿，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥理作用主要表現(xiàn)為鎮(zhèn)靜、抗癲癇、抗驚厥和對神經(jīng)元的保護(hù)等[8]。有研究發(fā)現(xiàn)石菖蒲可有效清除自由基、阻止過氧化物形成，發(fā)揮神經(jīng)及腦細(xì)胞保護(hù)的作用[9]。鉤藤、石菖蒲在臨床上治療多發(fā)性抽動(dòng)癥應(yīng)用廣泛，我們分析了萬方數(shù)據(jù)庫近20年關(guān)于中醫(yī)藥治療小兒多發(fā)性抽動(dòng)癥的文獻(xiàn)，并對其進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示鉤藤的使用頻次為376次，占用藥總數(shù)的74.3%，位居第1位;石菖蒲的使用頻次為219次，占用藥總數(shù)的43.3%，位居第6位[10]。本實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)了鉤藤、石菖蒲具有抑制多巴胺受體超敏感、促進(jìn)多巴胺代謝的作用，從而降低運(yùn)動(dòng)興奮性，改善TS大鼠的刻板運(yùn)動(dòng)，減少活動(dòng)次數(shù)，為臨床運(yùn)用提供依據(jù)。

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（2019-04-29收稿 責(zé)任編輯：徐穎）