基于AFLP標記的貴州及其鄰省薏苡種質資源遺傳多樣性分析

李秀詩 周祥 李志芳 黎青 楊成龍 周明強 付瑜華

摘要：【目的】分析貴州及其鄰省薏苡種質的遺傳多樣性，為薏苡種質資源的保護、遺傳改良及創(chuàng)新利用提供理論依據(jù)。【方法】利用AFLP標記對來源于貴州及其鄰省的141份薏苡種質進行遺傳多樣性分析及聚類分析?！窘Y果】6對AFLP引物組合從141份薏苡種質中共擴增出830條清晰的條帶，其中多態(tài)性條帶為742條，多態(tài)性比例為89.40%，平均每對引物組合擴增多態(tài)性條帶123.67條，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.35～1.50，平均1.44;Nei’s遺傳多樣性指數(shù)（H）為0.21～0.30，平均為0.26;Shannon’s信息指數(shù)（I）為0.33～0.45，平均為0.40。來自貴州及其鄰省的141份薏苡種質分為兩大類群，第Ⅰ大類群包含63份薏苡種質，其中來源于貴州27份、廣西6份、湖南15份、云南7份、重慶5份和四川3份，該類群可細分為Ⅰ-A和Ⅰ-B 2個亞群;第Ⅱ大類群包含78份薏苡種質，其中來源于貴州44份、廣西3份、湖南5份、云南18份和四川8份，該類群可細分為Ⅱ-A、Ⅱ-B、Ⅱ-C和Ⅱ-D 4個亞群。在每個亞群中，同一地區(qū)或毗鄰地區(qū)的薏苡種質親緣關系較近，跨區(qū)跨省的薏苡種質資源親緣關系遠，僅有少量不同地區(qū)的薏苡種質被聚為一個類群?！窘Y論】貴州及其鄰省的薏苡種質交流相對較頻繁，遺傳基礎較狹窄，遺傳多樣性較低。

關鍵詞： 薏苡;種質資源;遺傳多樣性;AFLP;貴州省

中圖分類號： S519.024? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?;文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）09-1931-06

Abstract：【Objective】The genetic diversity of Coix lacryma-jobi L. germplasm from Guizhou and its adjacent pro-vinces was analyzed to provide important theoretical basis for the protection， genetic improvement and innovative utilization of C. lacryma-jobi germplasm resources in Guizhou. 【Method】AFLP molecular markers were used to analyze genetic diversity and cluster analysis of 141 C. lacryma-jobi germplasm resources from Guizhou and its adjacent provinces. 【Result】Six pairs of AFLP primer combinations amplified a total of 830 clear bands from 141 C. lacryma-jobi germplasm resources，among which 742 were polymorphic bands and the proportion of polymorphic loci was 89.40% with the average number of 123.67 polymorphic bands per pair of primer. The number of effective alleles（Ne） was 1.35 to 1.50 with an ave-rage of 1.44，the variation of Nei’s genetic diversity index（H） was 0.21 to 0.30 with an average of 0.26， and Shannon’s information index（I） was 0.33 to 0.45 with an average of 0.40. The neighbor-joining method grouped 141 Coixlacryma-jobi germplasm resources into two major clusters. Cluster I consisted of 63 germplasms including 27 from Guizhou， 6 from Guangxi， 15 from Hunan， 7 from Yunnan， 5 from Chongqing and 3 from Sichuan， this cluster could be further divided into sub-cluster Ⅰ-A and sub-clusterⅠ-B. Cluster II had 78 germplasms including 44 from Guizhou， 3 from Guangxi， 5 from Hunan， 18 from Yunnan and 8 from Sichuan， which could be further grouped into four sub-clusters（Ⅱ-A，Ⅱ-B， Ⅱ-C and Ⅱ-D）. In each sub-cluster，the genetic relationship of C. lacryma-jobi germplasm resources from the same region or adjacent areas was relatively close while those across regions and provinces were far. Only a small number of C. lacryma-jobi germplasm resources across regions and provinces were clustered into one group. 【Conclusion】The exchange of C. lacryma-jobi germplasm between Guizhou and its adjacent provinces is relatively frequent resulting in germplasm resour-ces from these region had narrow genetic basis and low genetic diversity.

Key words： Coix lacryma-jobi L.; germplasm resources; genetic diversity; AFLP; Guizhou Province

0 引言

【研究意義】薏苡（Coix lacryma-jobi L.）是禾本科薏苡屬重要的藥食同源作物，俗稱藥玉米、水玉米（東北）、晚念珠（福建）和六谷米（廣西）等，具有較高的營養(yǎng)、保健及藥用價值，其果實薏苡仁具有促進新陳代謝、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、利尿、降血糖等功效（趙婕等，2016;張旭娜等，2018），被廣泛應用于醫(yī)療、美容和食品等領域（張小永等，2014;黨娟，2015）。薏苡產(chǎn)業(yè)是貴州傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)之一，隨著全省產(chǎn)業(yè)結構調整，薏苡種植面積逐年增加，約占全國種植面積的50%（Diao，2017），薏苡仁副產(chǎn)品也逐漸走向成熟（黨娟，2015;鄧素芳等，2016）。但目前生產(chǎn)上栽培的薏苡品種單一，缺乏優(yōu)質薏苡新品種（張國兵等，2016;夏法剛等，2017），對薏苡種質資源的改良和創(chuàng)新利用不夠，野生薏苡種質資源也銳減（李碧娟，2017）。因此，研究薏苡種質資源的遺傳多樣性對發(fā)掘和篩選薏苡優(yōu)異種質資源具有重要意義。【前人研究進展】分子標記技術已廣泛應用于農作物種質資源的鑒定評價及其遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、基因定位等（呂杰，2012;苗晗等，2014;唐浩等，2015），但在薏苡種質資源的相關研究中，多采用SRAP和SSR標記。如梁云濤等（2008）利用SSR標記分析來源于日本、韓國及我國廣西的77份薏苡種質的親緣關系及遺傳基礎;Ma等（2010）利用SSR標記對來源于我國和韓國的79份薏苡種質進行遺傳多樣性和親緣關系分析;郭銀萍等（2012）利用SSR標記初步分析22份貴州薏苡種質的遺傳多樣性;王碩等（2015）利用SRAP標記分析來源于越南、老撾及我國云南、山西、山東、陜西等地區(qū)的25份薏苡種質的遺傳多樣性;Xi等（2016）利用ISSR標記、形態(tài)特征和化學組分對我國四川、遼寧、山東、安徽、福建、貴州等9個?。▍^(qū)）的11份薏苡種質進行遺傳多樣性分析及親緣關系鑒定;夏法剛等（2017）利用SRAP標記分析我國臺灣、浙江、河南、湖南、云南、廣東等10個?。▍^(qū)）90份薏苡種質的遺傳多樣性并構建其DNA指紋圖譜?！颈狙芯壳腥朦c】AFLP標記具有多態(tài)性強、重復性好等優(yōu)點，是一種理想、有效的遺傳標記，但目前鮮見利用該標記進行薏苡種質遺傳多樣性分析的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】利用AFLP標記對貴州及其鄰省的141份薏苡種質進行遺傳多樣性分析，以了解貴州及其鄰省薏苡種質的親緣關系，為貴州薏苡種質資源的保護、遺傳改良及創(chuàng)新利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試的141份薏苡種質是貴州省農業(yè)科學院貴州省亞熱帶作物研究所從貴州5個行政區(qū)（黔西南、黔南和黔東南、銅仁市和遵義市）及其4個鄰省即湖南（張家界市）、四川（重慶市、成都市、簡陽市、自貢市和內江市）、云南（曲靖市和文山市）和廣西（百色市）等地區(qū)收集獲得，詳見表1。主要試劑：Taq酶（2 U/μL）和dNTP（10 mmol/L）購自北京博友順生物技術有限公司;引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，內切酶EcoR I（10 U/μL）、Mse I（10 U/μL）和T4連接酶（5 U/μL）購自NEB（北京）公司。主要儀器設備：DYY-6B電泳儀（北京六一儀器廠）、GELl-DOC2000凝膠成像分析儀、PCR擴增儀（美國Bio-Rad 公司）和A3730XL測序儀（美國Applied Biosystems公司）等。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 DNA提取 將141份薏苡種質種植在貴州省農業(yè)科學院貴州省亞熱帶作物研究所種質資源圃中，于苗期采集各材料葉片，用CTAB法提取DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量和濃度，并將DNA稀釋至50 ng/μL，保存于-20 ℃冰箱備用。

1. 2. 2 AFLP分析 參照孫鳳梅等（2014）的方法進行AFLP分析，適當優(yōu)化調整。用于AFLP分析的接頭和引物序列見表2。取DNA樣品約250 ng，用EcoR I和Mse I 37 ℃酶切3 h，再65 ℃酶切3 h。用T4連接酶將酶切產(chǎn)物與50 μmol/L EcoR I接頭和Mse I接頭在16 ℃水浴中連接12 h，連接產(chǎn)物用ddH2O稀釋5倍后用作預擴增模板。預擴增反應體系： 2×PCR Mix 10.0 μL，預擴增模板4.0 μL，20 μmol/L E00和M00各1.0 μL，ddH2O補足至20.0 μL。預擴增程序：94 ℃預變性3 min;94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，進行26個循環(huán);72 ℃延伸10 min。將預擴增產(chǎn)物稀釋20倍后用作選擇性擴增模板，以6對AFLP引物組合（含3個選擇性核苷酸的FAM標記的EcoR I引物和未標記Mse I引物的引物組合）進行選擇性擴增，擴增程序：95 ℃預變性5 min;95 ℃ 35 s，65 ℃（每循環(huán)降低0.7 ℃）35 s，72 ℃ 60 s，進行12個循環(huán);94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，進行23個循環(huán);72 ℃延伸10 min。將擴增產(chǎn)物稀釋10倍后，取1.0 μL與15.0 μL Hi-Di甲酰胺和LIZ-500溶液（100∶1）混合后進行ABI3730XL毛細管電泳，并利用Genemar-ker對6對引物組合擴增產(chǎn)物原始數(shù)據(jù)進行分析，將各泳道內分子量內標的位置與各樣品峰值的位置進行比較，得出片段大小。

1. 3 統(tǒng)計分析

觀察統(tǒng)計電泳圖譜中35～500 bp的條帶，同一位置上，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，建立（0，1）數(shù)據(jù)矩陣。利用Popgene 1.32計算遺傳多樣性參數(shù)，包括各引物的擴增總條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)、多態(tài)性條帶百分比、等位基因數(shù)（Observed number of alleles，Na）、有效等位基因數(shù)（Effective number of alleles，Ne）、Shannon’s信息指數(shù)（Shannon’s information index，I）和Nei’s遺傳多樣性指數(shù)（Nei’s gene diversity，H）等。采用Mega 5.0和iTOL進行聚類分析。

2 結果與分析

2. 1 AFLP標記的多態(tài)性分析結果

6對AFLP引物組合從141份薏苡種質中共擴增獲得830條清晰條帶，其中多態(tài)性條帶為742條，多態(tài)性比例為89.40%，平均每對引物組合擴增多態(tài)性條帶123.67條（表3）。部分材料電泳結果見圖1。E47/M58擴增獲得的多態(tài)性條帶最少，為84條，E48/M85擴增獲得的多態(tài)性條帶最多，為161條;6對引物的Ne為1.35～1.50，平均為1.44;H為0.21～0.30，平均為0.26;I為0.33～0.45，平均為0.40（表3），說明貴州及其鄰省的薏苡種質資源遺傳基礎較狹窄，遺傳多樣性較低。整體來看，在6對AFLP引物組合中，E38/M51和E48/M85擴增條帶穩(wěn)定、多態(tài)性高，能較好地反映貴州及其鄰省薏苡種質資源的遺傳多樣性信息。

2. 2 聚類分析結果

由圖2可知，141份薏苡種質分為兩大類群，其中，第Ⅰ大類群包含63份薏苡種質，其中，來源于貴州27份（黔西南8份、黔東南2份、銅仁10份和遵義7份）、廣西6份、湖南15份、云南7份、重慶5份和四川3份，該類群可細分為Ⅰ-A和Ⅰ-B 2個亞群;第Ⅱ大類群包含78份薏苡種質，其中，來源于貴州44份（黔西南28份、黔東南1份、黔南5份、銅仁2份和遵義8份）、廣西3份、湖南5份、云南18份和四川8份，該類群可細分為Ⅱ-A、Ⅱ-B、Ⅱ-C和Ⅱ-D 4個亞群。綜合分析發(fā)現(xiàn)，141份薏苡種質并未完全按照地理來源聚類，但在每個亞群中，同一地區(qū)或毗鄰地區(qū)的薏苡種質資源親緣關系較近，跨區(qū)跨省的薏苡種質資源親緣關系較遠，僅有少量不同地區(qū)薏苡種質被聚為一個類群，如貴州銅仁、遵義和黔東南與湖南、重慶和廣西的大部分薏苡種質親緣關系較近，歸為一個類群;黔西南與云南和四川的薏苡種質親緣關系較近，歸為一個類群，說明貴州省的薏苡種質與毗鄰地區(qū)的薏苡種質資源交流相對較頻繁。

3 討論

本研究利用AFLP標記對貴州及其鄰省的141份薏苡種質資源進行遺傳多樣性分析，共獲得830條清晰條帶，其中多態(tài)性條帶為742條，多態(tài)性比例達89.40%，比夏法剛等（2017）利用88對SRAP引物從90份薏苡種質中擴增獲得的多態(tài)性條帶比例（84.86%）高，比王碩等（2015）利用6對SRAP引物從25份薏苡種質中擴增獲得的多態(tài)性條帶比例（93.00%）低，但明顯高于AFLP標記在玉米（72.00%）（杜金友等，2003）、黃瓜（66.00%）（李錫香等，2004）和高粱（43.10%）（Shegro et al.，2013）等作物的多態(tài)性比例。可見，AFLP標記能較好地反映141份薏苡種質的遺傳多樣性信息，尤其是E38/M51和E48/M85擴增條帶穩(wěn)定、多態(tài)性高，可應用于其他薏苡種質資源的遺傳多樣性分析及親緣關系鑒定評價。

本研究發(fā)現(xiàn)，141份薏苡種質的H為0.21～0.30，I為0.33～0.45，Ne為1.35～1.50，說明貴州及其鄰省的薏苡種質資源遺傳基礎較狹窄，遺傳多樣性較低，與馬建霞等（1999）、Ma等（2010）、Xi等（2016）的研究結果基本一致，但與夏法剛等（2017）的研究結果相反，其原因是不同研究的薏苡種質來源地存在差異，本研究僅以貴州及其鄰省的薏苡種質為研究對象，地域性相對較窄。此外，本研究聚類分析結果顯示，貴州及其鄰省的141份薏苡種質分為兩大類群，雖然所有資源并未按照地理來源完全分開，但在每個亞群中，來源于同一地區(qū)或毗鄰地區(qū)的薏苡種質親緣關系較近，跨區(qū)跨省的薏苡種質親緣關系較遠，說明薏苡種質的遺傳基礎較狹窄，遺傳多樣性較貧乏。據(jù)相關研究報道可知，薏苡種質呈現(xiàn)此現(xiàn)象可能存在以下4個主要原因：（1）同一地區(qū)或毗鄰地區(qū)的人類活動和選擇育種導致種質遷移（馬建霞等，1999;Xi et al.，2016）;（2）薏苡是小作物，栽培面積小，地理分布零碎，跨區(qū)跨省的薏苡種質交流較少（陳成斌等，2008）;（3）薏苡屬于風媒傳粉的同株異序或異株授粉作物（Mello et al.，1995;李澤鋒和劉昆，2012）;（4）供試樣本量偏少，采集地點零碎，一定程度上影響遺傳多樣性。

4 結論

貴州及其鄰省的薏苡種質交流相對較頻繁，遺傳基礎較狹窄，遺傳多樣性較低。

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（責任編輯 陳 燕）