德克薩斯組鈴鐺鐵線蓮胚胎挽救及促進(jìn)種子萌發(fā)技術(shù)研究

孫瑞琦 余偉軍 曾黎輝

摘要：[目的]研究不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比處理對(duì)德克薩斯組鈴鐺鐵線蓮打破休眠及胚胎挽救的影響，解決德克薩斯鈴鐺鐵線蓮萌發(fā)時(shí)間過長(zhǎng)，高溫脅迫引起種子發(fā)育中途敗育的問題，為提高育種效率，縮短育種周期提供理論依據(jù)與指導(dǎo)。[方法]以德克薩斯組鈴鐺鐵線蓮‘王夢(mèng)’為材料，設(shè)計(jì)12種不同濃度6-BA、NAA的正交試驗(yàn)篩選鈴鐺鐵線蓮胚胎挽救最適植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度，討論椰乳作為培養(yǎng)添加物對(duì)胚胎挽救的促進(jìn)作用;比較低溫、變溫及不同濃度GA、6-BA對(duì)打破鈴鐺鐵線蓮種子休眠的影響。[結(jié)果]將授粉后45d的雜交鈴鐺鐵線蓮種子離體培養(yǎng)，MS基本培養(yǎng)基添加0.5mg.L6-BA和0.05mg·LNAA可以使鐵線蓮胚胎正常發(fā)育成熟的成功率達(dá)到47%，發(fā)芽率為54%;在此基礎(chǔ)上培養(yǎng)基中再添加10%的椰乳，種子發(fā)育成熟率和發(fā)芽率均顯著提高到62%。低溫處理和光培養(yǎng)25℃/暗培養(yǎng)15℃的溫度可以促進(jìn)鈴鐺鐵線蓮種子發(fā)芽，配合50mg.LGA或30mg.L6-BA處理打破休眠更加顯著。[結(jié)論]鐵線蓮胚可以通過離體挽救解決高溫帶來的敗育問題;植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理可以顯著打破種子休眠，促進(jìn)萌發(fā)。

關(guān)鍵詞：鈴鐺鐵線蓮;雜交;打破休眠;胚胎挽救

中圖分類號(hào)：S567文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-0384（2019）09-1040-07

0引言

（研究意義）鐵線蓮Clematis L是毛茛科、鐵線蓮屬中著名的藤本觀賞植物，全球共約300余種，我國(guó)有110種左右，全國(guó)各地都有分布。根據(jù)英國(guó)皇家園藝協(xié)會(huì)的分類，目前市場(chǎng)上常見的園藝品種可以分為：全緣組、佛羅里達(dá)組、早花大花組、晚花大花組、常綠組、南歐租、德克薩斯組、長(zhǎng)辦組和蒙大拿組等。德克薩斯組鐵線蓮以鈴鐺花型為主，以其極長(zhǎng)的花期和廣闊的適應(yīng)性和強(qiáng)大的抗病能力被廣大園藝愛好者所喜愛，但花徑較小，不適合作園林綠化材料，其他品系鐵線蓮花大艷麗而花期主要集中在4-5月，抗病性不強(qiáng)。如果將德克薩斯組鈴鐺鐵線蓮?fù)ㄐ痛?、花量多的大花鐵線蓮進(jìn)行雜交，可以增加其觀賞價(jià)值，在園林綠化中大量應(yīng)用。（前人研究進(jìn)展）植物胚是一種多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，胚胎發(fā)育完全成熟，沒有任何機(jī)械損傷的種子可直接播種成苗。但在雜交育種過程中，獲得的合子胚經(jīng)常在發(fā)育中途敗育或發(fā)生嚴(yán)重退化，導(dǎo)致不能正常出苗，嚴(yán)重影響了育種效率。通過離體培養(yǎng)進(jìn)行胚挽救，使可以敗育或退化的胚正常發(fā)育獲得和自然成熟一樣的種子和再生植株，這種技術(shù)在植物育種中具有十分重要的指導(dǎo)與實(shí)踐意義。導(dǎo)致植物種子休眠的主要原因分為外界環(huán)境因素和自身因素兩類;外界因素包括：溫濕度、光照、空氣、土壤微生物等，自身因素又包括種殼束縛、以及種胚未發(fā)育成熟等。有機(jī)酸、酚類、醛類、亞胺等物質(zhì)是種子內(nèi)部抑制發(fā)芽萌發(fā)的主要成分，這些物質(zhì)需經(jīng)過一段時(shí)間才能被種子分解代謝，以上幾種物質(zhì)共同造成部分植物種子發(fā)芽困艱難。曹昊等研究表明赤霉素處理能夠打破東北鐵線蓮種子的休眠，縮短發(fā)芽所需時(shí)間，10mg.LGA溶液浸種30min可以明顯促進(jìn)東北鐵線蓮種子萌發(fā)、提高發(fā)芽率，當(dāng)浸種濃度大于50mg.L時(shí)種子發(fā)芽率降低，表現(xiàn)出一定的毒害現(xiàn)象。因此，鐵線蓮休眠原因可能也與脫落酸、赤霉素、乙烯等內(nèi)源激素有關(guān)。（本研究切入點(diǎn)）在鐵線蓮雜交育種中，經(jīng)常遇到胚胎敗育和休眠時(shí)間過長(zhǎng)的問題，如鈴鐺鐵線蓮‘王夢(mèng)’、‘櫻桃唇’雜交授粉成功后，胚胎需要約80d左右才能完全成熟，但是在發(fā)育至55d左右，種子完全成熟前會(huì)突然敗育，導(dǎo)致結(jié)實(shí)率低，雜交效率不理想。鐵線蓮種子的萌發(fā)溫度盡量控制在15℃-25℃。普通鐵線蓮種子經(jīng)過1-2次自然低溫刺激可能萌發(fā)，雜交鐵線蓮種子需要2-3年甚至更久才能萌發(fā)。鈴鐺鐵線蓮雜交胚胎敗育的具體原因和打破休眠的研究尚未見報(bào)道。（擬解決的關(guān)鍵問題）本試驗(yàn)以德克薩斯組鈴鐺花型鐵線蓮‘王夢(mèng)’為材料進(jìn)行胚胎挽救和打破種子休眠的初步探索，以期為德克薩斯組鐵線蓮的繁殖及雜交育種提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試種子均采自福建農(nóng)林大學(xué)園藝遺傳育種教研室種質(zhì)資源圃5年生德克薩斯組鈴鐺鐵線蓮‘王夢(mèng)’。胚挽救試驗(yàn)種子采用‘王夢(mèng)’為母本與‘櫻桃唇’為父本的雜交種子。打破休眠試驗(yàn)種子采用‘王夢(mèng)’自花授粉的成熟種子。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子百粒重、相對(duì)含水量和吸水率的測(cè)定隨機(jī)取種子100粒，用電子天平稱重（精確至0.0001g），重復(fù)3次，然后計(jì)算平均值，由此得出‘王夢(mèng)’種子的百粒重。隨機(jī)取種子100粒，用60℃烘箱烘至恒重。重復(fù)3次，用下列公式計(jì)算種子的相對(duì)含水量：種子的相對(duì)含水量（%）=（100粒種子原重-千重）/100粒種子原重×100%。隨機(jī)取種子100粒，浸泡于水中，直至重量不再變化，稱重。重復(fù)3次，用下列公式計(jì)算種子的吸水率：種子的吸水率（%）=（100粒種子吸水后重量-100粒種子原重）/100粒種子原重×100%。

1.2.2胚胎挽救 采集父本剛開放花朵的花藥，收集花粉，放人培養(yǎng)皿中備用;母本半開放時(shí)，輕輕撥開花苞，將雄蕊拔除。用毛筆蘸取花粉，均勻涂抹到柱頭上。對(duì)授粉的花進(jìn)行套袋標(biāo)記父本母本和授粉日期。未完成雙受精過程的胚直接敗育（圖1），正常完成雙受精過程的胚生長(zhǎng)到45d時(shí)剝?nèi)ネ夥N皮可觀察到綠色飽滿的種仁（圖2），將其放入培養(yǎng)瓶中，加入洗衣粉搓洗10min，再用自來水沖洗60min，在超凈工作臺(tái)中用0.1%HgCl消毒8、10、12、15min后接人空白MS培養(yǎng)基中，5d后觀察褐變、污染情況，篩選最適消毒時(shí)間。

把無菌的種子分別接人不同濃度的6-BA和NAA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)40d后觀察種子發(fā)育情況，研究不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度對(duì)鐵線蓮胚胎發(fā)育的影響;以6-BA和NAA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，附加10%的椰乳，觀察椰乳對(duì)鐵線蓮胚胎發(fā)育的影響。每個(gè)處理為20粒種子，重復(fù)3次。培養(yǎng)基均以MS為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖30g.L，pH值6.0，培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照時(shí)間16h·d，光照強(qiáng)度4000lX。

將發(fā)育成熟的種子播種到光培養(yǎng)25℃，暗培養(yǎng)15℃的人工氣候箱中（基質(zhì)為泥炭和珍珠巖，體積比3：1），60d后觀察統(tǒng)計(jì)發(fā)芽情況。

發(fā)育率=種胚發(fā)育成熟數(shù)/接種數(shù)×100%

發(fā)芽率=發(fā)芽數(shù)/發(fā)育成熟數(shù)×100%

1.2.3打破種子休眠 將植株上成熟的種子采收后剝?nèi)ネ夥N皮，對(duì)照直接播種于基質(zhì)中（泥炭珍珠巖體積比3：1）在田間自然狀態(tài)下萌發(fā);處理1將種子放人蒸餾水中在4℃冰箱中放置1月后播種于基質(zhì)中放入田間自然狀態(tài)下萌發(fā);處理2直接播種于基質(zhì)中放置于人工氣候箱內(nèi)（光培養(yǎng)25℃/暗培養(yǎng)15℃）萌發(fā)，分別觀察低溫和晝夜溫差處理對(duì)鈴鐺鐵線蓮種子萌發(fā)的影響，每個(gè)處理為20粒種子，重復(fù)3次。40d后觀察統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

在上述研究基礎(chǔ)上，以經(jīng)過低溫+晝夜溫差處理的種子為對(duì)照，研究GA和6-BA處理對(duì)打破鈴鐺鐵線蓮種子休眠的影響。將植株上成熟的種子采收后剝?nèi)ネ夥N皮，放人蒸餾水中在4℃冰箱中放置1周后取出搓洗干凈未剝下的外種皮，吸干水后放人組培瓶，在4℃冰箱中再靜置3周后，將種子取出分別放人5、20、30、50、80mg.LGA或5、20、30、50、80mg.L6-BA中浸泡4h。取出種子用蒸餾水沖洗干凈后播入經(jīng)過高壓消毒過泥炭土與珍珠巖混合（體積比3：1，含水量75%）的基質(zhì)中，覆膜，再放人人工氣候箱（光培養(yǎng)25℃/暗培養(yǎng)15℃）。每處理20粒種子，重復(fù)3次。40d后觀察統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

2結(jié)果與分析

2.1 鐵線蓮‘王夢(mèng)’種子百粒重、相對(duì)含水量、吸水率的測(cè)定

百粒重直觀的反映種子的品質(zhì)，種子貯藏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)越多，百粒重越大。胚胎挽救取材于未成熟種子，種子百粒重可以幫助預(yù)估胚胎挽救培養(yǎng)時(shí)間。測(cè)定結(jié)果表明鐵線蓮‘王夢(mèng)’的種子百粒重為（2.672±0.013）g。有報(bào)道褐毛鐵線蓮的百粒重為（1.359±0.001）g，林地鐵線蓮的百粒重只有（0.133±0.004）g，與其他鐵線蓮相比，‘王夢(mèng)’的種子重量較大。

種子萌發(fā)與種子含水量關(guān)系密切，向日葵種子在含水量6%-7%時(shí)，短時(shí)間內(nèi)即可發(fā)芽，當(dāng)含水量在低于5.5%或高于7.5%時(shí)種子進(jìn)入休眠狀態(tài)，較難萌發(fā)，褐毛鐵線蓮種子的相對(duì)含水量為（9.33±0.01）%，棉團(tuán)鐵線蓮的相對(duì)含水量為（13.67±0.15）%，鐵線蓮‘王夢(mèng)’的種子相對(duì)含水量為（18.50±0.01）%，與其他鐵線蓮相比，相對(duì)含水量也較高。

2.2 不同消毒時(shí)間對(duì)鐵線蓮種子的影響

鈴鐺鐵線蓮種子褐變呈乳白色。根據(jù)表1可以看出隨著消毒時(shí)間的增加，鐵線蓮種子的褐變率逐漸升高，污染率逐漸下降。在消毒15min時(shí)，63.33%種子都出現(xiàn)褐變情況，但消毒較為徹底。在消毒8min時(shí)，褐變率最低，污染率最高。消毒時(shí)間控制在10-12min內(nèi)可以得到較低的褐變率和污染率。

2.3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)鐵線蓮種子胚胎發(fā)育的影響

胚胎挽救培養(yǎng)基配方及發(fā)育發(fā)芽情況如表2所示。在培養(yǎng)20d后可憑肉眼觀察到種子是否正常發(fā)育.正常發(fā)育的種子顏色呈淺棕色。厚度均勻，子葉飽滿，種胚發(fā)育完好，沒有干癟也沒有過度膨大，外形顏色均與自然成熟種子無異（圖3）。沒有正常發(fā)育的種子呈乳白色，少數(shù)深褐色，種仁異常膨大或干癟呈敗育狀態(tài)，內(nèi)部充滿水分（圖4-5）。正常發(fā)育種子和敗育種子對(duì)比（圖6），發(fā)育成熟播種后發(fā)芽（圖7）。

植物胚胎挽救所需的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度總體較低，不同6-BA和NAA的濃度配比對(duì)鐵線蓮胚胎挽救影響差異較大。從表2可以看出，低濃度的6-BA和NAA對(duì)鈴鐺鐵線蓮胚的發(fā)育率和發(fā)芽率影響較小，隨著2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的增加，胚的發(fā)育率和發(fā)芽率也逐漸上升。0.5mg.L6-BA與0.05mg·LNAA等比例混合使用可以使鐵線蓮胚胎正常發(fā)育成熟的成功率達(dá)到46.66%，同時(shí)使發(fā)芽率保持在53.57%。6-BA對(duì)胚胎挽救發(fā)芽率影響比較明顯，而不同水平的NAA對(duì)鐵線蓮胚胎挽救的發(fā)芽率影響不顯著。培養(yǎng)基中添加椰乳后，明顯提高種子的發(fā)育率和發(fā)芽率，0.5mg.L6-BA+0.05mg.LNAA+10%椰乳培養(yǎng)基中的種子的發(fā)育率和發(fā)芽率均達(dá)到最高。

2.4 不同處理對(duì)鐵線蓮種子萌發(fā)的影響

由表3可見，僅低溫處理或晝夜溫差處理的部分種子在播種后40d可以發(fā)芽，但萌發(fā)率較低。由表4可見，結(jié)合6-BA或GA處理的種子發(fā)芽率隨著處理濃度增加均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，低濃度的GA和6-BA對(duì)鈴鐺鐵線蓮種子的萌發(fā)均無明顯的促進(jìn)作用，在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度過高時(shí)反而對(duì)種子的萌發(fā)起抑制作用。50mg·LGA處理的種子發(fā)芽率達(dá)到了76.66%，30mg.L6-BA處理的種子發(fā)芽率最高，達(dá)到了81.66%。未經(jīng)任何處理的鈴鐺鐵線蓮從2018年7月3日采收播種到10月21日開始發(fā)芽需要108d，而30mg·L6-BA低溫處理的種子在70d時(shí)（30d低溫處理+40d發(fā)芽）發(fā)芽率達(dá)81.66%且發(fā)芽時(shí)間縮短38d。

3討論與結(jié)論

胚的活體轉(zhuǎn)移、活體培養(yǎng)和離體培養(yǎng)，是迄今為止已有報(bào)道的3種植物幼胚拯救方法。幼胚、敗育胚、退化胚等都可以作為胚胎挽救的材料.影響植物胚胎挽救成功率的因素主要有培養(yǎng)溫濕度、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比、胚發(fā)育情況、基本培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法、其他培養(yǎng)基添加物等。其中椰乳作為一種常用的培養(yǎng)基添加劑對(duì)胚的離體培養(yǎng)有重要的作用。陳容茂等發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加10%椰乳，可促進(jìn)龍眼胚狀體發(fā)育正常，甚至經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)可以直接萌發(fā)。添加椰乳對(duì)雜交東方百合幼胚離體培養(yǎng)成活率也有明顯的促進(jìn)作用?？赡苁怯捎谝橹泻蠱S培養(yǎng)基不能提供的種胚生長(zhǎng)發(fā)育所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

在田間栽培過程中發(fā)現(xiàn)鈴鐺鐵線蓮種子自然發(fā)育成熟需要80d左右。四月初雜交授粉，正常完成雙受精過程的胚生長(zhǎng)到45d時(shí)，發(fā)育正常，種仁飽滿，外種皮較軟，內(nèi)種皮發(fā)育完全，此后種子陸續(xù)開始敗育。本試驗(yàn)主要探究正常胚體外培養(yǎng)的可行性，遂在種子發(fā)育至45d時(shí)取材進(jìn)行胚胎挽救。實(shí)驗(yàn)全部過程均在2018年內(nèi)完成，但在2019年栽培中發(fā)現(xiàn)：5月整體氣溫較低，鐵線蓮種子生長(zhǎng)狀況良好，未出現(xiàn)敗育情況。查詢歷史天氣可知：2019年5月平均高溫24℃，平均低溫17℃，而2018年5月平均高溫32℃，平均低溫22℃，≥33℃以上的高溫天氣達(dá)到15d，且氣溫變化幅度較大，這很可能是導(dǎo)致胚敗育的原因.高溫引起導(dǎo)致植物敗育的機(jī)制只在棉花、水稻中有相關(guān)研究，花卉方面未見報(bào)道。經(jīng)過胚胎挽救培養(yǎng)的鈴鐺鐵線蓮種子成熟后播種60d的萌發(fā)率可以達(dá)到62%且發(fā)芽時(shí)間比自然狀態(tài)萌發(fā)提前40d左右。目前的胚胎挽救技術(shù)主要集中核果類果樹方面，花卉中只有月季、菊花等有少許研究。本研究驗(yàn)證了鐵線蓮未成熟種子進(jìn)行胚胎挽救的可行性，篩選了較優(yōu)消毒時(shí)間和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配方，為提高鐵線蓮雜交育種效率，培育新品種創(chuàng)造條件。

完全成熟的種子ABA含量最高。ABA與GA對(duì)植物種子萌發(fā)的影響完全相反。種子萌發(fā)困難的原因是種子休眠時(shí)內(nèi)部ABA含量升高，高濃度的ABA促進(jìn)種子休眠以便種子安全度過逆境;當(dāng)極端天氣結(jié)束，萌發(fā)環(huán)境適宜時(shí)，種子內(nèi)部ABA含量降低，GA濃度逐漸升高，這種激素濃度的動(dòng)態(tài)變化打破種子休眠，促進(jìn)種子在適宜的環(huán)境和時(shí)間節(jié)點(diǎn)萌發(fā)。三因子學(xué)說的觀點(diǎn)認(rèn)為：種子休眠和萌發(fā)的原因是種子內(nèi)部萌發(fā)促進(jìn)物和抑制物的動(dòng)態(tài)變化。萌發(fā)抑制物可以消除細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的對(duì)萌發(fā)的促進(jìn)作用，隨著種子萌發(fā)過程的進(jìn)行，種子內(nèi)部激素的動(dòng)態(tài)變化大致為赤霉素、細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的濃度在逐漸升高以及脫落酸的降低。赤霉素可代替低溫處理解除種子休眠，羅登攀的研究表明用250mg.LGA浸種6h可以顯著促進(jìn)臘梅種子的萌發(fā)。6-BA是人工合成的細(xì)胞分裂素類物質(zhì)，它的作用是細(xì)胞分裂和橫向增粗，提高種子發(fā)芽率，促進(jìn)種子發(fā)芽。20mg.L的6-BA對(duì)五指茄萌發(fā)、生根都有較好的促進(jìn)作用。本試驗(yàn)通過研究低溫、晝夜溫度變化、以及不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（6-BA、GA）對(duì)打破鈴鐺鐵線蓮種子休眠、促進(jìn)萌發(fā)的影響。結(jié)果表明低溫和光培養(yǎng)25℃/暗培養(yǎng)15℃晝夜溫差處理可以適當(dāng)促進(jìn)鈴鐺鐵線蓮的萌發(fā)，這2種處理配合6-BA、GA對(duì)促進(jìn)鈴鐺鐵線蓮萌發(fā)效果更加明顯。通過人工可控環(huán)境打破種子休眠，促進(jìn)提早萌發(fā)，是縮短鐵線蓮育種周期的有效手段。