槲皮素改善大鼠骨髓來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)功能及其機(jī)制研究*

蔣璐璐, 楊娜娜, 陳巧睿, 高 翔, 姚樹(shù)桐， 王大新, 秦樹(shù)存△

(1中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410011； 2泰山醫(yī)學(xué)院動(dòng)脈粥樣硬化研究所，山東省高校動(dòng)脈粥樣硬化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271000；3江蘇省蘇北人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，江蘇 揚(yáng)州 225001)

槲皮素改善大鼠骨髓來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)功能及其機(jī)制研究*

蔣璐璐1,3, 楊娜娜2▲, 陳巧睿2, 高 翔2, 姚樹(shù)桐2， 王大新3△, 秦樹(shù)存2△

(1中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410011；2泰山醫(yī)學(xué)院動(dòng)脈粥樣硬化研究所，山東省高校動(dòng)脈粥樣硬化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271000；3江蘇省蘇北人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，江蘇 揚(yáng)州 225001)

目的： 探討槲皮素(quercetin，QUE)對(duì)大鼠骨髓來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)生物學(xué)功能的影響與機(jī)制。方法: 密度梯度離心法分離大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，條件培養(yǎng)基EGM-2誘導(dǎo)分化后，進(jìn)行雙熒光染色及免疫表型鑒定。將培養(yǎng)14 d的細(xì)胞用PI3K抑制劑BYL719(3 μmol/L)和ERK抑制劑FR180204(15 μmol/L)預(yù)處理2 h后，再加入不同濃度QUE(0、10、20、40、80和100 μmol/L)處理。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移，Western blot法檢測(cè)AKT、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和ERK蛋白表達(dá)及磷酸化水平。結(jié)果: QUE呈濃度依賴(lài)性提高EPCs活力，促進(jìn)EPCs遷移；PI3K抑制劑BYL719能抑制QUE誘導(dǎo)的EPCs活力和遷移能力，ERK抑制劑FR180204能抑制QUE誘導(dǎo)的EPCs活力，而對(duì)EPCs遷移能力并沒(méi)有影響。QUE能激活A(yù)KT、eNOS和ERK蛋白；BYL719能同時(shí)抑制AKT和ERK蛋白的激活，F(xiàn)R180204僅能抑制ERK的激活，而未能抑制AKT的激活，但兩者對(duì)QUE誘導(dǎo)的eNOS蛋白表達(dá)均有抑制作用。結(jié)論: QUE能部分通過(guò)PI3K/AKT/eNOS和ERK/eNOS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，提高EPCs活力及遷移能力，促進(jìn)EPCs發(fā)揮心血管保護(hù)作用。

槲皮素； 內(nèi)皮祖細(xì)胞； 內(nèi)皮型一氧化氮合酶

血管內(nèi)皮細(xì)胞位于血管內(nèi)膜。如果內(nèi)皮細(xì)胞受損，內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)作為其前體細(xì)胞，能夠從外周組織或骨髓動(dòng)員至外周血，遷移、歸巢到受損部位，促進(jìn)血管壁內(nèi)皮的損傷修復(fù)[1]。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和損傷修復(fù)之間的動(dòng)態(tài)平衡在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2]。EPCs修復(fù)受損內(nèi)皮的機(jī)制與其增殖、遷移、血管生成等生物學(xué)功能有關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，有心血管疾病危險(xiǎn)因素的患者，如高血壓、高血糖、高血脂，其體內(nèi)EPCs的數(shù)量和功能均有所下降[4-5]。因此，提高EPCs功能將有助于修復(fù)血管內(nèi)皮損傷，從而抑制AS的發(fā)生發(fā)展。

近年來(lái)，植物黃酮類(lèi)作為一類(lèi)潛在的預(yù)防和治療心血管疾病的藥物受到了許多關(guān)注。其中，槲皮素(quercetin，QUE)是一種普遍存在于水果、蔬菜和堅(jiān)果內(nèi)的黃酮醇，例如蘋(píng)果、葡萄和洋蔥等，具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗癌和抗菌、抗病毒等多種生物學(xué)活性[6]。最近，QUE對(duì)心血管疾病的保護(hù)和治療價(jià)值被普遍認(rèn)可。連續(xù)2周給予AS模型ApoE-/-小鼠QUE (50 mg·kg-1·d-1)，能阻礙泡沫細(xì)胞的形成，減少AS形成過(guò)程中氧化和炎癥反應(yīng)[7]。我們近期研究發(fā)現(xiàn)QUE可提高EPCs的細(xì)胞活力，但對(duì)其機(jī)制并不清楚，也未有相關(guān)報(bào)道，在此本文探討QUE對(duì)EPCs增殖和遷移生物學(xué)功能及其機(jī)制的作用。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

SPF級(jí)雄性大鼠購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司；纖維連接蛋白(BD)；大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離液(TBD)；EBM-2培養(yǎng)基(Lonza)；M199培養(yǎng)基(HyClone)；胎牛血清(Gibco)；DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-1(BT)；兔單克隆CD133抗體(Novus)；兔多克隆FLK-1抗體(Abcam)；抗兔FITC免疫熒光染色試劑盒(Beyotime)；QUE(Sigma)；MTT試劑(Solarbio)；DMSO(Amresco)；Transwell小室(Costar)；DAPI(Roche)；抗β-actin、AKT和p-AKT抗體均購(gòu)自Sigma；抗內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)抗體(Abcam)；抗p-eNOS抗體(Millipore)；抗ERK和p-ERK抗體(Santa Cruz)；BYL719(Selleck)；FR180204(Cayman)；PVDF膜(Millipore)；ECL(Pierce)。

2 方法

2.1 大鼠骨髓來(lái)源EPCs的分離培養(yǎng) 4～6周齡大鼠10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉后頸椎脫臼處死，浸泡于75%乙醇10 min。剪取股骨和脛骨，用冷PBS反復(fù)沖洗骨髓腔，直至沖洗液清亮；再反復(fù)吹打沖洗液，直至沖洗液混勻，經(jīng)100 μm濾網(wǎng)過(guò)濾后加到等體積的單個(gè)核細(xì)胞分離液上，3 500 r/min離心30 min；吸取中間乳白色云霧狀單個(gè)核細(xì)胞層，用PBS洗滌細(xì)胞沉淀2次后，加入含15%胎牛血清的條件培養(yǎng)基EGM-2重懸細(xì)胞，以1×106/cm2細(xì)胞密度接種于包被了纖維連接蛋白的培養(yǎng)瓶中。3 d后去除非貼壁細(xì)胞，更換新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2 EPCs吸附Ac-LDL和結(jié)合UEA-1試驗(yàn) 將培養(yǎng)7 d 后的EPCs接種于鋪有纖維連接蛋白的蓋玻片上，加入DiI-Ac-LDL(2.5 g/L)，37 ℃孵育2 h；2%多聚甲醛固定5 min后，經(jīng)PBS潤(rùn)洗3次，每次5 min；再加入FITC-UEA-1(10 mg/L)，37 ℃孵育1 h后，PBS潤(rùn)洗3次，每次5 min；用抗熒光淬滅劑封片，在熒光顯微鏡下觀察，顯紅色熒光的為吸附Ac-LDL的EPCs，顯綠色熒光的為結(jié)合UEA-1的EPCs，雙陽(yáng)性細(xì)胞為正在分化的EPCs。

2.3 EPCs表面標(biāo)志免疫熒光染色 將培養(yǎng)14 d的EPCs接種于蓋玻片，用固定液室溫下固定15 min，經(jīng)PBS潤(rùn)洗5 min、3次，加入封閉液在水平搖床上輕搖1 h；然后分別加入 I 抗CD133和FLK-1在4 ℃下過(guò)夜，PBS潤(rùn)洗5 min×3次；最后加入FITC標(biāo)記抗兔 II 抗室溫下輕搖1 h，PBS潤(rùn)洗5 min×3次；DAPI染色10 min后，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察，CD133+FLK-1+EPCs顯綠色熒光。

2.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力 誘導(dǎo)分化14 d的細(xì)胞，胰酶消化后接種在96孔板內(nèi)，平均每孔接種5 000個(gè)細(xì)胞。饑餓處理后，加入PI3K抑制劑BYL719(3 μmol/L)和ERK抑制劑FR180204(15 μmol/L)2 h后，再加入不同濃度QUE(0、10、20、40、80、100 μmol/L)處理24 h。之后每孔加入10 μL MTT(5 g/L)，37 ℃孵育4 h后棄上清，加入150 μL DMSO，搖床震蕩搖勻10 min，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度，以0 μmol/L QUE組的細(xì)胞活力為1。

2.5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移 誘導(dǎo)分化14 d的細(xì)胞，胰酶消化后接種于6孔板中。饑餓處理后，加入PI3K抑制劑BYL719(3 μmol/L)和ERK抑制劑FR180204(15 μmol/L)2 h后，再加入不同濃度 QUE(0、10、20、40、80、100 μmol/L)處理6 h。經(jīng)胰酶消化，M199重懸調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×108/L，取100 μL細(xì)胞接種于Transwell小室上室，下室加入條件培養(yǎng)基EGM-2誘導(dǎo)細(xì)胞遷移。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育36 h后，取出小室，用棉簽擦去小室內(nèi)細(xì)胞，下層細(xì)胞經(jīng)冰乙醇固定后，DAPI室溫染色10 min，PBS潤(rùn)洗3次，每次5 min，在熒光顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)。

2.6 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 誘導(dǎo)分化14 d的細(xì)胞，胰酶消化后接種于6孔板中，加入PI3K抑制劑BYL719 (3 μmol/L)和ERK抑制劑FR180204 (15 μmol/L)2 h后，再加入不同濃度QUE(0、40、80、100 μmol/L)處理，在不同時(shí)點(diǎn)提取蛋白。經(jīng)BCA蛋白定量后，加入5×上樣緩沖液，煮沸5 min。電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，經(jīng)封閉、 I 抗和 II 抗孵育后，檢測(cè)AKT、eNOS、ERK及其磷酸化蛋白的表達(dá)情況。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，所有數(shù)據(jù)均用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 EPCs的培養(yǎng)與鑒定

誘導(dǎo)分化培養(yǎng)4 d的EPCs呈克隆樣生長(zhǎng)，克隆內(nèi)部細(xì)胞呈鋪路石樣，周邊細(xì)胞呈針樣；傳代后細(xì)胞成梭形，吸附低密度脂蛋白和結(jié)合凝集素試驗(yàn)結(jié)果顯示，約80%細(xì)胞既能吸附Ac-LDL又能結(jié)合UEA-1，為正在分化的EPCs；免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)EPCs表面表達(dá)CD133和FLK-1；且這些誘導(dǎo)分化的細(xì)胞在體外無(wú)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞情況下能成血管，從而證明所誘導(dǎo)分化的細(xì)胞為晚期EPCs，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Culture and identification of EPCs derived from rat bone marrow. A: EPCs showing a cobblestone-like morphology cultured for 4 d in EGM-2 medium; B: EPCs exhibiting a fusiform morphology after passage; C: EPCs taking DiI-ac-LDL; D: EPCs binding FITC-UEA-1; E: EPCs expressing surface marker CD133; F:EPCs expressing surface marker FLK-1； G: EPCs forming capillary-like sprouts on Matrigel. The scale bar=50 μm.

圖1 大鼠骨髓來(lái)源EPCs的培養(yǎng)與鑒定

2 QUE對(duì)EPCs活力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，QUE呈濃度依賴(lài)性提高EPCs活力。低劑量組(10和20 μmol/L)與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；40、80和100 μmol/L QUE能明顯提高EPCs活力(P<0.01)，尤以100 μmol/L QUE組最為明顯，見(jiàn)圖2。

3 QUE對(duì)EPCs遷移能力的影響

如圖3所示，在一定范圍內(nèi)，QUE呈濃度依賴(lài)性促進(jìn)EPCs遷移，與對(duì)照組相比，20 μmol/L QUE組能提高EPCs的遷移能力(P<0.05)，40、80和100 μmol/L QUE組EPCs遷移能力明顯升高(P<0.01)，尤以80 μmol/L QUE組最為明顯。

Figure 2.The effects of QUE on the viability of EPCs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖2 QUE對(duì)EPCs活力的影響

Figure 3.The effects of QUE on the migration of EPCs. The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖3 QUE對(duì)EPCs遷移能力的影響

4 PI3K抑制劑BYL719和ERK抑制劑FR180204抑制QUE誘導(dǎo)的EPCs活力

結(jié)果顯示，100 μmol/L QUE處理細(xì)胞24 h，細(xì)胞活力較對(duì)照組升高(P<0.01)；而給予PI3K抑制劑BYL719和ERK抑制劑FR180204預(yù)處理，則顯著降低QUE誘導(dǎo)的細(xì)胞活力(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The improvement of viability of EPCs induced by QUE was inhibited by PI3K inhibitor (BYL719) and ERK inhibitor (FR180204). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsQUE group.

圖4 BYL719和FR10204抑制QUE誘導(dǎo)的EPCs活力增強(qiáng)

5 PI3K抑制劑BYL719抑制QUE誘導(dǎo)的EPCs遷移能力

與對(duì)照組相比，80 μmol/L QUE明顯提高EPCs遷移能力(P<0.01)，給予PI3K抑制劑BYL719處理，顯著抑制QUE誘導(dǎo)的EPCs遷移能力增強(qiáng)(P<0.01)；ERK抑制劑FR180204不能阻斷QUE的這種作用，見(jiàn)圖5。

6 QUE在不同時(shí)點(diǎn)對(duì)AKT、eNOS和ERK活化的影響

與對(duì)照組比較，QUE在5 min和15 min時(shí)能激活p-AKT表達(dá)(P<0.05)，在30 min和60 min時(shí)顯著上調(diào)p-AKT蛋白水平(P<0.01)，尤以30 min組最為明顯；且在60 min時(shí)能明顯上調(diào)eNOS蛋白表達(dá)和磷酸化水平(P<0.01)；同時(shí)QUE在30 min時(shí)可明顯升高p-ERK蛋白水平(P<0.01)，見(jiàn)圖6。

7 不同濃度QUE對(duì)AKT、eNOS和ERK活化的影響

如圖7所示，與對(duì)照組相比，QUE呈濃度依賴(lài)性升高AKT和ERK蛋白磷酸化水平(P<0.01)， 100μmol/L組能顯著提高eNOS蛋白的表達(dá)和磷酸化水平(P<0.01)。

Figure 5.The ability of migration of EPCs enhanced by QUE was inhibited by PI3K inhibitor (BYL719). The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsQUE group.

圖5 BYL719抑制QUE誘導(dǎo)的EPCs遷移能力增強(qiáng)

Figure 6.The effects of QUE on ERK, AKT and eNOS protein expression and activation in EPCs at different time points. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖6 QUE處理不同時(shí)間對(duì)ERK、AKT和eNOS蛋白表達(dá)和激活的影響

8 PI3K抑制劑BYL719和ERK抑制劑FR180204抑制AKT和ERK的活化

Figure 7.The effects of QUE at different concentrations on the protein expression and activation of ERK, AKT and eNOS in the EPCs. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖7 QUE在不同濃度對(duì)ERK、AKT和eNOS蛋白表達(dá)和激活的影響

結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，100 μmol/L QUE可明顯激活A(yù)KT、eNOS和ERK蛋白(P<0.01)；給予PI3K抑制劑BYL719預(yù)處理后，能明顯抑制AKT和ERK蛋白的活化(P<0.01)；給予ERK抑制劑FR180204預(yù)處理，能明顯抑制ERK的活化(P<0.01)，但未能阻斷AKT的活化；但兩者對(duì)QUE誘導(dǎo)的eNOS蛋白表達(dá)升高和活化均有抑制作用，見(jiàn)圖8。

討 論

自Asahara等[8]首次從人外周血分離出EPCs后，大量學(xué)者致力于對(duì)來(lái)源于骨髓或外周血EPCs的研究。EPCs起源于成血管細(xì)胞，細(xì)胞表型具有較強(qiáng)的可塑性[9]。因此，在不同的培養(yǎng)條件下，誘導(dǎo)分化的EPCs能表達(dá)不同的表面標(biāo)志，這就在一定程度上限制了EPCs從基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化的順利實(shí)施。近年來(lái)，多數(shù)學(xué)者普遍認(rèn)為，根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短，EPCs主要分為早期EPCs和晚期EPCs。早期EPCs表面表達(dá)CD133和CD34等，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，晚期EPCs能夠表達(dá)更加成熟的內(nèi)皮系標(biāo)志，如FLK-1和vWF等，并顯示出較強(qiáng)的增殖、遷移能力[10]。來(lái)源于骨髓或外周血的EPCs在多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，它們能夠通過(guò)再內(nèi)皮化，促進(jìn)血管內(nèi)膜損傷內(nèi)皮的修復(fù)；通過(guò)血管新生，增加缺血部位的血液灌流，改善組織缺血缺氧狀態(tài)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，心血管疾病危險(xiǎn)因素的累積與EPCs功能紊亂及數(shù)量降低存在密切關(guān)系[12]。因此，提高EPCs生物學(xué)功能可能有望成為治療AS的主要策略之一。

QUE是黃酮類(lèi)化合物家族中的一種黃酮醇，在洋蔥、蘋(píng)果等蔬菜水果中含量豐富，具有多種藥理作用，包括抗炎、抗氧化、抗癌及抗過(guò)敏反應(yīng)等[13]。近年來(lái)，許多研究報(bào)道QUE能在AS、缺血再灌注損傷、高血壓等心血管疾病中發(fā)揮保護(hù)作用[13]，因此吸引了越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注。Shen等[15]發(fā)現(xiàn)給予高脂飲食的ApoE-/-小鼠QUE(1.5 mg/d)2周后，與安慰劑組相比，QUE組能對(duì)抗氧化誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷和AS進(jìn)展。Yang等[16]發(fā)現(xiàn)QUE通過(guò)下調(diào)ICAM-1、VCAM-1等炎癥因子，能夠?qū)笻2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而發(fā)揮其心血管保護(hù)作用，在一定程度上阻礙AS的發(fā)展。然而，一些學(xué)者在其它動(dòng)物模型和細(xì)胞類(lèi)型中并未得出一致結(jié)果。Lin等[17]和Zhao等[18]研究發(fā)現(xiàn)，QUE能夠抑制轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎節(jié)間血管、背部動(dòng)脈及尾部靜脈的形成；在體外，QUE呈濃度依賴(lài)性地抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的成血管作用，部分通過(guò)VEGF/VEGFR2信號(hào)通路調(diào)控。此外，由于QUE水溶性差、不穩(wěn)定，且首過(guò)消除效應(yīng)明顯，導(dǎo)致其生物利用度低下[19]。因此，在QUE的臨床應(yīng)用中，仍需開(kāi)發(fā)新的劑型以提高QUE的溶解性和可用率。

Figure 8.The effects of BYL719 and FR180204 on the protein expression and activation of ERK, AKT and eNOS induced by QUE in EPCs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsQUE group.

圖8 BYL719和FR180204對(duì)QUE誘導(dǎo)的ERK、AKT和eNOS蛋白表達(dá)和激活的影響

本研究以EPCs為研究對(duì)象，在給予QUE處理后，采用MTT法、Transwell法和Western blot法檢測(cè)QUE對(duì)EPCs活力、遷移能力及AKT、eNOS和ERK蛋白表達(dá)和激活的影響。結(jié)果顯示，QUE呈濃度依賴(lài)性提高EPCs活力和遷移能力；AKT、eNOS和ERK蛋白分析表明，QUE能激活A(yù)KT、eNOS和ERK的磷酸化。PI3K/AKT和ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞多種生理過(guò)程中起著極為重要的作用，涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育及死亡等。為了進(jìn)一步確認(rèn)QUE是否通過(guò)PI3K/AKT/eNOS和ERK/eNOS信號(hào)通路調(diào)控EPCs生物學(xué)功能，給予PI3K抑制劑BYL719和ERK抑制劑FR180204預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，QUE可明顯上調(diào)p-AKT、eNOS、p-eNOS和p-ERK蛋白表達(dá)，BYL719能抑制QUE對(duì)AKT和ERK的磷酸化；FR180204能明顯抑制ERK的活化，而未能阻斷AKT的活化；但兩者對(duì)QUE誘導(dǎo)的eNOS蛋白表達(dá)和磷酸化作用均有明顯抑制作用，提示QUE通過(guò)PI3K/AKT/eNOS和ERK/eNOS通路提高EPCs的增殖和遷移功能。我們前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白A-Ⅰ模擬肽rev-D4F能通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)途徑提高小鼠骨髓源EPCs增殖、遷移和成血管等生物學(xué)功能[20-21]。同時(shí)，Wang等[22]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過(guò)ERK/eNOS信號(hào)通路可減輕流體剪切力導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，QUE能部分通過(guò)PI3K/AKT/eNOS和ERK/eNOS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，提高EPCs活力和遷移能力，發(fā)揮其心血管保護(hù)作用。然而，除了以上2條信號(hào)通路，QUE是否還能通過(guò)其它傳遞途徑調(diào)控EPCs生物學(xué)功能，如p38 MAPK、Sirt1等，仍需進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Quercetin improves biological functions of rat bone marrow-derived EPCs

JIANG Lu-lu1, 3, YANG Na-na2, CHEN Qiao-rui2, GAO Xiang2, YAO Shu-tong2, WANG Da-xin3, QIN Shu-cun2

(1DepartmentofCardiovascularMedicine,TheSecondXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410011,China;2InstituteofAtherosclerosis,KeyLaboratoryofAtherosclerosisinUniversitiesofShandong,TaishanMedicalUniversity,Taian271000,China;3DepartmentofCardiovascularMedicine,NorthernJiangsuPeople’sHospital,Yangzhou225001,China.E-mail:13583815481@163.com;daxinw2002@sina.com)

AIM: To investigate the effect of quercetin on the biological functions of rat bone marrow-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and its potential mechanisms. METHODS: The bone marrow-derived mononuclear cells of Sprague-Dawley rats were isolated by density gradient centrifugation. The differentiated EPCs were cultured specially and stained with DiI-Ac-LDL and FITC-UEA-1. CD133+and FLK-1+were detected on the cell surfaces. After 14 d, the EPCs were incubated with a PI3K inhibitor BYL719 (3 μmol/L) and an ERK inhibitor FR180204 (15 μmol/L). After incubation of the inhibitors for 2 h, the cells were treated with quercetin at different concentrations (0, 10, 20, 40, 80 and 100 μmol/L). MTT assay and Transwell assay were used to detect cell viability and the number of migratory cells. The protein levels of AKT, eNOS, ERK and their phosphorylated status were determined by Western blot. RESULTS: Quercetin enhanced the viability and migration of the EPCs at a dose-dependent manner. However, the PI3K inhibitor BYL719 suppressed the QUE-induced cell viability and migration. Moreover, ERK inhibitor FR180204 exerted the similar inhibitory effect on the cell viability but had no effect on cell migration. Quercetin activated the phosphorylation of AKT, eNOS and ERK. On the other hand, BYL719 was observed to inhibit the phosphorylation of AKT and ERK. FR180204, however, was showed to inhibit the phosphorylation of ERK only. On the contrast, the stimulatory effects that quercetin exerted on the expression of eNOS and its phosphorylation were suppressed by BYL719 and FR180204. CONCLUSION: Quercetin stimulates the viability and migration of EPCs via PI3K/AKT/eNOS and ERK/eNOS signaling pathway, which would be beneficial for cardiovascular health.

Quercetin; Endothelial progenitor cells; Endothelical nitric oxide synthase

1000- 4718(2017)05- 0843- 08

2016- 12- 19

2017- 03- 29

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81600360)；山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. ZR2012HL18)；山東省教育廳科技計(jì)劃(No. J14LK03)；江蘇省“333工程”二層次項(xiàng)目(No. BRA2015171)

R329.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.013

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△通訊作者 秦樹(shù)存 Tel: 0538-6222986; E-mail: 13583815481@163.com; 王大新 Tel: 0514-87373039; E-mail: daxinw2002@sina.com

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