巨大型蒲公英根脂溶性成分的抗氧化活性及抑菌實驗研究

梁引庫

（陜西理工學院，陜西省資源生物重點實驗室，陜西漢中723000）

蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand-Mazz）為菊科多年生草本植物[1-2]，是一種藥食兩用的多年生草本植物，在我國具有悠久使用歷史。但是在以往的利用中，主要是以藥用為主。臨床上蒲公英常用于胃炎、乳腺炎、膽道感染[3]、十二指腸炎[4]、闌尾炎[5]、病毒性肝炎[6]、胰腺炎[7]等多種炎癥的治療。在抗氧化方面，300μg·mL-1的蒲公英水提物對缺氧缺糖心肌細胞[8]、四氯化碳誘導原代大鼠肝細胞損傷[9]都有一定的保護作用。蒲公英也可增加機體內(nèi)源性抗衰老物質活性，抑制脂質過氧化反應，或具有直接清除自由基作用，對延緩衰老具有十分重要的意義[10]。以上研究都提示蒲公英具有很好的抑菌和抗氧化的能力。但是這些對蒲公英的研究主要集中在藥用成分上，而開發(fā)關于蒲公英的食品添加劑方面的研究很少見報道，尤其是關于開發(fā)蒲公英天然防腐劑方面的研究在國內(nèi)外還未見報道。本研究通過提取蒲公英根脂溶性成分，利用氣相色譜質譜聯(lián)用儀分析鑒定蒲公英根的脂溶性成分組成，并對蒲公英的脂溶性成分的抗氧化活性和抑菌活性進行了初步的分析研究，探究其抗氧化能力和抑菌效果，從而為開發(fā)具有抗氧化功能和抑菌功能的天然、無毒的食品添加劑或者天然食品抗氧化劑、天然食品防腐劑提供理論研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巨大型蒲公英 由青海省農(nóng)科院提供，花期采收，經(jīng)陜西理工學院李新生教授鑒定為蒲公英，藥材干燥粉碎過80目篩；乙醚、石油醚、苯、甲醇、氫氧化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、番紅花紅、乙二胺四乙酸二鈉、無水乙醇、濃硫酸、硫酸鈉、鉬酸銨、三羥基甲烷、鹽酸（37.5%）、鄰苯三酚、米勒-海頓瓊脂、二甲基亞砜試劑 均為分析純；大腸埃希氏菌（Escherichia coli，ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC25925）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtillis，CMCC63501）、白假絲酵母菌（Candida albicans，CMCC85021） 以上菌株凍干菌種由中國藥品生物制品檢定所中國醫(yī)學細菌保藏中心提供，-80℃低溫冰箱凍存，實驗前復蘇傳代使用。

GC-MS ITQ900型氣相色譜質譜儀 美國熱電；FA2204B型電子天平 上海精密科學儀器有限公司；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；DZ-2BC型真空干燥箱 南京曉曉儀器設備有限公司；JJ-2（2003-61）型組織搗碎勻漿機 江蘇省金壇市環(huán)宇科學儀器廠；UV2550型分光光度計日本島津公司；YXQ-LS-50 SⅡ型全自動立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；BIO1500-Ⅱ-A2型生物安全柜 上海振梓創(chuàng)空氣凈化設備有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；Ф3mm瓊脂平板打孔器 西安交通大學醫(yī)學院儀器維修廠加工生產(chǎn)；Ф6mm濾紙片121℃30min高壓蒸汽滅菌，80℃烘干備用 本室制備；一次性9cm無菌培養(yǎng)皿 江蘇康健醫(yī)療用品有限公司，批號：20100315。

1.2 實驗方法

1.2.1 蒲公英脂溶性成分的提取 花期采收蒲公英根，洗凈后于120℃殺青，80℃下烘至衡重，粉碎過80目篩；取一定量蒲公英根粉末于索氏提取儀中，以乙醚為提取溶劑，提取蒲公英根中的脂溶性成分；提取物與水1∶1混合，離心靜置分層，取乙醚層，棄水層和沉淀，重復3次；干燥乙醚層可得蒲公英脂溶性成分初步純化產(chǎn)品。

1.2.2 蒲公英脂溶性成分的甲酯化 取蒲公英根的脂溶性成分1g于100mL容量瓶中，加入16mL苯和石油醚的混合液（苯和石油醚體積比為1∶1），充分振蕩使其溶解。再加入0.8mol·L-1的KOH-甲醇溶液，振蕩5min，最后加入蒸餾水至刻度線。靜止30min，用微量注射器吸取一定量的上層液，再用體積比1∶1的苯和石油醚混合液稀釋[11，19]，GC-MS檢測。

1.2.3 GC-MS分析條件 色譜柱HP-5彈性石英毛細管柱（30m×250μm×0.25μm）；載氣為氦氣（99.999%），流量1mL·min-1；柱前壓63kPa，進樣口溫度250℃；程序升溫：初始溫度80℃，然后每分鐘8℃升溫至150℃，再以每分鐘5℃升溫至210℃，保留3min，然后從210℃以4℃·min-1升溫至230℃，然后以每分鐘5℃升溫至280℃并保留15min；進樣量：0.2μL；分流比40∶1。MS條件：EI離子源：70eV；離子源溫度230℃；連接器溫度250℃；溶劑延遲3min；加速電壓250eV；掃描質量范圍為50～550amu。

1.2.4 對羥基自由基的清除 Fenton氧化法。取0.15mol·L-1、pH7.4的磷酸緩沖溶液1.0mL，40μg·mL-1番紅花1.0mL，0.945mmol·L-1EDTA-Fe（Ⅱ）（新鮮配制）1.0mL，不同濃度的樣品溶液0.5mL，3%的H2O21.0mL（新鮮配制），混合后在37℃水浴中反應30min后在520nm處測定吸光度?？瞻捉M以0.5mL蒸餾水代替樣品測定吸光度A0，對照組以1.5mL蒸餾水代替H2O2和樣品測定吸光度A，用3.5mL蒸餾水代替番紅花紅、EDTA-Fe（Ⅱ）、H2O2、樣品，1.0mL磷酸鹽緩沖溶液，調(diào)零。并按下式計算清除率[14-15]。

1.2.5 總抗氧化活性的測定——磷鉬絡合物法 配制不同濃度的樣品溶液。磷鉬試劑是終濃度為0.6mol·L-1濃硫酸、28mmol·L-1磷酸鈉和4mmol·L-1鉬酸銨的溶液。在10mL比色管中，分別加入4mL上述磷鉬試劑液、0.4mL樣品液，95℃水浴中恒溫90min，在695nm波長下測吸光度A。所有測定平行進行三次，取平均值[16]。

1.2.6 對超氧陰離子的清除作用——鄰苯三酚自氧化 取配好的Tris-HCL緩沖液4.5mL、4mL蒸餾水在25mL的試管中混勻后在37℃水浴中保溫25min，取出后立即加入在37℃預熱過的鄰苯三酚0.5mL，迅速搖勻后倒入比色皿，325nm下每隔30s測定吸光度。計算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加，以10mmol·L-1HCL溶液配制空白光作為對照，記錄結果[17]。

按照上述步驟在加入鄰苯三酚前先分別加入1mL不同濃度的樣品溶液，同樣以10mmol·L-1HCL溶液配制空白管作為對照，測定吸光度。按下列公式計算抑制率：

式中：△A1/△t為鄰苯三酚自氧化時反應速率；△A2/△t為加入樣品后鄰苯三酚自氧化速率。

1.2.7 脂溶性成分的抑菌實驗

1.2.7.1 菌體復蘇 將實驗菌種復蘇，傳代于肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h。與麥氏比濁管比濁法測定細菌數(shù)，用10%二甲基亞砜無菌去離子水配制成106CFU·mL-1菌液備用。

1.2.7.2 樣品處理 將樣本瓶精確稱重。取1mL二甲基亞砜加入到樣本瓶，用力振搖使油劑樣本溶解。將溶解的樣本完全吸出至無菌試管。再將樣本瓶精確稱重，減重法計算樣本量和樣本溶液濃度，用無菌20%二甲基亞砜去離子水調(diào)配樣本濃度至測試濃度。在96孔細胞培養(yǎng)板上用20%二甲基亞砜將樣本液做連續(xù)二倍梯度稀釋5個梯度，每個梯度0.2mL。

1.2.7.3 微孔擴散法 于培養(yǎng)皿中加實驗菌液0.2mL，傾注加熱融化后冷卻至50℃的10%二甲基亞砜MHA 20mL，快速混合，室溫靜置待培養(yǎng)基冷凝。用打孔器在平板上打孔，孔徑3mm。按標記加入各梯度濃度樣本液20μL/孔。溶劑對照孔加DMSO 20μL，陽性對照孔加0.5%碘伏溶液20μL。

1.2.7.4 紙片抑菌法 制備MHA平板，滴加實驗菌液50μL至平板表面，用無菌L形玻棒將菌液涂勻。用微量移液器吸取不同濃度梯度的樣本液10μL分別滴加到直徑6mm無菌濾紙片上，將濾紙片貼于平板表面。溶劑對照紙片含10μL的DMSO，陽性對照紙片含10μL的0.5%碘伏溶液。

1.2.7.5 培養(yǎng) 將平板倒置，于4℃冰箱靜置6h，移入普通培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)24h后觀察實驗結果，測定樣本孔（紙片周圍無細菌生長的抑菌環(huán)直徑：抑菌環(huán)直徑微孔擴散法大于5mm，紙片法大于8mm判為抑菌陽性，低于此標準的判為抑菌陰性）。

2 結果與討論

2.1 GC-MS檢測蒲公英根脂溶性成分

圖1 蒲公英根脂溶性成分GC-MS圖Fig.1 GC-MS chromatograms of Dandelion roots liposoluble constituents

表1 GC-MS分析蒲公英根的脂溶性成分Table 1 Gas mass spectrometry results in the determination of liposoluble constituents of the dandelion roots

GC-MS分析蒲公英根中脂溶性成分發(fā)現(xiàn)（見圖1、表1），蒲公英根中含有27種化合物，對這27種化合物進行分析表明，蒲公英根中主要有十六酸、9，12-十八碳二烯酸（Z，Z）和反-13-硬脂酸等。十六酸、9，12-十八碳二烯酸（Z，Z）和反-13-硬脂酸的相對百分含量分別為：20.3%、24.8%和20.1%，三種物質的總量占脂溶性成分的65.2%。

2.2 蒲公英根的抗氧化活性

圖2 蒲公英根脂溶性成分對羥基的清除Fig.2 Dandelion roots of liposoluble constituents of the hydroxyl radicals

2.2.1 對羥基自由基的清除 圖2表明，隨著樣品濃度的增大，蒲公英根脂溶性成分對羥基自由基的清除率越高，當濃度為1.6mg·mL-1時蒲公英根脂溶性成分對羥基自由基的清除率最大，為59.1%。但是當蒲公英根脂溶性成分的濃度大于0.8mg·mL-1時，其對羥基自由基的清除能力趨于平穩(wěn)。莫云燕等研究發(fā)現(xiàn)[18]，VC清除50%的羥基自由基所需濃度為0.1031mg·mL-1，而蒲公英脂溶性成分清除50%羥基自由基所需濃度約為0.8mg·mL-1，由此可見蒲公英根脂溶性成分對羥基自由基的清除能力低于VC的清除能力。

2.2.2 總抗氧化活性的測定 在所測定的濃度范圍內(nèi)，蒲公英根脂溶性成分的吸光度隨濃度增加而逐漸加強，表明總抗氧化活性逐漸增強（見圖3）。當蒲公英根脂溶性成分濃度為3mg·mL-1時，根脂溶性成分的吸光度最大，為0.975，表明其總抗氧化能力也最強。從總體的變化趨勢看，其總抗氧化活性隨著濃度的增高而增高，但與濃度不成線性關系。

圖3 磷鉬絡合物法測樣品的總抗氧化活性Fig.3 Phosphomolybdate complex method measured sample of the total antioxidant activity

2.2.3 超氧陰離子自由基清除作用 采用鄰苯三酚自氧化法測試了蒲公英脂溶性成分對鄰苯三酚自氧化過程中產(chǎn)生的超氧陰離子的抑制作用。實驗結果表明（見圖4），隨著樣品濃度的增加，對鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的超氧陰離子的抑制作用越強，當濃度為1.6mg·mL-1時，根的抑制率最高，抑制率為29.9%。而李瑞光[19]研究發(fā)現(xiàn)，VC對超氧陰離子的抑制率達到50%時，其濃度約為0.2mg·mL-1；袁建鋒[20]研究發(fā)現(xiàn)，VC對超氧陰離子的抑制率達到50%時，其濃度約為0.101mg·mL-1，其濃度低于蒲公英根抑制率為29.9%的抑制濃度。由此可見蒲公英根脂溶性成分對超氧陰離子的抑制能力低于VC，但是還具有較好的抑制能力。

2.3 脂溶性成分的抑菌實驗

在4株實驗菌平板上，對照DMSO紙片和微孔周圍無抑菌環(huán)，表明二甲基亞砜對細菌生長無影響。陽性對照0.5%碘伏溶液微孔和紙片周圍均有大于1.5cm的抑菌環(huán)，表明實驗方法無誤。依據(jù)微量二倍連續(xù)梯度稀釋法測定最小抑菌濃度（MIC），同時采用平板轉種法測定最小殺菌濃度（MBC）。蒲公英根脂溶性成分對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌株、枯草芽孢桿菌株和白假絲酵母菌株4株實驗菌株均有明顯的抑菌作用。蒲公英根脂溶性成分對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌和白假絲酵母菌的最小抑菌濃度分別為2.06、4.66、6.24和3.56mg·mL-1，最小殺菌濃度分別為3.12、5.82、8.68和4.98mg·mL-1。表明蒲公英根脂溶性成分對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌和白假絲酵母菌具有良好的抑制能力，尤其是對金黃色葡萄球菌的抑制能力更強。

3 結論

微生物的大量繁殖和食品加工過程對食品的造成生物污染是食品腐敗變質的主要因素，為了延長食品的保藏期，提高食品質量，人們在食品加工過程中添加各種活性物質使食品中的有害微生物失活并且降低食品被氧化變質的過程，而添加食品防腐劑和抗氧化劑就是其中一種主要的措施。但由于人們對食品添加劑的認識有限導致一些食品添加劑潛在危害未被發(fā)現(xiàn)，這給食品安全造成了一定的安全隱患。而天然防腐劑和抗氧化劑成分的毒性遠遠低于人工合成的，因此，近年來從自然界尋求天然食品防腐劑和抗氧化劑的研究已引起各國科學家的高度重視。

本研究對蒲公英根的脂溶性成分及其活性進行了分析研究，研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英根脂溶性成分約有27種，主要有十六酸、9，12—十八碳二烯酸（Z，Z）和反-13-硬脂酸等?？寡趸瘜嶒炑芯勘砻?，脂溶性成分具有較好的抗氧化能力，且抗氧化能力隨著濃度的升高而增加，但其對羥基自由基、對超氧陰離子的清除能力低于VC。在抑菌方面，脂溶性成分對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌株、枯草芽孢桿菌株和白假絲酵母菌株均有很好的抑制能力，尤其是對金黃色葡萄球菌的抑制能力最高，其最小抑菌濃度和最小殺菌濃度分別為：2.06mg·mL-1和3.12mg·mL-1。由此可見蒲公英脂溶性成分是一種良好抑菌物質，并且具有一定的抗氧化活性。

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