別旁茶乙醇提取物對(duì)炎癥性腸病的保護(hù)作用

謝方镕，高磊，李思荃，鄧廣輝，聶玉強(qiáng)，宋雨鴻

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市一人民醫(yī)院，廣東 廣州 510180； 2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515； 3.南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 廣州 510315； 4.廣州市干部療養(yǎng)院消化內(nèi)鏡科，廣東 廣州 510530)

炎癥性腸病(IBD)是一種臨床常見但病因不明并且治療困難的疾病，臨床常見潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn’s disease,CD)2種亞型，在經(jīng)濟(jì)較為發(fā)達(dá)的國(guó)家及地區(qū)發(fā)病率非常高。近年來不少研究發(fā)現(xiàn)，腸道黏膜上皮的完整性破壞是IBD發(fā)病的關(guān)鍵步驟，以保護(hù)腸道黏膜上皮完整從而防止疾病的發(fā)生發(fā)展為切入點(diǎn)治療IBD具有巨大潛力[1]。別旁茶(Bie Pang Cha,BPC)是一種具有悠久胃腸道疾病治療歷史且藥效可靠的民族藥物，是木犀科素馨亞科素馨屬扭肚藤種扭肚藤Jasminumelongatum(Bergium) Willd的干燥嫩莖及葉[2]。它具有強(qiáng)大的抗炎止瀉鎮(zhèn)痛作用，臨床上常用于治療胃腸炎[3]。有研究顯示，BPC的甲醇提取物通過作用于基底外側(cè)β-腎上腺素受體從而抑制胃腸道Cl-的分泌，這一現(xiàn)象提示該藥可以減少平滑肌運(yùn)動(dòng)、減少排便頻率，并且可能還具有抗分泌作用，從而達(dá)到止瀉、收斂作用[4- 5]。國(guó)內(nèi)外對(duì)BPC乙醇提取物的成分及其對(duì)腸道黏膜完整性影響的研究較少。本課題組對(duì)BPC的乙醇提取物進(jìn)行了系列研究，從中提取鑒定出25種化學(xué)成分[6]。后續(xù)的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證明了BPC乙醇提取物對(duì)TNBS誘導(dǎo)的大鼠IBD模型具有保護(hù)作用，并能通過NF-κB途徑減輕LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥[7- 8]。由于TNBS誘導(dǎo)的IBD模型與CD更為相近，而與UC相似的IBD模型的作用研究領(lǐng)域尚是空白，故本次實(shí)驗(yàn)使用葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulfate sodium,DSS)誘導(dǎo)小鼠UC模型，觀察BPC乙醇提取物對(duì)UC小鼠的結(jié)腸有何影響，并探索其可能的作用機(jī)制[9]。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～7周齡C57BL/6小鼠24只，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量22～24 g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004。

1.2 主要試劑與藥品

主要試劑：無(wú)水乙醇、石油醚(60-90，天津大茂)；DSS (36000-50000，MP)；RIPA裂解液(Sigma)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo)；GTVsion III型免疫組化檢測(cè)試劑盒(上海基因科技)；TUNEL試劑盒(Roche,批號(hào)11684795919)；Anti-Claudin-1抗體(ThermoFisher,71-7800)；Anti-iNOS抗體(abcam,ab178945)； Anti-p-stat3抗體(CST,9145S)。

主要藥品：別旁茶Jasminumelongatum(Bergium) Willd購(gòu)自廣州市清平藥材市場(chǎng)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)謝友良老師鑒定，存放于南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，存放編號(hào)：201809001。

1.3 主要儀器

BS224S1DFY-500型搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；RE52-05型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；電熱恒溫水浴箱(SPACER，Taiwan)；B×60倒置顯微鏡(Nikon，Japan)；光學(xué)顯微照相系統(tǒng)(Nikon，Japan)，Centrifuge5840R超速低溫離心機(jī)(eppendorf，Germany)；RM2245輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)(Leica，Germany)；EG1160包埋機(jī)(Leica，Germany)；CM-1850冰凍切片機(jī)(Leica，Germany)；Mini-Protein電泳槽(Bio-Rad，USA)；直流穩(wěn)壓電源(Bio-Rad，USA)；電熱恒溫干燥箱(湖北黃石恒豐醫(yī)療器械)；十萬(wàn)分之一電子分析天平(Meilteler，Germany)；-80 ℃超低溫冰箱(海爾，中國(guó))。

2 方法

2.1 BPC醇提物的制備

使用宋雨鴻等“一種別旁茶提取物的制備方法及其應(yīng)用”專利中描述的提取方法制備BPC醇提物[12]。具體操作如下：將BPC藥材粉碎，加10倍60%(φ)乙醇加熱回流提取2次，每次提取1 h，合并提取液，過濾，得醇提液；將醇提液減壓回收乙醇，用水定容濃縮液至0.25 g原藥/mL，并用石油醚脫色，得水提液；水提液用大孔樹脂吸附，2倍體積水洗脫，棄水洗液，分別用3倍體積的30%、50%、70%乙醇洗脫，收集各自洗脫液，減壓回收乙醇至相對(duì)密度為1.05～1.15時(shí)，噴霧干燥得到各個(gè)濃度BPC醇提物，密封4 ℃保存。通過觀察醇提物成品發(fā)現(xiàn)30%和50%的乙醇提取物呈膏狀黏稠物，試圖用蒸餾水進(jìn)行溶解時(shí)，藥物沉于試管底部呈不溶狀態(tài)。經(jīng)過超聲、振蕩、水浴等操作后藥物雖有少量溶解，但依然有較大體積的不溶物附著于食管底部。預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，取相應(yīng)溶液灌胃后，小鼠各項(xiàng)指標(biāo)與模型組小鼠相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且無(wú)法準(zhǔn)確進(jìn)行溶液含藥量計(jì)算，故而棄用。70%乙醇提取物成干燥粉末狀物質(zhì)，用蒸餾水溶解發(fā)現(xiàn)大部分藥物可溶于水，有少量不溶物也可形成均質(zhì)懸濁液進(jìn)行灌胃，操作方便，易于計(jì)算，且大部分檢測(cè)指標(biāo)與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),故選用70%乙醇提取物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 動(dòng)物分組及給藥處理

24只小鼠按計(jì)算機(jī)生成的隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分成4組，每組6只，分別為對(duì)照組、模型組、別旁茶低劑量組、別旁茶高劑量組。對(duì)照組小鼠每日自由飲用水瓶中的滅菌水，并且用滅菌水灌胃0.5 mL/d。將模型組及其余給藥實(shí)驗(yàn)組水瓶中的滅菌水換成含3%DSS的滅菌水溶液供小鼠自由飲用。此外，模型組小鼠每日用滅菌水灌胃0.5 mL/d，別旁茶低劑量組和別旁茶高劑量組的小鼠每日用別旁茶70%乙醇提取物的藥液灌胃，給藥量分別為3、6 g/kg體質(zhì)量。制備藥液時(shí)控制藥物濃度，使每只小鼠的灌胃體積為0.5 mL/d左右。其余飼養(yǎng)條件如溫度、濕度、光照、飼料等均一致。

2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣品制備

造模時(shí)長(zhǎng)為1周，各組小鼠模型完成后，用200 mg/kg戊巴比妥腹腔注射麻醉小鼠。待小鼠充分麻醉后，將其固定于處置臺(tái)上并充分暴露小鼠胸部。使用1 mL注射器，經(jīng)心臟采血。保持針尖與皮膚呈30°角，從小鼠的劍突下的方向進(jìn)針刺入心臟，緩慢地抽動(dòng)注射器針芯，保持注射器內(nèi)的負(fù)壓，小鼠血液隨著心臟搏動(dòng)自然進(jìn)入注射器，取0.8～1 mL血液后拔出針尖。全血在4 ℃靜置過夜后，3 000 r/min離心10 min，分離上層血清，置于-80 ℃超低溫冰箱以備用。然后用眼科剪迅速剪開小鼠胸骨及膈肌，暴露心臟，用灌注針插入心尖部位(左心室)并用止血鉗固定。打開灌注儀，同時(shí)用眼科剪在右心耳剪開1個(gè)小口，通過心臟灌注將小鼠體內(nèi)的血液用PBS緩沖液排除，持續(xù)3～5 min，直至肝臟及腎臟發(fā)白，停止灌注。隨后迅速將小鼠結(jié)腸整段取出，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度并記錄。將腸道內(nèi)容物用PBS溶液沖洗干凈，取1～2 cm末段結(jié)腸浸泡在4%PFA溶液中固定，24 h后進(jìn)行組織修整并做切片處理(冰凍切片和石蠟切片)。剩余新鮮樣本置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 模型評(píng)價(jià)方法

2.4.1 小鼠一般情況評(píng)價(jià) 在小鼠給藥期間，每日記錄小鼠體質(zhì)量變化、活動(dòng)狀態(tài)、糞便狀態(tài)、便血情況等并記錄，按照文獻(xiàn)所述的方法進(jìn)行DAI評(píng)分并統(tǒng)計(jì)[13]。處死小鼠后立即取出結(jié)腸，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度。

2.4.2 組織結(jié)構(gòu)改變及炎癥損傷程度評(píng)價(jià)取完整的小鼠結(jié)腸1～2 cm置于4%(φ)多聚甲醛溶液中脫水固定，室溫靜置24 h后用乙醇二甲苯脫水，石蠟包埋。并用石蠟切片機(jī)將組織切成4 μm厚度貼于載玻片上。用蘇木素/伊紅染色、中性樹脂封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察腸道病理改變并采集圖像。在雙盲的條件下根據(jù)病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每張病理切片進(jìn)行評(píng)分，記錄并統(tǒng)計(jì)評(píng)分結(jié)果[13]。

2.5 Western blot實(shí)驗(yàn)

2.5.1 蛋白提取 處死小鼠后取新鮮結(jié)腸組織100 mg，加入200 μL蛋白裂解液(96%RIPA+2%蛋白酶抑制劑+2%磷酸酶抑制劑)后超聲裂解，4 ℃冰箱靜置30 min。置于4 ℃離心機(jī)12 000 r/min離心30 min取上清。用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)所提取蛋白的濃度。剩余上清加入Loading Buffer后98 ℃變性10 min，-80 ℃冰箱保存。

2.5.2 蛋白電泳 配制11%分離膠和5%壓縮膠置于蛋白電泳槽中，每孔按蛋白總量30 μg上樣，90 V電壓電泳至溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠，調(diào)整電壓至120 V電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)接近分離膠底端時(shí)終止電泳。將凝膠在370 mA的電流下轉(zhuǎn)膜2 h，取出轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜置于5%BSA溶液中室溫封閉2 h。封閉結(jié)束后將相應(yīng)的條帶放入稀釋的一抗中4 ℃輕搖過夜，用TBST清洗后再置于稀釋的二抗中4 ℃孵育2 h。滴加顯影液，于暗室中曝光顯影并采集圖像。

2.6 免疫組化實(shí)驗(yàn)

取石蠟切片，用二甲苯和乙醇脫蠟，用PBS清洗切片并將切片浸入枸櫞酸溶液后置于微波爐中保持微沸狀態(tài)10 min進(jìn)行抗原修復(fù)。待切片溫度降為室溫后用3%H2O2-甲醇溶液浸泡10 min。PBS清洗切片，滴加2.5%山羊血清-triton溶液室溫封閉2 h。滴加稀釋后的一抗溶液4 ℃孵育過夜，用PBS清洗后用免疫組化試劑盒進(jìn)行二抗孵育及DAB顯色。最后用蘇木素染核，鹽酸酒精分化，乙醇二甲苯脫水，中性樹脂封片。將切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察蛋白表達(dá)情況并采集圖像。

2.7 TUNEL(凋亡)實(shí)驗(yàn)

取冰凍切片，用PBS溶液清洗OCT膠，并將切片浸入枸櫞酸溶液室溫靜置8 min。PBS清洗后用TUNEL試劑盒進(jìn)行凋亡細(xì)胞染色。再用PBS清洗后滴加DAPI室溫孵育5 min。最后PBS清洗后，用抗熒光淬滅的封片劑封片。將切片置于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并采集圖像。

2.8 圖形及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 別旁茶對(duì)小鼠一般情況的影響

模型組小鼠體質(zhì)量明顯下降，在造模第3天開始與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。別旁茶低劑量組小鼠的體質(zhì)量變化曲線與模型組相似，兩組小鼠的體質(zhì)量變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。別旁茶高劑量組小鼠的體質(zhì)量下降速度與模型組小鼠相比更加緩慢，與對(duì)照組相比，直到造模第6天才出現(xiàn)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。此外，別旁茶高劑量組小鼠體質(zhì)量的下降幅度也小于模型組小鼠(P<0.05)(圖1A)。

與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組小鼠的DAI評(píng)分均增高并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中模型組DAI評(píng)分與對(duì)照組相比出現(xiàn)差異的時(shí)間最早、增加速度最快。別旁茶低劑量組DAI評(píng)分變化曲線與模型組相比雖然增加速度略有減緩，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且在造模后期的評(píng)分均值接近模型組。別旁茶高劑量組DAI評(píng)分明顯低于模型組，在造模中后期可以觀察到與模型組相比具有明顯的改善作用(P<0.01)(圖1B)。

模型組小鼠結(jié)腸明顯短于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，別旁茶低劑量組小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，別旁茶高劑量組的小鼠結(jié)腸與模型組相比更長(zhǎng)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1C)。

3.2 別旁茶對(duì)小鼠結(jié)腸病理結(jié)構(gòu)及炎癥程度的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠結(jié)腸出現(xiàn)明顯的上皮結(jié)構(gòu)紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下水腫，間隙增寬。而別旁茶低劑量組和別旁茶高劑量組小鼠結(jié)腸上皮結(jié)構(gòu)清晰，黏膜層和黏膜下層僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下層水腫不明顯。病理評(píng)分顯示高劑量別旁茶醇提物組小鼠結(jié)腸損傷與模型組比較有明顯改善(P<0.05)，而低劑量別旁茶醇提物差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

28262422201816m/g012345678t/d1234543210疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分12340123456781234****##1086420I/cmt/dABC

A.小鼠體質(zhì)量變化； B.疾病活動(dòng)指數(shù)改變； C.結(jié)腸長(zhǎng)度(1.對(duì)照組； 2.模型組； 3.別旁茶低劑量組； 4.別旁茶高劑量組)。與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01； 與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01。

圖1 各組體質(zhì)量、DAI評(píng)分及結(jié)腸長(zhǎng)度變化圖Figure 1 Changes of body weight,DAI score and colon length in each group

A.對(duì)照組； B.模型組； C.別旁茶低劑量組； D.別旁茶高劑量組； E.病理評(píng)分統(tǒng)計(jì)(1.對(duì)照組； 2.實(shí)驗(yàn)組； 3.別旁茶低劑量組； 4.別旁茶高劑量組)； 與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05。

圖2各組小鼠結(jié)腸病理改變(HE染色，100×)
Figure2Colon pathological changes of mice in each group (HE staining,100×)

3.3 別旁茶對(duì)小鼠腸道緊密連接蛋白表達(dá)的影響

對(duì)照組腸道黏膜上皮可見明顯的緊密連接蛋白Claudin-1蛋白的表達(dá)，模型組Claudin-1蛋白的表達(dá)明顯下降。別旁茶低劑量組小鼠腸道中Claudin-1蛋白的表達(dá)情況與模型組相近，而別旁茶高劑量組小鼠腸道中Claudin-1蛋白的表達(dá)與模型組相比有明顯增加(圖3)。

A.對(duì)照組； B.模型組； C.別旁茶低劑量組； D.別旁茶高劑量組。

圖3各組小鼠結(jié)腸Claudin-1蛋白的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色；放大倍數(shù)：大圖100×，小圖400×。

Figure3Expression of colon Claudin-1 protein in mice of each group (Immunohistochemical staining; Magnification: large image 100×,small image 400×)

3.4 別旁茶對(duì)小鼠腸道上皮細(xì)胞凋亡的影響

鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組小鼠結(jié)腸中凋亡的上皮細(xì)胞明顯增多，表現(xiàn)為大量的點(diǎn)片狀綠色熒光，而別旁茶醇提物組小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡情況和模型組相比均有明顯改善，其中高劑量組改善情況更佳(圖4)。

3.5 別旁茶醇提物對(duì)小鼠結(jié)腸中iNOS蛋白和p-Stat3蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果可以觀察到模型組小鼠結(jié)腸組織中iNOS蛋白、p-Stat3蛋白表達(dá)均增高，別旁茶醇提物低劑量組中相應(yīng)蛋白表達(dá)與模型組相比無(wú)明顯改善，而高劑量別旁茶醇提物可以明顯減輕這種改變。(圖5)。

A.對(duì)照組； B.模型組； C.別旁茶低劑量組； D.別旁茶高劑量組。

圖4各組小鼠結(jié)腸細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色，100×)

Figure4Apoptosis of colon cells in mice of each group (TUNEL staining,100×)

GAPDHp-STAT3iNOS12341.51.00.50.0p-STAT31.51.00.50.0iNOS***##*#12341234ABC

A.iNOS蛋白、p-Stat3蛋白表達(dá)圖； B.p-Stat3蛋白表達(dá)量化圖； C. iNOS蛋白表達(dá)量化圖(1.對(duì)照組； 2.實(shí)驗(yàn)組； 3.別旁茶低劑量組；4.別旁茶高劑量組)。與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01。

圖5各組小鼠結(jié)腸蛋白的表達(dá)
Figure5Expression of colon protein in mice of each group

4 討論

IBD是一種以胃腸道慢性炎癥為特征的自身免疫疾病，已成為消化系統(tǒng)的主要疾病之一，在臨床上常見UC和CD 2種亞型。該病在發(fā)達(dá)國(guó)家常見，近年來有全球化的趨勢(shì)，而且IBD也逐漸引起很多亞洲國(guó)家的重視[14]。隨著生活水平的提高，我國(guó)IBD的發(fā)病率也逐年上升，這可能與人們生活習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)、工作壓力、環(huán)境污染等因素有關(guān)。與健康人群相比，IBD患者患腫瘤、冠狀動(dòng)脈疾病及帕金森病等其他系統(tǒng)疾病的風(fēng)險(xiǎn)更高[16,21]。該病主要的臨床表現(xiàn)有腹痛，里急后重、黏液膿血便、體質(zhì)量減輕等。

IBD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，與環(huán)境、遺傳、感染和免疫等因素都密切相關(guān)[17]。最近有研究表明，腸黏膜屏障尤其是其中機(jī)械屏障的完整性是影響IBD發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。若屏障的完整性受到破壞，如黏膜上皮細(xì)胞病理性脫落、上皮細(xì)胞間的緊密連接被破壞等都會(huì)增加機(jī)體患IBD的幾率[19,24]。Sharma D等[20]發(fā)現(xiàn)，地中海熱病基因(MEFV)通過介導(dǎo)IL-18成熟促使腸上皮完整以限制DSS誘導(dǎo)的損傷和炎癥。Mohanan V等[21]研究證明C1orf106(一種結(jié)腸炎風(fēng)險(xiǎn)基因)可通過調(diào)節(jié)上皮黏附連接的穩(wěn)定性從而改變腸黏膜屏障完整性，使?jié)冃越Y(jié)腸炎的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。另外，MA Yanlei等[22]證明了條件性敲除小鼠ACF7基因所致的腸上皮緊密連接受損會(huì)影響腸上皮細(xì)胞的遷移和腸道傷口修復(fù)的速度，從而增加小鼠對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的易感性。小鼠敲除腸上皮屏障完整性必需因子HNF4α后，腸道上皮通透性上升、腸道炎癥加重[23-24]。

本次實(shí)驗(yàn)使用濃度為3%的DSS飼養(yǎng)C57BL/6小鼠以建立穩(wěn)定的IBD小鼠模型。隨著造模時(shí)間的推移，小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量降低、活動(dòng)減少、毛發(fā)雜亂、血便等癥狀。病理染色和凋亡實(shí)驗(yàn)等結(jié)果顯示小鼠結(jié)腸出現(xiàn)黏膜結(jié)構(gòu)紊亂、上皮細(xì)胞凋亡增加，而免疫組化結(jié)果則顯示小鼠結(jié)腸上皮Claudin-1蛋白降低,這些現(xiàn)象表明IBD小鼠的腸道黏膜屏障受損、通透性增加。

目前臨床上對(duì)IBD治療的目標(biāo)是：誘導(dǎo)并維持臨床緩解及黏膜愈合，防治并發(fā)癥，改善患者生命質(zhì)量，加強(qiáng)對(duì)患者的長(zhǎng)期管理[25]。其藥物選擇一般是氨基水楊酸制劑、激素類、硫嘌呤類藥物、甲氨蝶呤等。這些藥物刺激性大、副作用多且價(jià)格昂貴，且對(duì)腸道黏膜有一定的損傷，科學(xué)家們一直在尋找更多的有效治療方式。研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥可以通過減輕病變腸道的炎癥反應(yīng)、恢復(fù)腸黏膜和血管通透性、糾正免疫功能紊亂等途徑修復(fù)腸道黏膜屏障,緩解IBD急性期癥狀并防止其復(fù)發(fā)，在IBD的治療上具有廣闊的前景[26]。

別旁茶是一種常見的傳統(tǒng)瑤藥，又名扭肚藤，分布于山地疏林或密林中，非常常見且易于采集，可用于治療胃腸炎、消化不良、痢疾、濕熱腹痛等疾病，是臨床用藥“腹可安片”的主要成分。研究顯示，本藥含有豐富的環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類及黃酮苷類、東莨菪素等化合物，這些成分均有一定的抗炎止瀉作用[6,27-28]。此外，本藥還在多種IBD的動(dòng)物模型中驗(yàn)證過其防治炎癥、鎮(zhèn)痛和抗腹瀉的作用。李思荃等[8]的研究表明別旁茶苷通過上調(diào)PXR，抑制NF-κB p65表達(dá)進(jìn)而抑制IL-8分泌從而保護(hù)CRL-1790細(xì)胞免受炎癥侵害。隨著研究的深入，有研究表明別旁茶提取物對(duì)TNBS誘導(dǎo)的IBD大小鼠模型均具有顯著的保護(hù)作用，可明顯改善結(jié)腸組織的病理?yè)p傷并使TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-27、MPO水平降低，同時(shí)增高SOD水平[7,29]。

本次實(shí)驗(yàn)使用70%乙醇提取部分對(duì)IBD小鼠模型進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示BPC對(duì)IBD模型小鼠具有保護(hù)作用，尤其濃度為0.24 g/mL的高劑量別旁茶醇提物對(duì)疾病的改善效果最好。它可以顯著地緩解小鼠的便血情況，減緩小鼠體質(zhì)量減輕的速度，改善結(jié)腸短縮癥狀，結(jié)腸上皮炎性浸潤(rùn)情況也得到有效控制。本研究發(fā)現(xiàn)BPC醇提物抑制IBD小鼠模型Claudin-1蛋白的降低并減少上皮細(xì)胞的凋亡，對(duì)保持腸道屏障的完整性有一定作用，可以加強(qiáng)腸道抵御微環(huán)境中損害因素的能力。此外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)高劑量的別旁茶醇提物可以降低由造模藥物引起的小鼠結(jié)腸組織中iNOS、p-Stat3蛋白表達(dá)的升高。這提示別旁茶發(fā)揮保護(hù)作用的途徑很可能與氮氧應(yīng)激及Stat3信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)提示別旁茶醇提物可能通過調(diào)控氮氧應(yīng)激、Stat3信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄激活等途徑保護(hù)IBD小鼠的腸道完整性，這一發(fā)現(xiàn)為IBD的治療及民族醫(yī)藥的開發(fā)應(yīng)用提供了新的方向。

本實(shí)驗(yàn)還存在一些不足之處，如未設(shè)置西藥干預(yù)組探討B(tài)PC醇提物與西藥治療效果的比較以及未深入探討氮氧應(yīng)激和Stat3通路對(duì)該模型的直接作用。這些不足之處將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步討論完善。