桂枝芍藥知母湯緩解類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制研究

謝健，譚麗雯，江福能，鐘惟德，梁宇翔

(廣州市第一人民醫(yī)院，廣東 廣州 510180)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病[1]。RA病程中綜合體現(xiàn)了滑膜增生、炎癥、自身免疫、內(nèi)分泌紊亂等多種病理生理過程，它們相互關(guān)聯(lián)、相互作用，形成一個錯綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。

桂枝芍藥知母湯(GuiZhi Shaoyao Zhimu Decoction，GSZD)出自《金匱要略·中風(fēng)歷節(jié)病脈證并治第五》，由9味中藥組成，包括桂枝、白芍、甘草、麻黃、生姜、白術(shù)、知母、防風(fēng)、附子，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)散寒、滋陰清熱之功效，主要用于治療風(fēng)寒濕痹日久、漸次化熱傷陰之證[2]。GSZD具有寒溫并用、溫散而不傷陰、養(yǎng)陰而不礙陽的特點，是古今醫(yī)家治療風(fēng)濕歷節(jié)的常用方[3]。

已有臨床研究表明GSZD具有減輕炎癥活動、抑制免疫、改善微循環(huán)作用，產(chǎn)生減輕關(guān)節(jié)腫脹、疼痛的功效，對RA患者的整體調(diào)節(jié)具有重要作用[4]。然而，其對人體免疫功能、致炎因子等方面的作用機制尚不明確。因此，本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，預(yù)測該方緩解RA的作用靶標(biāo)，并通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣饔嬎?，闡釋該方的配伍規(guī)律，揭示其對RA疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)機制。

1 材料

1.1 GSZD化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)集的建立

基于中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫(The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM，http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/，version 1.0)[5]，收集GSZD所含中藥的化學(xué)成分信息，建立GSZD的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)集。

1.2 GSZD候選靶標(biāo)譜的預(yù)測

在ETCM的Target子庫中，檢索GSZD所含化學(xué)成分的候選靶標(biāo)譜。ETCM采用MACCS(Molecular ACCess System)分子指紋，使用開源軟件OpenBabel來進行化學(xué)指紋特征的提取，并采用Tanimoto系數(shù)定義的相似度計量方法，通過與FDA上市藥物進行相似性打分(Score≥0.8)，并提取作用靶標(biāo)[5]。

1.3 已知RA治療靶標(biāo)譜的收集

基于DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/，version 5.1.2，released 2018-12-20)[6]，利用關(guān)鍵詞“rheumatoid arthritis”，收集已知用于RA治療的藥物信息，并匯總其靶標(biāo)基因信息。

2 方法

2.1 “GSZD候選靶標(biāo)-已知RA治療靶標(biāo)”相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

基于String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/，Version：10.5)[7]，收集GSZD候選靶標(biāo)和已知RA治療靶標(biāo)的相互作用信息，并采用Cytoscape軟件進行網(wǎng)絡(luò)可視化和計算網(wǎng)絡(luò)特征值，包括節(jié)點連接度(degree)、節(jié)點緊密度(closeness)和節(jié)點介度(betweenness)。以“節(jié)點連接度(degree)”的2倍中位數(shù)為卡值，選取“GSZD候選靶標(biāo)-已知RA治療靶標(biāo)”相互作用網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(hubs)；在此基礎(chǔ)上，建立核心節(jié)點的直接相互作用網(wǎng)絡(luò)，并計算節(jié)點連接度(degree)、節(jié)點緊密度(closeness)和節(jié)點介度(betweenness)等3個拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征值，選擇3個拓?fù)涮卣髦稻笥谙鄳?yīng)中位數(shù)的節(jié)點作為GSZD緩解RA的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)。

2.2 基因功能和通路富集分析

基于本體數(shù)據(jù)庫(Gene Ontology，GO)和KEGG 通路數(shù)據(jù)庫[8]，采用The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery(DAVID，https://david.ncifcrf.gov/，v6.8)的分析平臺[9]，針對GSZD緩解RA的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)參與的生物學(xué)功能和通路，開展富集分析。

3 結(jié)果

3.1 GSZD所含的化學(xué)成分及其候選靶標(biāo)譜

通過ETCM數(shù)據(jù)庫，共收集GSZD所含9味中藥的509個化學(xué)成分，其中，白芍57個，白術(shù)33個，防風(fēng)33個，附子40個，甘草134個，桂枝13個，麻黃29個，生姜128個，知母42個?；谏鲜龌瘜W(xué)成分的結(jié)構(gòu)信息，共預(yù)測獲得GSZD的候選作用靶標(biāo)718個。如圖1所示，GSZD的候選靶標(biāo)主要參與血管新生通路(如VEGF signaling pathway、Cardiac muscle contraction、Vascular smooth muscle contraction)、免疫炎癥調(diào)節(jié)通路(如Steroid hormone biosynthesis、Steroid biosynthesis、Fc epsilon RI signaling pathway、B cell receptor signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway)、破骨細(xì)胞分化通路(如，Osteoclast differentiation)以及能量和藥物代謝相關(guān)通路(如Caffeine metabolism、Retinol metabolism、Linoleic acid metabolism、Nitrogen metabolism、Bile secretion、Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450、Drug metabolism、Ascorbate and aldarate metabolism、Carbohydrate digestion and absorption、Drug metabolism、Arachidonic acid metabolism、Pentose and glucuronate interconversions、alpha-Linolenic acid metabolism)。

圖1GSZD候選靶標(biāo)顯著富集的GO功能和KEGG通路統(tǒng)計圖

Figure1GO function and KEGG pathway statistical map with significant enrichment of GSZD candidate targets

3.2 GSZD緩解RA的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)

基于GSZD候選靶標(biāo)與已知RA治療靶標(biāo)之間的相互作用信息，建立“GSZD候選靶標(biāo)-已知RA治療靶標(biāo)”互作網(wǎng)絡(luò)，包含519個節(jié)點和3 131條邊。以2倍節(jié)點連接度中位數(shù)作為卡值，篩選得到113個hub節(jié)點。進而構(gòu)建hub節(jié)點的直接相互作用網(wǎng)絡(luò)，包含113個hub節(jié)點和1 248條邊。通過hub節(jié)點的節(jié)點連接度(degree)、節(jié)點緊密度(closeness)和節(jié)點介度(betweenness)中位數(shù)卡值篩選，獲得45個關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)，其網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦狄姳?。

表1 GSZD緩解RA關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)拓?fù)涮卣髦盗斜?/p>

Table1Topological eigenvalue list of key network targets for GSZD mitigation of RA

基因名稱連接度緊密度介度AKT1290.520 930 230.020 207 91ALB330.574 358 970.051 202 05CALM1230.504 504 50.023 469 87CALM2220.502 242 150.015 113 54HSP90AA1200.464 730 290.015 203 12INS340.586 387 430.051 813 5NR3C1200.523 364 490.014 653 9APP280.506 787 330.057 757 1GPER230.476 595 740.024 909 96POMC300.516 129 030.081 662 44AKR1C3260.478 632 480.005 681 16CYP1A1460.533 333 330.027 581 99CYP2E1380.541 062 80.022 683 52CYP3A4470.562 814 070.036 820 6HSD3B1260.506 787 330.020 376 79HSD3B2250.50.019 607 53UGT1A1390.486 956 520.008 647 97UGT1A10350.476 595 740.004 413 22UGT1A4350.476 595 740.004 413 22UGT1A6400.541 062 80.033 945 27UGT1A8350.476 595 740.004 413 22UGT1A9390.497 777 780.016 309 5AR200.50.013 875 13CYP19A1230.528 301 890.027 308 5CYP1A2410.511 415 530.012 177 32CYP3A5360.489 082 970.005 404 65HPGDS320.583 333 330.064 149 11ESR1220.554 455 450.016 219 17IL1B250.489 082 970.012 959 18IL2210.470 588 240.006 145 72PIK3CA250.489 082 970.009 277 02CYP2C9380.523 364 490.013 608 02CYP2B6410.557 213 930.037 558 97CYP2C8360.518 518 520.012 570 75CYP4A11360.518 518 520.018 361 68FOS300.568 527 920.042 487 61JUN320.580 310 880.040 962 01

表1 (續(xù))

根據(jù)生物學(xué)功能和通路富集結(jié)果顯示(圖2和表2)，GSZD緩解RA的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)主要參與代謝類通路(如Drug metabolism-cytochrome P450，Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450，Retinol metabolism，Arachidonic acid metabolism，Drug metabolism-other enzymes，Ascorbate and aldarate metabolism，Metabolic pathways，Linoleic acid metabolism，Pentose and glucuronate interconversions，Porphyrin and chlorophyll metabolism)、免疫-炎癥調(diào)節(jié)通路(如Steroid hormone biosynthesis，TNF signaling pathway，T cell receptor signaling pathway，Toll-like receptor signaling pathway，Inflammatory mediator regulation of TRP channels，F(xiàn)c epsilon RI signaling pathway，B cell receptor signaling pathway)、骨破壞相關(guān)通路(如Osteoclast differentiation)和血管新生相關(guān)通路(如VEGF signaling pathway)。

注：紅色標(biāo)注節(jié)點為GSZD緩解RA關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)。

圖2GSZD緩解RA關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)互作網(wǎng)絡(luò)及其主要參與通路圖

Figure2Interaction network and main participation path diagram of key network targets for GSZD mitigation of RA

表2 GSZD緩解RA關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)的功能和通路富集列表Table 2 Functional and pathway enrichment list of GSZD mitigating RA key network targets

表2 (續(xù))

4 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對“疾病-表型-基因-藥物”的多層次信息進行融合，從系統(tǒng)和網(wǎng)絡(luò)的角度理解疾病表型與生命大分子的關(guān)系，在其對“疾病表型-生物分子”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的思路指導(dǎo)下進行中醫(yī)藥證候生物學(xué)基礎(chǔ)的研究已經(jīng)取得一定的進展[10]。從中醫(yī)藥“整體觀念”切入，采用“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”研究策略，按照“中藥化學(xué)成分收集—成分靶標(biāo)預(yù)測—靶標(biāo)互作網(wǎng)絡(luò)挖掘”的技術(shù)路線，通過分析中藥靶標(biāo)與疾病相關(guān)基因和通路之間的關(guān)聯(lián)性，揭示中藥的作用機制，有助于適應(yīng)并體現(xiàn)中藥多成分、多靶點、協(xié)同作用的特點，并為方證研究和新藥開發(fā)提供全新的選擇與向?qū)11]。

RA是一種慢性、系統(tǒng)性、自身免疫性疾病，主要病理表現(xiàn)為對稱性、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎癥[1]。除關(guān)節(jié)病變外，RA還可引起多種關(guān)節(jié)外病變，包括心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，因而又稱為病譜性疾病[12]。在RA進展過程中，往往出現(xiàn)滑膜增生、炎癥、自身免疫、內(nèi)分泌紊亂等多種病理生理表現(xiàn)，各個病理環(huán)節(jié)的相關(guān)基因之間形成錯綜復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)。

作為古今醫(yī)家治療風(fēng)濕歷節(jié)的常用方劑，GSZD具有寒溫并用、溫散而不傷陰，養(yǎng)陰而不礙陽的特點[3]。現(xiàn)代臨床研究和藥理學(xué)研究表明，GSZD可通過減輕炎癥活動、抑制免疫、改善微循環(huán)等作用，發(fā)揮其減輕關(guān)節(jié)腫脹和疼痛及調(diào)節(jié)機體免疫功能的療效[13]。Guo等[14]研究發(fā)現(xiàn)，GSZD具有改善RA病情、減輕RA癥狀的作用，其作用機制可能是通過調(diào)控HDAC1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB-TNF信號軸來矯正RA進展相關(guān)的“炎癥-免疫失衡網(wǎng)絡(luò)”。為進一步探明GSZD治療RA的作用機制，本研究整合藥物靶標(biāo)預(yù)測、網(wǎng)絡(luò)分析和功能富集，旨在發(fā)現(xiàn)該方抗RA的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)，并深入挖掘其機制。通路富集結(jié)果表明，GSZD緩解RA的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)主要參與4種類型的信號通路：藥物代謝相關(guān)、炎癥-免疫相關(guān)、破骨細(xì)胞分化和血管新生信號通路。

本研究結(jié)果表明，GSZD 抗 RA作用可能是通過逆轉(zhuǎn)炎癥-免疫系統(tǒng)的失衡、調(diào)節(jié)機體代謝、緩解骨破壞和抑制血管新生而實現(xiàn)。相關(guān)研究結(jié)果為GSZD抗RA的作用機制探索提供新靶點、新通路，為進一步驗證性研究提供了理論依據(jù)。