UHPLC-MS-MS法同時(shí)測定疏肝安神顆粒中的5種活性成分

張誠光，畢曉黎，胥愛麗，陳昭

[廣東省第二中醫(yī)院(廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院)，廣東 廣州 510095]

抑郁、失眠等精神疾病對身心健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響，由于不易察覺、診斷標(biāo)準(zhǔn)模糊及易突發(fā)嚴(yán)重后果等特點(diǎn)，通常需要長期服用藥物控制癥狀[1-2]。中醫(yī)將抑郁歸為肝氣郁結(jié)、心神不寧、痰濁血淤等，治療以疏肝理氣、祛瘀化痰為主，注重調(diào)理機(jī)體、臟器，循序漸進(jìn)改善精神狀況[2-3]。

疏肝安神顆粒系廣東省第二中醫(yī)院(廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院)中藥制劑，由醋北柴胡、白芍、香附、丹參、茯苓等藥味經(jīng)現(xiàn)代化制劑工藝制作而成。該制劑有疏肝理氣、祛瘀化痰、安神定志等功效，可用于治療中風(fēng)后抑郁、失眠氣郁、痰郁、血郁之證[4]。目前，疏肝安神顆粒已建立了包括含量測定在內(nèi)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；同時(shí)，包括君藥柴胡在內(nèi)的主要藥味的藥理活性、化學(xué)成分、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等已有研究報(bào)道[5-9]；在此基礎(chǔ)上，本研究基于其功效主治，進(jìn)一步建立UHPLC-MS-MS同時(shí)測定多種活性成分的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo TSQ Quantum超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo-Fisher公司)；METTLER XS205DU型電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo)；KQ5200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MilliPore Advantage A10自動(dòng)純水機(jī)(美國MilliPore公司)。

1.2 材料

柴胡皂苷A(批號：110777-201510)、柴胡皂苷D(批號110778-201510)、丹參酮ⅡA(批號：110766-201721)、丹酚酸B(批號：111562-201716)、芍藥苷(批號：110736-201741)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；茯苓酸A(批號F-024-180525)和茯苓酸B(批號：F-035-180525)購自成都瑞芬思生物科技有限公司；樣品處理及LC-MS分析用甲醇、甲酸、乙腈等試劑為HPLC級別，購自德國Merck公司；去離子水為自制。

疏肝安神顆粒，批號分別為20170501、20170502、20170701、20170702、20170802、20170901、20180301、20180501、20180701、20180901，廣東省第二中醫(yī)院(廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院)制劑室生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品溶液的制備

取各對照品適量，精密稱定，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制得每1 mL含柴胡皂苷A、柴胡皂苷D、丹參酮ⅡA、丹酚酸B、芍藥苷、茯苓酸A、茯苓酸B對照品分別為10、10、10、80、50、0.2和1 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取疏肝安神顆粒適量，研細(xì)，取約0.25 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲30 min，取出，放冷，稱定質(zhì)量，加甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，所得溶液以0.22 μm微孔濾膜過濾，精密吸取濾液100 μL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，即得供試品溶液。

2.3 LC-MS條件

液相色譜條件：色譜柱為Phenomenex C18(2.1 mm×50 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸(B)梯度洗脫(0～0.5 min，5%～45%A；0.5～1.0 min，45%～45%A；1.0～1.5 min，45%～95%A；1.5～2.5 min，95%～95%A；2.5～3.0 min，95%～5%A)；流速為0.7 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL。

質(zhì)譜掃描條件：采用ESI離子源，正負(fù)離子同時(shí)掃描，全部離子對均為SRM模式；噴霧電壓3 500 V，霧化室溫度350 ℃，離子傳輸管溫度300 ℃，鞘氣壓力206.843 kPa，輔氣壓力68.948 kPa，各離子對(即各組分的母離子和碎片離子)檢測條件見表1。所得疏肝安神顆?；旌蠈φ掌芳肮┰嚻冯x子流圖見圖1。

由測定結(jié)果可知，供試品中無柴胡皂苷D和丹參酮ⅡA質(zhì)譜峰，故后續(xù)方法學(xué)考察和多批次樣品測定中未列入上述化合物。

表1 疏肝安神顆粒各成分質(zhì)譜檢測參數(shù)Table 1 Mass Detection parameters of the active components for Shugan Anshen Granules

1.總離子流圖； 2～8.分別為茯苓酸B、茯苓酸A、芍藥苷、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的提取離子流圖。

圖1疏肝安神顆粒各組分對照品(A)和供試品(B)的LC-MS離子流圖
Figure1LC-MS ion current of standard (A) and sample (B) solutions for Shugan Anshen Granules

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液100、50、20、10、5、2、1 μL，置于不同10 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，制得柴胡皂苷A質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/mL，丹酚酸B質(zhì)量濃度為0.08、0.16、0.4、0.88、1.6、4.0、8.0 μg/mL，芍藥苷質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL，茯苓酸A質(zhì)量濃度為0.0002、0.0004、0.001、0.002、0.004、0.01、0.02 μg/mL，茯苓酸B 質(zhì)量濃度為0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1 μg/mL的系列溶液。吸取上述溶液，按“2.3”項(xiàng)下LC-MS條件分析，記錄各組分離子流圖和峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，所得各組分回歸方程及相關(guān)系數(shù)(r2)見表2。可見，方法線性良好，在濃度線性范圍內(nèi)可以對疏肝安神中的各活性成分進(jìn)行準(zhǔn)確測定。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取同一批次疏肝安神顆粒(批號20170802)，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項(xiàng)下LC-MS條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄各組分離子流圖和峰面積，計(jì)算峰面積的RSD值，結(jié)果顯示各組分峰面積的RSD在0.40%～1.98%范圍內(nèi)，表明方法精密度良好，見表3。

表2 各組分的回歸方程Table 2 The regression equations for each component

表3 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性考察結(jié)果Table 3 Results of precision,stability and repeatability tests

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次疏肝安神顆粒(批號20170802)，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項(xiàng)下LC-MS條件分別在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)行分析，記錄各組分離子流圖和峰面積，計(jì)算峰面積的RSD值，結(jié)果顯示RSD值在0.57%～2.44%范圍內(nèi)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，見表3。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次疏肝安神顆粒(批號20170802)，共取6份，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項(xiàng)下LC-MS條件分析，記錄各組分離子流圖和峰面積，計(jì)算各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值，結(jié)果顯示各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值在0.35%～2.70%范圍內(nèi)，表明方法重復(fù)性良好，見表3。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批次疏肝安神顆粒(批號20170802)，共取9份，每份0.2 g，精密稱定，按1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例精密加入對照品溶液適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件記錄各組分離子流圖和峰面積，計(jì)算各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、回收率及其RSD值，結(jié)果見表4?？梢?，各組分的回收率在95.45%～103.86%范圍內(nèi)、RSD值在0.76%～4.20%范圍內(nèi)，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.5 10批疏肝安神顆粒5種活性成分的測定

取10批疏肝安神顆粒，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項(xiàng)下LC-MS條件分析，記錄各組分離子流圖和峰面積，計(jì)算各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表5。

表4 各組分回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of sample recoveries of each component (n=3)

表5 10批疏肝安神顆粒質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果

Table5The results of determination for Shugan Anshen Granules (n=2)w/(mg·g-1)

批號柴胡皂苷A丹酚酸B芍藥苷茯苓酸A茯苓酸B201705010.3123.0582.5510.0110.068201705020.3503.4872.5240.0120.065201707010.3723.9012.5660.0110.065201707020.2823.9382.5270.0080.066201708020.3654.0412.5300.0100.064201709010.2564.2762.5150.0120.063201803010.3624.2792.5180.0100.063201805010.3014.4012.4940.0110.082201807010.3414.3532.5550.0090.062201809010.3074.3682.5320.0110.066

3 討論

參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物的篩選原則與方法，基于有效、足量、可測的原則，本研究選取了柴胡皂苷A、柴胡皂苷D、丹參酮ⅡA、丹酚酸B、芍藥苷、茯苓酸A、茯苓酸B等7個(gè)成分作為測定指標(biāo)。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，上述7種成分來自疏肝安神顆粒中的君藥柴胡和臣藥赤芍、茯苓，具有較好的疏肝益氣、安神解郁功效[8,10-13]，對上述成分建立同時(shí)LC-MS測定方法，可以較好地評價(jià)疏肝安神顆粒的質(zhì)量。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，供試品中并未檢測到柴胡皂苷D和丹參酮ⅡA的明顯信號，故該2種成分未列入最后的檢測指標(biāo)。

在建立分析方法過程中發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷A和柴胡皂苷D離子對一致，難以通過質(zhì)譜進(jìn)行區(qū)分，為保證檢測準(zhǔn)確并提高總體分析效率，經(jīng)過對色譜條件反復(fù)優(yōu)化，可知當(dāng)流動(dòng)相極性處于中等極性階段時(shí)(40%～60%)，二者分離度較好；最終，本研究選擇了將乙腈比例迅速升至45%后，保持約0.5 min，實(shí)現(xiàn)了對柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的基線分離。究其原因，可能是二者雖分子量相同，但結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致極性差別較大，在色譜柱中洗脫順序不同，因此可以通過二者色譜行為(保留時(shí)間)的差異進(jìn)行區(qū)分；此外，由于柴胡皂苷D極性較柴胡皂苷A低，常見以水煎液為基礎(chǔ)制備的各類含柴胡的方劑中，較難檢測到柴胡皂苷D。

本研究選取疏肝安神顆粒中多個(gè)與功效主治相關(guān)的成分為指標(biāo)，進(jìn)行篩選和含量測定研究，采用LC-MS法同時(shí)測定相較傳統(tǒng)方法效率、靈敏度和準(zhǔn)確度更高，為后續(xù)深入研究該制劑的作用機(jī)理和功效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了科學(xué)參考。