陳皮復(fù)方止咳含片殼聚糖絮凝純化工藝的優(yōu)選

譚娥玉,林信亨,馬少鋒,湯啟勛,唐興榮

(江門市五邑中醫(yī)院，廣東 江門 529000)

陳皮復(fù)方止咳含片處方由《醫(yī)宗金鑒》中的加味二陳湯加減化裁而成[1]，該方由陳皮、生姜、桔梗、蘇子、甘草組成，是江門市名中醫(yī)唐興榮主任中醫(yī)師在臨床上使用多年的驗方，具有理氣化痰、清利咽喉的功效,主要用于治療風(fēng)痰引起的初期咳嗽，經(jīng)多年臨床證實該方能有效治療咳嗽、痰多諸癥。

該止咳復(fù)方在臨床上以湯劑入藥，為使制劑方便服用及攜帶，結(jié)合方中有效成分的性質(zhì)，同時較好保留湯劑用藥的優(yōu)勢，本課題組擬將該方水提液研制為含片，使藥物可直達患處并迅速起效，從而更好地緩解咳嗽癥狀。由于該處方日劑量較大，水提液出膏率較高，對劑型的選擇有一定限制，為了提高療效、減少服用劑量、增加制劑的穩(wěn)定性，需進一步純化。因此，本文采用殼聚糖絮凝劑對陳皮復(fù)方止咳含片的水提液進行純化研究，采用正交試驗設(shè)計，選取總黃酮質(zhì)量濃度、橙皮苷質(zhì)量濃度及除雜率為綜合評價指標(biāo)，采用層次分析法(AHP)確定各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)，優(yōu)選出最佳純化工藝條件，為制備陳皮復(fù)方止咳含片提供可靠的依據(jù)。

1 儀器與材料

1260 InfinityⅡ型HPLC儀，包括四元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器、色譜工作站(美國Agilent公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；DHG-9030電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；WH-800超聲波清洗機(濟寧萬和超聲電子設(shè)備有限公司)；SHZ-D循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；HH-3A數(shù)顯恒溫三溫水浴鍋(金壇市精達儀器制造有限公司)；TC-15套式恒溫箱(海寧市新華醫(yī)療器械廠)；ME104電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；T6紫外可見光-分光光度計(北京普析通用有限責(zé)任公司)；Best-S30超純水機(芷昂儀器上海有限公司)。

陳皮、生姜、桔梗、蘇子、甘草飲片均購自廣州市集芝寶中藥有限公司；橙皮苷(成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-17032502)；殼聚糖(上海麥克林生物科技有限公司，批號：C10092999)；甲醇為色譜純，水為超純水，乙酸為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 陳皮復(fù)方止咳含片提取液制備 按處方量稱取陳皮等藥材800 g，置于20 L圓底燒瓶，浸泡30 min，煎煮2次，第1次加入8倍量水，第2次加入6倍量水，每次煎煮1 h，合并煎液，濾過，濃縮成生藥比為1∶1的藥液，即每1 mL濃縮液相當(dāng)于1 g原藥材。

2.1.2 殼聚糖絮凝劑的制備 臨用前配制，稱取殼聚糖5 g，以1%乙酸溶液300 mL浸漬2 h后，快速攪拌使溶解，再用1%乙酸溶液定容至500 mL，充分?jǐn)嚢韬?，靜置24 h，即得。

2.1.3 提取液純化液的制備 按正交表中的設(shè)計，量取藥液比(g∶mL，下同)1∶1的提取液，分別加水稀釋配制為藥液比1∶2、1∶4、1∶6的溶液100 mL，在藥液比為1∶2、1∶4、1∶6的藥液中，采用“慢加快攪”的方式，加入殼聚糖溶液，在相應(yīng)絮凝溫度下，100 r/min速度下攪拌4 min，于相應(yīng)絮凝溫度下水浴靜置一定時間后，濾過，濾液轉(zhuǎn)移至200 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.2 橙皮苷質(zhì)量濃度的測定[2]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(4.6 mm×150 mm，4 μm),流動相：甲醇-醋酸-水(體積比35∶4∶61)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：283 nm；柱溫：25 ℃，進樣量：5 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取橙皮苷對照品適量，置50 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容成0.45 mg/mL溶液，用0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密吸取生藥比為1∶1的提取液5 mL，置20 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照品溶液的制備 取缺少陳皮的陰性對照樣品，按“2.2.3”項下供試品溶液的制備方法制備，即得。

2.2.5 系統(tǒng)適用性驗證 依次取對照品、供試品、陰性對照品溶液適量，以“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，供試品中橙皮苷色譜峰與其他相鄰色譜峰能較好地分離，陰性無干擾，理論塔板數(shù)按橙皮苷計算不低于2 000，表明方法專屬性良好,結(jié)果見圖1。

6050403020100220180140100602001412108642002468101214161820t/minABCmAUmAUmAU11

1.橙皮苷。

圖1橙皮苷對照品(A)、供試品(B)與陰性對照品(C)溶液的高效液相色譜圖

Figure1HPLC chromatograms of hesperidin standard sample (A)，sample (B) and negative control (C)

2.2.6 線性關(guān)系、定量限及檢測限 精密吸取橙皮苷對照品溶液，逐級稀釋得質(zhì)量濃度為0.045 0、0.056 3、0.112 5、0.225 0、0.450 0 mg/mL的橙皮苷系列溶液。按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，以橙皮苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程為：Y=6 495.431 9X+8.989 0，r=1.000，表明橙皮苷在0.225～2.250 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。按信噪比為10∶1、3∶1分別計算得橙皮苷的定量限為3.50 ng，檢測限為1.05 ng。

2.2.7 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗 精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性試驗的RSD值分別為0.33%(n=6)、0.67%(n=5)、1.01%(n=6)，表明方法符合要求。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密吸取已知含量藥液比為1∶1的提取液6份，每份2.5 mL，置于20 mL容量瓶中，分別加入0.450 0 mg/mL橙皮苷對照品溶液3.5 mL，按“2.2.3”方法制備供試品溶液，按“2.2.1”色譜條件進樣分析，記錄峰面積，計算加樣回收率，結(jié)果平均回收率為96.34%，RSD值為2.05%(n=6)，表明方法回收率良好。

2.3 總黃酮質(zhì)量濃度的測定(UV法)[3-5]

精密吸取0.450 0 mg/mL橙皮苷對照溶液適量，加甲醇稀釋為0.380 0 mg/mL對照品溶液，分別精密吸取0.2、0.3、0.5、0.7、0.8 mL置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，以甲醇為空白溶劑，在吸收波長284 nm處測定吸光度，以質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明總黃酮在7.60～30.40 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=0.033 2X+0.043 1，r=0.999 9。

2.4 除雜率的測定

分別精密吸取“2.1”項下的提取液及各組純化液10 mL，置已干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿，水浴蒸干，于105 ℃烘箱干燥至恒定質(zhì)量，取出，置干燥器中冷卻30 min后精密稱定，按照公式：除雜率=(提取液干膏質(zhì)量-純化后干膏質(zhì)量/藥液濃縮比)/提取液干膏質(zhì)量×100%，計算除雜率。

2.5 陳皮復(fù)方止咳含片殼聚糖絮凝純化工藝的優(yōu)化

2.5.1 正交試驗法優(yōu)選純化工藝 參考文獻[6-9]及單因素考察預(yù)試驗結(jié)果，確定藥液比、殼聚糖溶液用量、絮凝溫度、靜置時間是殼聚糖純化效果的主要影響因素，將該4個影響因素作為考察對象，各取3個水平，以橙皮苷質(zhì)量濃度、總黃酮質(zhì)量濃度及除雜率為評價指標(biāo)，進行L9(34)正交試驗，優(yōu)選最佳純化條件，正交試驗因素及水平見表1。

2.5.2 層次分析法(AHP)確定各考察指標(biāo)的權(quán)重系數(shù) 根據(jù)復(fù)方中藥味含量多少、各成分藥理作用強弱，并兼顧本研究的純化效果，將總黃酮質(zhì)量濃度、橙皮苷質(zhì)量濃度、除雜率作為權(quán)重指標(biāo)予以量化。采用1～9標(biāo)度法對3項指標(biāo)進行兩兩比較評判重要性[10]，將3項指標(biāo)分成3個層次，并確定各指標(biāo)優(yōu)先順序：總黃酮>橙皮苷>除雜率，構(gòu)建成對比較的判斷優(yōu)先矩陣，按照各指標(biāo)重要程度賦予各指標(biāo)間的相對評分，優(yōu)先矩陣安排見表2。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal experiment

表2 各指標(biāo)3個層次的優(yōu)先矩陣Table 2 Priority matrix of three Levels of indicators

權(quán)重系數(shù)計算：按照幾何平均法計算各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)[11-17]，并對各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)進行一致性評價，相關(guān)計算如下：

根據(jù)優(yōu)先矩陣及公式(1)計算初始權(quán)重系數(shù)(Wi′)：

(1)

式中：m為受檢驗層次目標(biāo)數(shù)，a1～am為矩陣兩兩比較的評分。

經(jīng)計算各指標(biāo)成分初始權(quán)重系數(shù)W1′=2.102 9，W2′=0.729 6，W3′=0.264 5。

按照公式(2)計算歸一化權(quán)重系數(shù)，得各指標(biāo)成分權(quán)重系數(shù)W1=0.669 4，W2=0.242 6，W3=0.087 9。

(2)

一致性檢驗：CR為隨機一致性比率，定義CR=CI/RI作為衡量所得權(quán)重系數(shù)是否合理的指標(biāo)，一致性指標(biāo)CI=(λmax-m)/(m-1)，式中：m為次級目標(biāo)數(shù)，矩陣的最大特征根(λmax)：

(3)

平均隨機一致性指標(biāo)RI值為0.58(矩陣階數(shù)=3)。經(jīng)計算，λmax=3.007，CI=0.003 5，CR=0.006<0.1，說明指標(biāo)優(yōu)先比較判斷矩陣符合一致性要求，計算的權(quán)重系數(shù)有效可行。

2.5.3 純化工藝的優(yōu)選結(jié)果 由表3中直觀分析可知，影響陳皮復(fù)方止咳含片提取液純化工藝效果的因素依次為：C>B>A>D，即絮凝溫度>殼聚糖溶液用量>藥液濃縮比>靜置時間；表4中方差分析結(jié)果可知，C因素和B因素對陳皮復(fù)方止咳含片提取液純化工藝效果的影響有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，A因素和D因素的影響則均無統(tǒng)計學(xué)意義。取各因素較高水平組合，得最佳工藝參數(shù)A3B2C1D1，即藥液比為1∶6，殼聚糖溶液用量為15%，水浴絮凝溫度為30 ℃，靜置時間為3 h。

表3 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Design and results of orthogonal experiment

注：采用歸一化法計算各指標(biāo)分?jǐn)?shù)，結(jié)合權(quán)重系數(shù)計算各試驗組的權(quán)重分?jǐn)?shù)，權(quán)重分?jǐn)?shù)=[(總黃酮質(zhì)量濃度/最大總黃酮質(zhì)量濃度)×0.669 4+(橙皮苷質(zhì)量濃度/最大橙皮苷質(zhì)量濃度)×0.242 6+(除雜率/最大除雜率)×0.087 9]×100。

表4 方差分析結(jié)果Table 4 The results of variance analysis

2.5.4 驗證性試驗 按處方比例稱取藥材120 g，按“2.1”項下提取液制備方法提取，水提液平均分為4份，其中3份按照最佳純化工藝進行驗證試驗，1份作為對照，計算總黃酮、橙皮苷的保留率和除雜率，結(jié)果見表5，計算得RSD值分別為2.22%、1.40%、2.81%，表明所選工藝條件總黃酮和橙皮苷損失少，除雜效果佳。

表5 驗證試驗結(jié)果Table 5 The results of verification test

3 討論

中藥復(fù)方具有化學(xué)成分高度復(fù)雜性和整體治療性，如果僅對復(fù)方中的個別成分進行定性、定量研究，既不能有效保障制劑的療效和質(zhì)量，同時也不符合中醫(yī)整體論治的指導(dǎo)原則。因此，在中藥復(fù)方制劑工藝研究過程中，應(yīng)注重療效與物質(zhì)基礎(chǔ)的直接相關(guān)性，以復(fù)方的有效活性成分群為檢測指標(biāo)，建立多指標(biāo)評價方法優(yōu)選制劑工藝[18-19]。本方中的君藥陳皮具有理氣健脾、燥濕化痰之功效，其主要有效成分為橙皮苷，結(jié)合方中具有藥理活性的黃酮類成分群(總黃酮)，以及純化工藝研究中常用的除雜率，以三者共同作為綜合評價純化效果的指標(biāo)，使除雜的同時也能較好保留提取液的有效成分，確保藥物的療效。為了降低僅憑主觀決定權(quán)重系數(shù)引起的評價誤差，增強總體評價的科學(xué)合理性，本研究采用了主觀、客觀相結(jié)合的層次分析法(AHP)來確定各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)，既體現(xiàn)對各項評價指標(biāo)的主觀重視程度，也兼顧了各指標(biāo)的相互聯(lián)系和影響。

殼聚糖發(fā)揮純化作用是基于其陽離子和長鏈架橋的雙重結(jié)構(gòu)，使殼聚糖分子與藥液中的雜質(zhì)充分耦合形成絮凝物，有效去除雜質(zhì)的同時又能較好保留藥液中的有效成分，并且無毒無味，可生物降解，不會造成二次污染，已被廣泛應(yīng)用于制藥和食品加工領(lǐng)域[6-9]。本研究采用殼聚糖溶液作為絮凝劑，在預(yù)實驗純化過程中發(fā)現(xiàn)，攪拌速度快慢對純化效果有直接影響，攪拌過快可導(dǎo)致絮凝劑未能與提取液充分結(jié)合就被攪散，形成較小顆粒，較難過濾，攪拌過慢又會使殼聚糖溶液絮凝成團，參考文獻[7]及多次預(yù)試，確定在100 r/min速度下攪拌4 min效果最佳，且易于過濾。另外，殼聚糖在pH 3.5～5.5范圍內(nèi)能發(fā)揮較強的絮凝作用，經(jīng)測定本方提取液pH=4.32，故在純化工藝中無需調(diào)節(jié)提取液的酸堿度[20]。在此基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計考察藥液濃縮比、殼聚糖溶液用量、絮凝溫度、靜置時間，優(yōu)選最佳純化工藝。通過層次分析法及正交實驗設(shè)計，優(yōu)選了最佳純化工藝：藥液比為1∶6，殼聚糖溶液用量為15%，水浴絮凝溫度為30 ℃，靜置時間為3 h。該方法與傳統(tǒng)的醇沉法比較，價格便宜，操作簡單方便，可縮短生產(chǎn)周期，適宜工業(yè)化大生產(chǎn)。