米渣肽雙酶兩步水解法制備過程中物化特性與結(jié)構(gòu)變化

黃金梅，胡居吾，高紅，熊華，趙強*

1(食品科學與技術(shù)國家重點實驗室(南昌大學),江西 南昌, 330047)2(江西省科學院,應(yīng)用化學研究所,江西 南昌, 330096)3(德州鄉(xiāng)盛食品有限公司,山東 德州, 253009)

酶解法是目前生產(chǎn)活性肽的最主要方法，其優(yōu)點是產(chǎn)品安全性高，生產(chǎn)條件溫和高效，對蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值破壞小，可生產(chǎn)特定的功能肽[1]。酶解法主要分為單一酶解法、分步水解法和復合酶法，其中單一蛋白酶解法對蛋白大分子進行水解獲得活性肽是文獻中報道最多的方法。然而，該法在水解反應(yīng)一段時間后酶活力易于降低，同時酶作用位點的消失常使水解達到一個平臺期，水解效率下降，使得活性肽的得率相對較低。利用多種蛋白酶組合可克服以上不足，不僅能提高水解效率，縮短酶解時間，更能顯著提高活性肽的產(chǎn)量[2]。張紅梅等[3]采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶復合酶解制備大豆蛋白肽，經(jīng)工藝優(yōu)化后水解度可達23.43%；林琳等[2]采用中性蛋白酶和胰蛋白酶協(xié)同水解小麥面筋蛋白，酶解產(chǎn)物DPPH清除率可達91.86%。另外，蛋白酶的復配使用存在酶的復配比例、反應(yīng)條件不好控制，以及酶的相互作用等干擾因素，復合酶法的使用易受到限制。因此，針對不同底物，采用2種及以上酶分步水解的方法，具有不同選擇性與不同酶水解位點靈活性，以及實現(xiàn)深度水解且提高水解產(chǎn)物質(zhì)量的特點，如陳晶等[4]采用酶分步水解法較單獨使用復合蛋白酶或風味蛋白酶的水解度分別提高11.07%，9.81%，同時氮回收率分別提高了5.17%，13.22%。

米渣是生產(chǎn)淀粉和糖漿的副產(chǎn)物，其中蛋白質(zhì)量分數(shù)高達40%～60%，是不可多得的優(yōu)質(zhì)蛋白資源。由于其加工過程經(jīng)歷熱變性，導致溶解性較差，以致利用率低[5]。酶法是一種有效改善米渣蛋白性能的方法，同時可得到具有優(yōu)良生物活性與生理功能的大米蛋白肽，如易吸收，低過敏源性，具有降血壓，抗氧化，調(diào)節(jié)免疫，降低膽固醇等[6-7]功效。前期研究報道有關(guān)米渣肽的制備，多以單酶法和復合酶法為主。如ZHAO等[8]采用5種商用蛋白酶分別對米渣蛋白進行酶解，發(fā)現(xiàn)復合蛋白酶酶解產(chǎn)物的功能性質(zhì)及抗氧化性較好，同時推測堿性蛋白酶與中性蛋白酶復配可能具有較優(yōu)的酶解效果。黃聲芳等[9]發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶和復合蛋白酶復配對提高米渣蛋白改性產(chǎn)物的溶解度作用明顯。王素芳[10]比較米渣蛋白的酶解結(jié)果發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解物具有較好的溶解性、疏水性及乳化穩(wěn)定性。然而，雙酶分步水解法在米渣肽開發(fā)方面的研究較為少見。另一方面，文獻中有關(guān)肽的理化性質(zhì)的研究主要是分析終產(chǎn)物[11-13]，對于酶解過程的文獻報道較少，而有關(guān)米渣肽的理化性質(zhì)在酶解進程中的變化研究則更少見。

因此，本文嘗試采用胰蛋白酶或中性蛋白酶與風味蛋白酶雙酶分步法制備米渣肽，通過分析蛋白水解度、粒徑、表面疏水性、巰基含量、內(nèi)源熒光、紅外等指標，探究酶解過程中肽的組成結(jié)構(gòu)變化，揭示雙酶法制備米渣肽過程變化規(guī)律，以期為酶解米渣肽的進一步研究奠定基礎(chǔ)，更為制備理化性質(zhì)和功能活性優(yōu)良的蛋白肽提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂米渣，江西恒頂食品有限公司；胰蛋白酶(4 000 U/g)、ASI.398中性蛋白酶(50 000 U/g)、風味蛋白酶(500 LAPU/g)，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司； 8-苯胺-1-萘磺酸、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，美國Sigma公司。

Nano-ZSE馬爾文粒度電位儀，英國Malvern公司；F-7000熒光分光光譜儀，日本日立公司；Nicolet 5700傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Nicolet公司；TU-1900雙光束紫外可見光分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；S-443D型氨基酸分析儀，德國SYKAM公司。

1.2 方法

1.2.1 米渣肽的制備

稱取一定質(zhì)量的脫脂米渣(rice dreg protein，RDP)，以1∶10的固液比加入蒸餾水，根據(jù)前期研究[8-10, 14]，選擇胰蛋白酶與ASI.398中性蛋白酶，酶占底物質(zhì)量的1%，按照表1設(shè)置的條件分別對米渣進行水解2 h，每隔30 min取1次樣，沸水處理10 min， 4 000 r/min離心取上清液。水解完成后按照殘留總底物質(zhì)量加入1%風味蛋白酶，對底物繼續(xù)進行水解2 h，每隔30 min取樣，沸水處理10 min，離心取上清凍干，得到兩大類樣品RDPH-1和RDPH-2。酶解4 h結(jié)束時，相對于原料米渣蛋白，RDPH-1和RDPH-2的得率分別為(38.90±1.82)%和(42.22±0.81)%。

表1 酶的種類及酶解最適條件Table 1 Types of enzymes and optimal conditions for enzymatic hydrolysis

1.2.2 酶解進程中水解度(the degree of hydrolysis，DH)的測定

根據(jù)趙新淮等[15]的方法，取滅酶后的5.0 mL水解液，置于150 mL的燒瓶中，加60 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值8.2。向燒瓶中加入10.0 mL pH 8.2的甲醛溶液，混勻。開動磁力攪拌器，用0.01 mol/L的NaOH標準溶液滴定至pH值為9.20，記錄下此時滴定管中NaOH溶液的體積消耗量V(mL)。同時，取相同濃度未水解蛋白溶液5.0 mL，按上述方法作空白實驗，記錄此時滴定管中NaOH標準溶液的體積消耗數(shù)V2(mL)。米渣蛋白的水解度的計算見公式(1)：

(1)

式中：M為NaOH標準溶液的濃度，mo1/L；V1為滴定樣品稀釋液消耗的0.01 mol/L NaOH標準溶液的體積，mL；V2:為空白實驗所消耗0.01 mol/L NaOH標準溶液的體積,mL；CWD為所用米渣溶液的蛋白質(zhì)量濃度，g/L；V為用于甲醛滴定的水解液的體積數(shù)，mL；htot為每克原料蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù)，本文中該值取7.40。

1.2.3 酶解進程中樣品粒徑的測定

利用馬爾文粒度儀測定米渣肽RDPH-1和RDPH-2的粒徑。取1 mL的肽溶液(1.0 g/L)加入樣品池，控制不要產(chǎn)生氣泡。分別測定不同水解時間樣品溶液的粒徑，平行測定3次[16]。

1.2.4 酶解進程中樣品內(nèi)源熒光的測定

RDPH-1和RDPH-2在不同水解時間的樣品用0.01 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液配制成1.0 g/L溶液，磁力攪拌1 h后測定其內(nèi)源熒光。熒光分光光度計設(shè)置激發(fā)波長為290 nm，發(fā)射波長為300～400 nm， 激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm[17]。

1.2.5 酶解進程中樣品表面疏水性的測定

根據(jù)SUH等[18]描述的方法，使用1-苯胺基-8-萘磺酸(1-anilino-8-naphthalenesulfonate,ANS)作為熒光探針測量蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的表面疏水性(H0)。將樣品溶解在0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，使質(zhì)量濃度達到0.15 g/L，并繼續(xù)將儲備溶液從0.015%連續(xù)稀釋至0.001 5%。取2 mL不同濃度的稀釋樣品，分別加入20 μL ANS，快速混合，靜置3 min后進行熒光測試。設(shè)定激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為470 nm。將熒光強度相對于蛋白質(zhì)濃度作圖，初始斜率是蛋白質(zhì)的表面疏水性(H0)。

1.2.6 酶解進程中樣品巰基含量的測定

通過略微修改，巰基的含量根據(jù)HE等[19-20]的方法進行測定。采用去離子水將每個樣品稀釋至10 g/L的溶液，分取0.5 mL溶液加入到2.5 mL含有8 mol/L尿素的Tris-甘氨酸緩沖液(0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L甘氨酸，0.004 mol/L EDTA，pH 8.0)中。加入20 μL Ellman’s試劑(4 g/L)后，將溶液在室溫下溫育15 min,412 nm下進行吸光度測試。總巰基(SH)的計算如公式(2)：

(2)

式中：D為稀釋指數(shù),1.01；C為蛋白質(zhì)量濃度(g/L)；A412為在412 nm處的吸光值。

1.2.7 傅里葉紅外光譜分析

稱取約5 mg樣品與200 mg干燥的KBr置于瑪瑙研缽中混合研磨均勻，放入錠劑成型器中，加壓處理得到一定直徑及厚度的透明片，采用傅里葉紅外光譜儀測定波長4 000～400 cm-1的吸收光譜，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32次[21]。

1.2.8 氨基酸組成的測定

依據(jù)所測樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)，稱取適量的待測樣品放入水解管中，加入6 mol/L HCl 10 mL，1 g苯酚，充氮氣處理約10 min，水解管封好后置于110 ℃的烘箱中水解 24 h；水解完畢后，用超純水將水解管中的溶液定容至50 mL。取適量定容后的樣品0.5～1 mL，60 ℃水浴蒸干，加入適量超純水溶解，重復蒸干1～2次，最后加入樣品稀釋液3～5 mL復溶。振蕩混勻過0.22 μm微濾膜，氨基酸自動分析儀測定樣品中的氨基酸質(zhì)量分數(shù)[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解進程中水解度的變化

水解度是蛋白質(zhì)酶解過程中衡量肽鏈斷裂程度的重要指標。圖1反映了隨著時間的延長水解度呈增長趨勢。連續(xù)水解的第一階段(0～2 h)分別加入胰蛋白酶和中性蛋白酶，胰蛋白酶在前30 min反應(yīng)迅速，水解度達到7%，而中性蛋白酶反應(yīng)緩慢，水解度甚至不到2%。第二階段(2～4 h)加入風味蛋白酶后反應(yīng)體系繼續(xù)水解，水解度隨著時間延長繼續(xù)增加，同樣在 30 min的增速較為迅猛，反應(yīng)結(jié)束時RDPH-1的水解度(29.09±0.24)% 顯著高于RDPH-2的水解度(16.47±0.93)%，并且顯著高于單一的蛋白酶對米渣蛋白進行處理的水解度[8]。結(jié)果表明，胰蛋白酶+風味蛋白酶比中性蛋白酶+風味蛋白酶水解米渣蛋白相對更完全，并且與JIN等[23]利用堿性蛋白酶和風味蛋白酶酶解玉米蛋白肽的水解度達到了21.02%相似。由于不同的蛋白酶具有不同的酶切位點和催化特性，胰蛋白酶主要作用于蛋白質(zhì)氨基酸肽鏈中的賴氨酸和精氨酸殘基，較中性蛋白酶廣泛特異性處理米渣蛋白更具有針對性，配合酸性的風味蛋白酶的廣泛特異性，復合使用會增強酶對米渣蛋白的水解作用，使單一的酶解效果得到改善，從而獲得更多的小分子肽。

圖1 酶解過程水解度隨時間變化情況Fig.1 Degree of hydrolysis of RDP as influenced by time

2.2 酶解進程中樣品粒徑的變化

圖2是RDPH-1和RDPH-2的不同水解時間粒徑變化分布曲線，兩者的粒徑分布大部分集中在<1 000 nm。 RDPH-1在酶解初始階段(30～90 min)粒徑逐漸增加，120～180 min粒徑減小，直至酶解240 min粒徑增加。RDPH-2除了在120 min的粒徑減小，其余時間的粒徑變化與RDPH-1類似。這表明酶解是一個動態(tài)的過程，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生肽或氨基酸，同時發(fā)生著重新聚集的現(xiàn)象，控制條件尚不明確。據(jù)文獻報道，低分子質(zhì)量肽的存在可促進Plastein的形成，是一種具有疏水性質(zhì)的大分子物質(zhì)，而Plastein反應(yīng)是蛋白酶誘導的肽聚集過程。FUJIMAKI等[24]報道使用微生物蛋白酶使水解度增加的同時可導致蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中形成的Plastein產(chǎn)率增加。因此，本實驗過程中出現(xiàn)粒度變化推測可能是發(fā)生了Plastein反應(yīng)，小分子肽又重新聚集或形成新的類似蛋白

a-RDPH-1；b-RDPH-2圖2 不同酶解時間米肽的粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of rice peptides at different enzymatic hydrolysis time

質(zhì)的物質(zhì)[25- 26]。對比之下，RDPH-1較RDPH-2酶解過程中的粒徑較大，可能的原因是胰蛋白酶水解產(chǎn)物進一步發(fā)生Plastein反應(yīng)的程度應(yīng)該更高。

2.3 酶解進程中樣品內(nèi)源熒光的變化

蛋白質(zhì)的內(nèi)源性熒光光譜分析，可反映蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)變化。蛋白質(zhì)的熒光發(fā)射峰的最大吸收波長紅移，λmax增大，而蛋白質(zhì)的熒光發(fā)射峰的最大吸收波長藍移，λmax減小，紅移或藍移的大小能體現(xiàn)出蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變的程度。一般來說，最大吸收波長的紅移表明熒光發(fā)射基團暴露在溶劑中，蛋白質(zhì)分子展開；如果最大吸收波長沒有發(fā)生偏移現(xiàn)象，只有熒光強度的變化，則不能判斷為明顯的蛋白構(gòu)象發(fā)生改變[27]。從圖3可以看出，不同時間得到的米肽產(chǎn)物的內(nèi)源熒光發(fā)生了變化，RDPH-1的λmax大小順序為120、180、90、240、60、30 min，RDPH-2的λmax大小順序為180、240、90、60、120、30 min，酶解初始30 min的內(nèi)源熒光λmax都比之后水解樣品的內(nèi)源熒光的λmax低，內(nèi)源熒光發(fā)射峰的最大吸收波長發(fā)生了不同程度的紅移，并且最高峰熒光強度也有改變，這表明水解過程中蛋白質(zhì)構(gòu)象明顯發(fā)生了改變，同時兩種酶解體系產(chǎn)物的熒光強度差異性明顯。

a-RDPH-1；b-RDPH-2圖3 不同酶解時間米肽的內(nèi)源熒光變化情況Fig.3 Changes in endogenous fluorescence of rice peptides at different enzymatic hydrolysis time

2.4 酶解進程中表面疏水性的變化

蛋白質(zhì)表面疏水性，就是指在水相環(huán)境中，蛋白質(zhì)分子表面的疏水性殘基的數(shù)目。將蛋白質(zhì)進行適度的水解可引起蛋白質(zhì)部分變性，導致分子結(jié)構(gòu)疏松，埋藏在分子內(nèi)部的疏水性肽段暴露在溶劑中，使蛋白質(zhì)的表面疏水性發(fā)生變化。RDPH-1和RDPH-2的表面疏水性都隨時間的變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律，如圖4所示，不同時間的RDPH-1的表面疏水性有著顯著差異(P<0.05)，隨著時間的增加表面疏水性先快速下降又逐漸增加，在60 min時表面疏水性最低，240 min時達到最高，為3 622.50±45.07，這表明有大量疏水性片段生成，與楊瑾[28]的研究發(fā)現(xiàn)較為一致，適度的酶解可使表面疏水性增加，但隨著酶解的進行表面疏水性減小。RDPH-2的各個樣品的表面疏水性也有類似的變化規(guī)律，然而變化較為緩慢，部分樣品之間有顯著性差異，且在90 min時表面疏水性為最低(22.04±1.13)。在酶解初期，可能是由于蛋白酶的作用，蛋白質(zhì)表面疏水基團開始外露，使得表面疏水性增加，但隨著酶解反應(yīng)的進行，表面外露的疏水基團被水解導致表面疏水性下降；進一步的酶解產(chǎn)生肽段的過程，使更多疏水性氨基酸殘基暴露出來，從而增大了表面疏水性，尤其是在風味蛋白酶加入后，表面疏水性繼續(xù)增加，這與郭延熙等[29]發(fā)現(xiàn)米糠酶解物表面疏水性指數(shù)在不同酶解時間的變化規(guī)律相類似。同時可以發(fā)現(xiàn)，RDPH-1的表面疏水指數(shù)較RDPH-2整體大10倍多，表明胰蛋白酶較中性蛋白酶水解米渣蛋白能力更強，并且在風味蛋白酶的作用下，水解進一步大幅提升，與水解度曲線結(jié)果較為一致。

a-RDPH-1；b-RDPH-2圖4 不同酶解時間米肽的表面疏水性Fig.4 Surface hydrophobicity of rice peptides at different enzymatic hydrolysis time注：不同字母代表差異顯著，P<0.05。

2.5 酶解進程中樣品總巰基含量的變化

巰基是一種能清除自由基的化學基團，存在于蛋白分子中能發(fā)揮抗氧化作用。雙酶法水解米渣蛋白在不同時間制備的米肽的巰基含量變化如圖5所示。

圖5 不同酶解時間米肽的總巰基含量Fig.5 Surface hydrophobicity of rice peptides at different enzymatic hydrolysis time注：a-c或m-n字母不同分別表示差異顯著，P<0.05。

由圖可知對于RDPH-1，在60 min時米肽產(chǎn)物總巰基含量相對于30 min產(chǎn)物顯著增加，表明胰蛋白酶直接降解了米渣蛋白中的部分二硫鍵，形成了更多的巰基；之后出現(xiàn)大幅度下降，尤其是在120 min后，但隨著水解度增大巰基含量變化不明顯。減少的原因可能是水解進行到60 min后，米肽產(chǎn)物達到巰基含量的某種平衡，水解度越大，酶解促使米肽產(chǎn)物的巰基氧化，伴隨著熱作用也會導致巰基氧化成二硫鍵；而酸性的風味蛋白酶水解并沒有改變米肽產(chǎn)物的巰基含量，可能是風味蛋白酶對米渣蛋白的水解不會氧化蛋白質(zhì)的巰基基團，此時水解液的熱穩(wěn)定性有了較大的提高，同時游離的米肽會發(fā)生水解-聚集的動態(tài)變化，在120 min后，巰基變化不明顯，此階段對于RDPH-2也是一樣的。對于RDPH-2的巰基含量在全程來看變化不大，可能是中性蛋白酶對于降解蛋白中的二硫鍵能力較弱，在反應(yīng)達到90 min時巰基含量基本不再發(fā)生變化。在反應(yīng)達到90 min后，RDPH-1較RDPH-2的水解度更大，但巰基含量則較小，推測RDPH-1發(fā)生Plastein反應(yīng)的肽聚集程度更高，形成了更多二硫鍵，這與文中粒徑的結(jié)果相一致。

2.6 蛋白二級結(jié)構(gòu)的組成

傅里葉紅外光譜分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)研究主要基于酰胺Ι帶，在1 600～1 700 cm-1，主要包含了C=O伸縮振動[30]，其中，1 650～1 658 cm-1為α-螺旋，1 610～1 640 cm-1為β-折疊，1 660～1 695 cm-1為β-轉(zhuǎn)角，1 640～1 650 cm-1為無規(guī)卷曲。圖6是RDP，RDPH-1和RDPH-2的紅外圖譜，經(jīng)過酶解后峰位和峰強都發(fā)生了變化。3 400～3 500 cm-1向低波數(shù)方向發(fā)生了位移，峰型變寬，表示酰胺羰基沿著多肽骨架發(fā)生振動。圖7即為米渣蛋白及其酶解4 h產(chǎn)物的紅外光譜去卷積擬合圖，從圖中可以知道RDP的結(jié)構(gòu)主要分為6個區(qū)域，RDPH-1光譜相比于RDP恰好藍移了5 cm-1，而RDPH-2的頻帶也發(fā)生了移動，但整體相對于RDP較凌亂而無規(guī)律，表明酶解處理明顯改變了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，也證實了前面所討論的特性反映出來的結(jié)構(gòu)差異。表2是不同二級結(jié)構(gòu)的質(zhì)量分數(shù)，RDPH-1和RDPH-2的β-轉(zhuǎn)角的含量分別為43.79%和49.47%，明顯高于米渣蛋白的25.33%，其余3種結(jié)構(gòu)的含量與米渣蛋白的相比都減少了。這可能是由于α-螺旋，β-折疊，無規(guī)卷曲損失導致了β-轉(zhuǎn)角的增加，而轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)被認為是蛋白質(zhì)高度有序結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物[31]。結(jié)果進一步表明酶解處理改變了米渣蛋白的二級結(jié)構(gòu)，能發(fā)現(xiàn)RDPH-1和RDPH-2結(jié)構(gòu)有顯著不同，表明兩者由于水解蛋白酶的差異，導致最終在蛋白結(jié)構(gòu)組成上可能存在較多不同之處。

圖6 米渣蛋白及其酶解4h產(chǎn)物的紅外光譜Fig.6 FTIR spectrum of RDP and rice peptides at enzymatic hydrolysis 4 h

a-RDP;b-RDPH-1;c-RDPH-2圖7 米渣蛋白及其酶解4h產(chǎn)物的紅外光譜去卷積擬合圖Fig.7 Curve fitting results of deconvoluted FTIR spectra of RDP, RDPH-1, and RDPH-2 at enzymatic hydrolysis 4h

表2 米渣蛋白及其酶解4 h產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)組成Table 2 Secondary structure compositions of RDP and rice peptides at enzymatic hydrolysis 4 h

注：表中不同字母代表差異顯著，P<0.05。

2.7 氨基酸組成

表3為水解4 h后2種不同的米肽RDPH-1和RDPH-2的氨基酸組成。由表可知，人體必需氨基酸種類齊全，天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸的含量較為豐富，并且兩者的必需氨基酸分別為27.01、27.63 g/100 g。由此可知，盡管雙酶法制備米肽所用酶不相同，各氨基酸的含量不盡相同，但主要的氨基酸種類較為一致，并且營養(yǎng)價值幾乎相當。蛋白水解物的氨基酸組成與其活性有關(guān)，如Tyr，Met，His，Lys，通常被認為有抗氧化活性[32]，RDPH-1和RDPH-2包含14.08和14.45 g/100 g以上的這幾種氨基酸，表明它們有潛在的抗氧化活性。Glu對神經(jīng)系統(tǒng)具有非常積極的作用，并且在運動期間也是有幫助的。Asp被認為對氧化脫氨有幫助，可降低血氨濃度，從而延緩疲勞的發(fā)生[33]。RDPH-1和RDPH-2的Asp分別為19.36和21.10 g/100 g，表明有潛在的緩解疲勞功能。

表3 酶解4 h樣品的氨基酸組成單位:g/100 g 蛋白

3 結(jié)論

本文利用胰蛋白酶+風味蛋白酶，中性蛋白酶+風味蛋白酶進行雙酶法酶解米渣蛋白，制備兩種系列蛋白肽RDPH-1和RDPH-2，研究米渣連續(xù)水解過程，了解酶解的動態(tài)變化。發(fā)現(xiàn)隨著反應(yīng)時間的延長，前者較后者酶解更迅速，4 h后前者水解度比后者高13.62%；由于水解作用，米肽產(chǎn)物的粒度及結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水殘基暴露，肽的表面疏水性先減后增；同時蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的巰基被破壞，巰基含量降低；RDPH-1較RDPH-2的酶解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，氨基酸主要組成成分相似，營養(yǎng)價值相當，但Asp，Tyr，Met，His，Lys含量有差異。本研究為肽的高效制備提供了一定的理論基礎(chǔ)。