南海海域養(yǎng)殖牡蠣中麻痹性貝類毒素分析

王媚　吳移山　林華娟

摘要：本研究在2013年3月采集湛江、陽江、欽州、北海、汕頭、汕尾、深圳、臺山等8個位于南海海域的養(yǎng)殖牡蠣，用小鼠生物（MBA）法和高效液相色譜（HPLC）法進行麻痹性貝類毒素檢測。MBA毒性分析結(jié)果顯示：8個區(qū)域養(yǎng)殖牡蠣的毒素含量為OM U/g-2.3MU/g，符合我國貝類食品安全限量要求;HPLC毒素成分分析結(jié)果顯示：湛江、深圳、汕頭、臺山和陽江等5個海域的養(yǎng)殖牡蠣體內(nèi)檢測出痕量的麻痹性貝類毒素，湛江、深圳、汕頭和陽江海域的養(yǎng)殖牡蠣中檢出高毒性的STX和necSTX。本次麻痹性貝類毒素測試MBA法的檢出率為2.5%，HPLC法的檢出率為62.5%，HPLC法更適合于檢測麻痹性貝類毒素含量低的樣品。

關(guān)鍵詞：南海海域：牡蠣：麻痹性貝類毒素

麻痹性貝類毒素（PSP）是一類劇毒的含氮雜環(huán)有機物，其基本化學(xué)結(jié)構(gòu)是帶兩個胍基（=NH2）的嘌呤核，目前已經(jīng)分離出24種毒素，研究得比較多的主要有以下三種類型： （1）氨基甲酸酯類毒素（Carbamoyl toxins），如石房蛤毒素（ saxitoxins，STX）、新石房蛤毒素（Neosaxitoxins，neoSTX）、膝溝藻毒素（Gonyautoxin，GTX l-4）; （2） N-磺酰胺甲酰基類毒素（N-sulfo carbamoyl toxins），如C1-4.GTX5（Bi）、GTX6（B2）; （3）脫氨甲?；惗舅兀―ecarbamoyltoxins），包括dc STX. dc neo STX. dc GTX卜4等[1，2]，PSP的主化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。在24種PSP中以氨基甲酸酯類毒素中的STX最為常見，是目前最主要的研究對象[3]。貝類毒素的形成與海洋中有毒藻類赤潮密切相關(guān)。

PSP對人體有較大的毒性，其在貝類體內(nèi)呈結(jié)合狀態(tài)，因此貝類攝入此毒素對自身不會造成危害。當(dāng)人攝入含PSP的食物后，毒素進入人體會迅速釋放并呈現(xiàn)毒性，中毒的臨床癥狀有輕微的麻刺感、呼吸麻木、窒息死亡[4]。牡蠣一般養(yǎng)殖在江河人?？诨蚝硟?nèi)的浮游生物豐富、泥沙底的近岸灘涂，水深不大，所以牡蠣的PSP毒性檢出率相對較高[5]。

一、實驗材料、試劑與儀器

1.實驗材料。牡蠣樣品于2013年3月采集于欽州、北海、湛江、臺山、深圳、汕尾、陽江和汕頭等八個牡蠣養(yǎng)殖基地，總共有8組樣品。牡蠣活體樣品送至實驗室后，用水沖洗外殼，用不銹鋼刀將外殼打開取肉，清洗并瀝干水分后勻漿，于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.實驗試劑。實驗所使用的麻痹性貝類毒素標準系列：石房蛤毒素群（STX和neo- STX）和N-磺酰氨甲?；惗舅厝海–I和C2）均購于加拿大海洋生物研究所;20±29昆明系雄性小鼠，實驗動物許可證號為SYXK2008-0010;乙酸、磷酸氫二鉀、鹽酸、乙腈、庚烷磺酸鈉、C18固相萃取柱（ Waters）、柱后衍生液（70mmol/L高碘酸、0.1 2mol/L氫氧化鉀和0.75mo1/L甲酸銨的20%甲酰胺，Ph7.3-7.5）和磷酸。

3.實驗儀器。高效液相色譜儀LC-20AD（日本島津）、RF-IOAXL熒光檢測器、CRB-6A柱后衍生裝置;色譜柱XB-C18 （4.6mm×150mm，Ultimate）;恒溫水浴鍋、離心機、固相萃取裝置和渦旋混合器。

二、分析方法

1.小鼠生物（MBA）法。按GB/T5009.213-2008《貝類中麻痹性貝類毒素的測定》用鹽酸提取PSP毒素。取體重在20±29范圍的昆明系雄性小鼠三只，稱重并記錄重量。將ImL鹽酸提取液腹腔注射于小鼠，記錄注射完畢時間和小鼠死亡時間。以體重209的昆明系雄性小鼠在腹腔注射后15min死亡的致死量為1個鼠單位（MU），根據(jù)麻痹性貝類毒素死亡時間 鼠單位（MU）關(guān)系表和小鼠體重校正表，計算PSP的毒力，檢出限為2MU/。

2.高效液相色譜（HPLC）法。定量取小鼠生物法樣品的鹽酸提取液，過C18固相萃取柱凈化后，經(jīng)高效液相色譜儀和在線柱后衍生，即HPLC的洗脫液與高碘酸等反應(yīng)液反應(yīng)生成熒光衍生物，用熒光檢測器檢測，外標法定量。

柱后衍生反應(yīng)的條件：衍生液流速0.8min/mL，柱后衍生溫度50℃，熒光檢測器激發(fā)波長330nm，熒光波長390nm。流動相為2mmol/L庚烷磺酸鈉磷酸緩沖溶液（pH7.1）：乙腈=96：4。

三、結(jié)果與分析

1.牡蠣中PSP的測定結(jié)果。本次試驗首先用小鼠生物法（MBA）法檢測采自欽州、北海、湛江、陽江、臺山、深圳、汕尾和汕頭等8個海域的牡蠣體內(nèi)PSP毒性值，結(jié)果見表1、2。

從表2可得知，本次研究中的采樣點欽州、北海、湛江、臺山和汕尾的牡蠣中PSP毒性值均小于2MU/g（即未檢出），而采自深圳和汕頭的牡蠣均檢出PSP，且毒性值都為2.3MU/g，未超出4MU/g的安全食用限值。2013年3月，南海海域的牡蠣中PSP檢測結(jié)果顯示該海域的牡蠣受到輕度污染，又以粵東一帶海域是主要染毒區(qū)，欽州、北海、湛江、陽江、臺山和汕尾等海域的牡蠣使用MBA法均未檢出PSP。

由于MBA法敏感性差異較大，從而造成結(jié)果的波動性較大，為了防止MBA法出現(xiàn)假陰性結(jié)果，本次檢測同時使用靈敏度較高的HPLC法對MBA法的毒素提取液進行毒素分析，從牡蠣中檢測出毒性較低的C1和C2，中等毒性的dcSTX，以及毒性較強的neo STX和STX，結(jié)果見表2。

從表2可得知，本次欽州、北海和汕尾海域的牡蠣經(jīng)HPLC分析均未檢測出任何一種的毒素成分，而湛江、陽江、臺山、深圳和汕頭海域的牡蠣均檢測出含有痕量的毒素，但因為色譜峰面積過小，無法進行準確的定量。湛江、陽江和臺山海域的牡蠣在小鼠生物法中未能檢測出PSP，但卻從HPLC法中檢測出含有極微量的STX，neoSTX和C2。

此結(jié)果顯示，湛江、陽江和臺山海域的海產(chǎn)品同樣具有受到PSP污染的風(fēng)險。欽州和北海的牡蠣在本次調(diào)查中均未檢測出PSP，可能與該海域為開放式海域，海水自凈能力較強有一定的關(guān)系。另據(jù)2005年盧楚謙等人在廣西近岸海域作的PSP調(diào)查發(fā)現(xiàn)附近海域有貝類染毒，該海域貝類的染毒高峰期是在4-5月和7-11月[6]，本次調(diào)查的采樣時間段并不在染毒高峰期內(nèi)，因此該海域的貝類受PSP污染的風(fēng)險不可忽視。

2.MBA法和HPLC法檢測PSP結(jié)果分析。8組牡蠣樣品在進行生物測試的同時也進行了HPLC方法的測試，MBA法帶毒牡蠣檢出率為25%，HPLC法帶毒牡蠣檢出率為62.5%，前法的檢出率明顯低于后法。臺山海域的牡蠣在HPLC法中檢測出1.12Ug/g的C.毒素，但在MBA法中卻未檢測出毒素，由于C2毒素的毒性較低，僅相當(dāng)于STX毒性的13%，因此實驗動物未出現(xiàn)中毒癥狀。

3.南海海域養(yǎng)殖牡蠣PSP安全性評價。我國對貝類食品中PSP最高限值的規(guī)定為4MU/g，本次PSP毒性調(diào)查中牡蠣的PSP毒性值在OMU/g-2.3MU/g，與黃海和渤海[7，8]等海域相比較，總體毒性值均低于我國食品安全限值。因此，食用南海海域養(yǎng)殖或者捕撈的貝類中毒的風(fēng)險比較小，但必須保持謹慎的態(tài)度，不可過量食用。

4.不同海域間的PSP結(jié)果比較。本次調(diào)查牡蠣的采樣范圍東至汕頭西至欽州，覆蓋了整個南海海域，除了汕尾、欽州和北海海域的牡蠣未檢測出PSP外，其余5個海域的牡蠣均有檢測出PSP，結(jié)果說明湛江及其周邊海域均遭到PSP不同程度的污染。PSP污染貝類具有一定的地域性，粵東海域PSP檢出率和毒性值較其他海域的高，主要集中在深圳和汕頭海域。在HPLC法檢出的毒素種類中，80%都為高毒性的氨基甲酸酯類毒素（STX和neoSTX），這個結(jié)果與2001-2002年秋季吳施衛(wèi)等人用HPLC法分析廣東省近岸海域貝類時高毒性毒素STX、GTXI檢出率較低、中低毒性毒素C1-2、GTX3-5檢出率較高[9]的結(jié)果有差異。與前文獻[10]相比較，高毒性的PSP毒素主要出現(xiàn)在秋冬季節(jié)，而本次調(diào)查的春季牡蠣體內(nèi)高毒性的毒素卻有高檢出率，應(yīng)當(dāng)引起重視，這與周邊海洋環(huán)境的惡化、產(chǎn)毒藻類的增加和有毒赤潮的發(fā)生不無關(guān)系，從另一側(cè)面也反映了該海域貝類體內(nèi)的毒素有增強的趨勢。湛江海域的牡蠣雖在MBA法中沒有檢測出PSP，但在靈敏度更高的HPLC法中檢測出含有痕量高毒性的STX，推測湛江海域存在著產(chǎn)毒的毒藻，從而使湛江海域海產(chǎn)品感染PSP的風(fēng)險大增。

四、結(jié)論

近年來，我國針對貝類的質(zhì)量安全做出了巨大的努力，麻痹性貝類毒素已經(jīng)被列入貝類安全監(jiān)控的常規(guī)檢測指標，但因食用貝類中毒事件仍相繼發(fā)生，本次檢測分析暴露了我國海域麻痹性貝類毒素安全狀況不容樂觀。我國對PSP的研究起步較晚，相關(guān)研究和資源措施都非常缺乏，只有少數(shù)幾個科研單位在做相關(guān)的研究工作。受毒素提取困難、檢測方法靈敏度低、檢測成本昂貴等因素的影響，一直以來對PSP的檢測和監(jiān)控難以廣泛開展。為了防止因PSP引發(fā)的對外貿(mào)易質(zhì)量安全問題的發(fā)生，保護消費者的生命健康，必須增加對麻痹性貝類毒素的研究工作，加強南海海域PSP的監(jiān)控。

參考文獻

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