基于切片技術(shù)的不同顏色籽粒幼苗發(fā)育及花青素累積探討

馮漢宇 魏建華 王旭明 張殿朋 岳躍森 歐陽(yáng)

摘? ?要：為了明確花青素在籽粒和幼苗組織細(xì)胞內(nèi)的累積分布，采用徒手切片，在顯微鏡下觀察京501、京24、A-44、A-45和A-40-3株系的籽粒糊粉層和幼苗組織。結(jié)果表明：京501和京24糊粉層淺黃色，A-44籽粒糊粉層細(xì)胞有紅黑色糊粉粒，A-45籽粒糊粉層細(xì)胞有紅色糊粉粒，A-40-3籽粒糊粉層細(xì)胞有黑色糊粉粒，不同放大倍數(shù)條件下A-45的糊粉粒都是紅色，A-40-3的糊粉粒由黑色變?yōu)榧t黑色;室內(nèi)條件下京501幼苗胚芽鞘綠色，裸露根系白色，京24幼苗胚芽鞘與裸露根系紫紅色，A-44，A-40-3和A-45幼苗胚芽鞘與裸露的根系淡紫紅色;田間條件下，京501幼苗胚芽鞘淡紫色，露出根系紫紅色，京24、A-44、A-40-3和A-45幼苗胚芽鞘與露出根系深紫紅色。結(jié)合以上可知，花青素主要分布在糊粉層、紫紅鞘和根皮層組織細(xì)胞內(nèi)。

關(guān)鍵詞：玉米;切片;花青素;累積分布

文章編號(hào)： 1005-2690（2019）01-0094-03? ? ? ?中圖分類號(hào)： S513; TP391.41? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： B

玉米的種子由果皮、胚、胚乳、糊粉層及黑色層幾部分組成。種子發(fā)芽過程中，胚、胚乳和糊粉層能夠再利用，胚發(fā)育成幼苗，胚乳和糊粉層被分解供幼芽或苗利用;種子萌發(fā)期間胚釋放出一種植物激素誘發(fā)糊粉層產(chǎn)生淀粉酶和合成一些蛋白水解酶，淀粉酶將淀粉轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇艿奶穷惞┡呱L(zhǎng)，因此糊粉層的生理活動(dòng)和結(jié)構(gòu)變化關(guān)系非常密切 [1]。前人通過切片和顯微技術(shù)對(duì)種子果皮[2，3]、胚乳細(xì)胞[4，5]、胚乳傳遞細(xì)胞[6，7]、糊粉層[8]及維管束[9～13]等組織、器官進(jìn)行了一些研究，而且李廣偉（2016）采用姿態(tài)調(diào)整裝置設(shè)計(jì)提高了育種用玉米種子切片取樣自動(dòng)識(shí)別方法的準(zhǔn)確性，該方法可為玉米種子自動(dòng)定向切片問題提供解決方案[14]。但是對(duì)于彩色玉米育種用玉米種子切片自動(dòng)定向問題未能提供解決方案，所以目前還只能采用徒手切片。

本研究以不同顏色糊粉層玉米籽粒為材料，以徒手切片為基礎(chǔ)，調(diào)查不同顏色玉米種子萌發(fā)到苗期的形態(tài)變化，并對(duì)糊粉層、莖鞘及根進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)觀察，力圖從發(fā)育生物學(xué)的角度，初步探討種子內(nèi)和幼苗發(fā)育期間植株中花青素的累積，以明確其物質(zhì)分布的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用玉米材料包括：自交系京501，糊粉層黃色;自交系京24，糊粉層黃色;含花青素基因的F5代種子和F6代苗。具體的材料來(lái)源參照馮漢宇（2018）[15]，編號(hào)A-44株系籽粒糊粉層紅色，A-45株系籽粒糊粉層紅黑色，A-40-3株系籽粒糊粉層黑色。

1.2? ?試驗(yàn)方法

1.2.1? ?切片制作

取不同顏色的玉米籽粒，清水浸泡4 h，剝?nèi)》N皮和胚，用F.A.A固定液固定去胚和種皮的籽粒24 h，用95%乙醇處理20 min，用80%乙醇處理20 min，用75%乙醇保存，制成切片，采用徒手切片法，把材料徒手切片[16，17]。把一些自交系京501、京24以及含花青素基因的F5代株系種子播種于小紅盆中，按時(shí)澆水，并把一些株系放在外面田里、一些放在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，觀察和記錄苗的表型變化，在苗長(zhǎng)到7葉期時(shí)，取一些7葉期的苗，去掉泥土，用清水洗干凈，剪去葉片，截取一部分莖鞘和根，用F.A.A固定液固定24 h，用95%乙醇處理20 min，用80%乙醇處理20 min，用75%乙醇保存，制成切片。

1.2.2? ?切片觀察

徒手進(jìn)行切片，切片厚度不一，但是均在1 mm以下，采用北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心的Leica熒光正置顯微鏡觀察切片，并用LASV 4.5系統(tǒng)進(jìn)行顯微拍照。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?不同顯微鏡和光源影響圖像質(zhì)量

在進(jìn)行籽粒切片試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，紅色籽粒糊粉層在顯微鏡自帶光源下為紫黑色，與裸眼觀察不相符，于是采用顯微鏡外置光源，發(fā)現(xiàn)籽粒糊粉層是紅色，白色淀粉層的為黃色，臨時(shí)采用手機(jī)手電筒光源，籽粒糊粉層是紅色，淀粉層白色復(fù)原，但是透明的載玻片顯示紅色，與手機(jī)圖片下的載玻片顏色不一樣，于是又做了一些糊粉層切片進(jìn)行仔細(xì)觀察，同時(shí)加了一些苗期切片認(rèn)真研究。

2.2? ?顯微鏡下的籽粒糊粉層

在正置顯微鏡觀察了京501、京24、A-44、A-45及A-40-3株系籽粒糊粉層，并在物鏡10倍、20倍、40倍及100倍條件下觀察了A-45和A-40-3糊粉層色澤變化。

由圖2可知，京501和京24糊粉層淺黃色，內(nèi)部有黃色顆粒，A-45紅色糊粉層細(xì)胞內(nèi)有紅色糊粉粒，A-44紅黑色糊粉層細(xì)胞內(nèi)有紅黑色糊粉粒，A-40-3黑色糊粉層細(xì)胞內(nèi)有紅黑色糊粉粒;在物鏡10倍、20倍、40倍及100倍條件下A-45糊粉層都是紅色，細(xì)胞內(nèi)糊粉粒紅色，A-40-3糊粉層由黑色變?yōu)榧t黑色，主要是細(xì)胞內(nèi)糊粉粒由黑色變?yōu)榧t色。由此可知，放大倍數(shù)不同，有些糊粉粒色澤可能不一樣。

2.3? ?苗期表型變化

通過苗期表型觀察，發(fā)現(xiàn)各個(gè)株系苗期表型不一樣。

在室內(nèi)光線微弱的條件下，京501自交系胚芽鞘綠色，露在土壤外面的一些根系是白色的;京24自交系胚芽鞘紫紅色，露在土壤外面的一些根系也是紫紅色;A-44、A-40-3和A-45這3個(gè)株系的胚芽鞘淡紫紅色，露在土壤外面的一些根系也是淡紫紅色。

室外田間條件下與室內(nèi)不完全一樣，京501自交系胚芽鞘淡紫色，露在土壤外面的一些根系是紫紅色;京24自交系胚芽鞘深紫紅色，露在土壤外面的根系也是紫紅色;A-44、A-40-3和A-45這3個(gè)株系的胚芽鞘深紫紅色，露在土壤外面的一些根系是紫紅色，所以A-44、A-40-3和A-45這3個(gè)株系調(diào)控胚芽鞘花青素累積的基因可能來(lái)自京24。

2.4? ?莖鞘與根花青素累積

通過正置顯微鏡觀察了一些幼苗的莖鞘、根皮層維管束組織，發(fā)現(xiàn)它們的結(jié)構(gòu)和色澤不盡相同。京24、A-44、A-45和A-40-3的鞘大部分紫紅色，縱向切片觀察發(fā)現(xiàn)鞘組織淡紫色，細(xì)胞內(nèi)部有紫色花青素累積物，京501的鞘組織白色，沒有紫色花青素小點(diǎn)，它們的莖維管束組織都是白色;京24、A-44、A-45、A-40-3和京501的紫紅色根組織皮層細(xì)胞有紫色花青素累積物，白色皮層和內(nèi)部維管束沒有花青素累積物。通過以上可知，紫色花青素累積物主要分布在紫紅鞘和根皮層組織細(xì)胞內(nèi)。

3? ?討論與結(jié)論

3.1? ?結(jié)論

3.1.1? ?顯微鏡下籽粒組織色澤

顯微鏡下自交系京501和京24淺黃色籽粒糊粉層含有黃色顆粒，A-44紅黑色糊粉層細(xì)胞內(nèi)含紅黑色糊粉粒，A-45株系籽粒淀粉層白色，紅色糊粉層細(xì)胞內(nèi)有紅色糊粉粒，在物鏡10倍、20倍、40倍及100倍條件下糊粉層和細(xì)胞內(nèi)糊粉粒都是紅色，A-40-3株系籽粒黑色糊粉層在物鏡10倍、20倍、40倍及100倍條件下由黑色變?yōu)榧t黑色，主要是細(xì)胞內(nèi)糊粉粒由黑色變?yōu)榧t黑色。由此可知，放大倍數(shù)不同，糊粉粒色澤可能不一樣。

3.1.2? ?苗期花青素表型

各個(gè)株系苗期表型不同。在室內(nèi)光線微弱的條件下，京501自交系胚芽鞘綠色，裸露根系白色，京24自交系胚芽鞘與裸露的根系紫紅色，A-44、A-40-3和A-45株系胚芽鞘與裸露的根系淡紫紅色，室外田間條件與室內(nèi)不盡相同，京501自交系胚芽鞘變?yōu)榈仙?，露出根系紫紅色，京24自交系胚芽鞘與露出根系深紫紅色，A-44、A-40-3和A-45株系的胚芽鞘與露出的根系深紫紅色，所以這3個(gè)株系調(diào)控胚芽鞘花青素累積的基因可能來(lái)自自交系京24。

3.1.3? ?花青素亞細(xì)胞分布

幼苗的莖鞘、根皮層維管束組織結(jié)構(gòu)和色澤有差異。京24、A-44、A-45和A-40-3淡紫色鞘組織細(xì)胞內(nèi)部有紫色花青素累積物，京501的白色鞘組織未發(fā)現(xiàn)紫色花青素小點(diǎn)，它們的莖維管束組織都是白色;京24、A-44、A-45、A-40-3和京501的紫紅色根皮層細(xì)胞內(nèi)含紫色花青素累積物，白色皮層和內(nèi)部維管束無(wú)花青素累積物。通過以上可知，紫色花青素累積物主要分布在紫紅鞘和根皮層組織細(xì)胞內(nèi)。

3.2? ?討論

3.2.1  ?不同光源與切片厚度影響圖像質(zhì)量

有的學(xué)者采用熒光標(biāo)記研究玉米維管束組織，并用染色劑染色，再加上不同色光源觀察，只能看到維管束本身，在同一視野下看不清周邊組織[18]。若不使用染色劑染色，則為黑白片，看不到彩色花青素在玉米幼苗莖鞘組織中累積[19]。

Badone（2010）采用原位切片技術(shù)進(jìn)行籽粒組織學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)花青素在糊粉層累積[20]。在觀察切片的過程中發(fā)現(xiàn)不同光源影響切片色彩，切片厚度調(diào)節(jié)明暗亮度，即使進(jìn)行縱橫切姿態(tài)調(diào)整，也無(wú)法避免有些厚切片由于光線無(wú)法透過而不能使用。

四季草莖切片發(fā)現(xiàn)花青素累積在紫紅色莖皮層細(xì)胞內(nèi)，綠色的莖皮層細(xì)胞內(nèi)沒有花青素累積[21]。

采用本色切片技術(shù)，沒有使用任何染色劑染色，因?yàn)樽蚜：陀酌绫旧砭褪遣噬?，通過切片可以看出籽粒糊粉層黃色無(wú)花青素累積，不同倍數(shù)的紅色、紅黑色及黑色的糊粉層切片都有彩色糊粉粒。

3.2.2? ?種子萌發(fā)成苗與花青素分布

種子從萌芽到苗期花青素累積既受自身基因的調(diào)節(jié)，也受外部環(huán)境的影響。通過對(duì)小麥幼苗胚芽鞘切片觀察，發(fā)現(xiàn)花青素積累在小麥幼苗胚芽鞘外皮層細(xì)胞內(nèi)，小麥幼苗胚芽鞘分布有紫紅色花青素，而綠鞘小麥幼苗觀察不到花青素[22]?；ㄇ嗨睾铣赏緩绞侵参锎紊x途徑之一，花青素苷種類的多樣性則源于其不同分支途徑的形成[23]。

不同類型的花青素玉米，其花青素累積與分布不同，爆裂紫玉米花青素主要累積在果皮[24]，而黑玉米花青素可分布在植株和籽粒中[25]。研究發(fā)現(xiàn)，除了黑玉米外，紅色玉米植株和籽粒也有花青素分布，進(jìn)一步切片分析發(fā)現(xiàn)花青素主要分布于糊粉層細(xì)胞、紫紅鞘和根皮層組織細(xì)胞內(nèi)。

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（收稿日期：2018-08-29）