戊糖片球菌P36胞外多糖體外抗氧化能力的研究

陳佩 翟彩寧 郭紅軍 黨輝

[摘?要]本研究主要從清除DPPH自由基的能力，清除超氧陰離子自由基功能、清除羥自由基和清除ABTS自由基的能力測(cè)試來(lái)評(píng)價(jià)戊糖片球菌P36胞外多糖的體外抗氧化功能。結(jié)果表明，隨著胞外多糖濃度的升高，其抗氧化能力也隨之增加，其中DPPH自由基的清除率最高可達(dá)到30%以上。此結(jié)果為戊糖片球菌P36胞外多糖的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]戊糖片球菌P36;胞外多糖;抗氧化

[中圖分類號(hào)]??TS202 ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A?[文章編號(hào)]1008-4649（2019）01-0093-04

Study on the Antioxidant Capacity of Exopolysaccharide of Pediococcus Pentosaceus P36 in Vitro

Chen Pei1， Zhai Caining2， Guo Hongjun3， Dang Hui4

（1.2.3.Shaanxi Radio & TV University， Xian 710119; 4. Shaanxi Normal University， Xian 710119）

Abstract：Inspected the capability of antioxidation from Pediococcus Pentosaceus P36 of exopolysaccharide in vitro， though four kinds of methods were applied including DPPH and the ability of scavenging hydroxyl radical， superoxide radical and ABTS radical cation scavenging activity. The results showed that the antioxidant activities increased with increase in its concentration. Especially DPPH-free radical scavenging rate can reach more than 30%. This result laid the foundation for the application of exopolysaccharide of Pediococcus Pentosaceus P36.

Key word： Pediococcus Pentosaceus P36; Exopolysaccharide; Antioxidant

正常狀態(tài)下，人體中自由基的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，但由于種種原因?qū)е聶C(jī)體自由基產(chǎn)量升高或者機(jī)體清除自由基的能力下降時(shí)，機(jī)體就會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激，這種狀態(tài)會(huì)使機(jī)體受到一定的損傷，引發(fā)機(jī)體功能障礙[1-3]。機(jī)體抗氧化和抗衰老等能力的強(qiáng)弱主要取決于清除自由基的能力，所以人們對(duì)于抗氧化劑的需求非常迫切。但是人工合成的抗氧化劑因?yàn)槠涑杀据^高，且伴隨有較多的副作用，因此尋求無(wú)毒副作用的天然抗氧化劑成為當(dāng)務(wù)之急。

有研究表明，乳酸菌胞外多糖具有良好的益生活性[4]。本研究所用的戊糖片球菌P36是項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)從陜南泡菜中篩選出的一株高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌株，因有研究表明乳酸菌胞外多糖在體內(nèi)外都具有一定的抗氧化活性[5-6]，故本研究評(píng)價(jià)了戊糖片球菌P36胞外多糖體外抗氧化的能力。

一、材料與方法

（一）材料與儀器

二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）、ABTS 美國(guó)sigma公司;鄰苯三酚、30%的過(guò)氧化氫、硫酸亞鐵、1，10-鄰菲羅啉、氯化鐵 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司。

恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司; SW-CJ-1CV超凈臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;5415R 冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf; UV-2450紫外可見分光光度計(jì) 日本島津。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.乳酸菌菌種。試驗(yàn)用戊糖片球菌P36分離自傳統(tǒng)發(fā)酵食品。將凍存于-80℃的乳酸菌接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h，連續(xù)活化三代后用于后續(xù)試驗(yàn)。

2. 戊糖片球菌P36胞外多糖制備。菌株P(guān)36接種于100 ml 培養(yǎng)基中，42℃下培養(yǎng)24 h，用超高速低溫冷凍離心機(jī)將發(fā)酵液于4℃，12000 r/min冷凍離心15 min，棄沉淀，重復(fù)離心兩次。發(fā)酵濾液加入75%乙醇在4℃下沉淀24 h，再次冷凍離心，重復(fù)離心兩次，取沉淀以蒸餾水復(fù)溶，透析過(guò)夜，定容，即得粗多糖溶液。粗多糖經(jīng)DEAE-Cellulose-52柱純化后得純多糖，以純多糖配制1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL不同濃度的多糖溶液。

3.戊糖片球菌P36胞外多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用。依據(jù)Zhang等[7] 的方法，反應(yīng)體系中加入1 mL不同濃度的多糖溶液，再加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH的無(wú)水乙醇，震蕩充分混勻，在室溫下避光反應(yīng)30 min，再于6000 rpm離心10 min，取其上清，517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度（OD值）。用等體積的生理鹽水代替樣品溶液作為對(duì)照組，并以等體積的生理鹽水和無(wú)水乙醇的混合液作為空白調(diào)零。按照以下公式計(jì)算DPPH自由基的清除率：

DPPH自由基清除率（%）=[1-A樣品/A空白]×100

4. 戊糖片球菌P36胞外多糖對(duì)超氧陰離子的清除作用。參照文獻(xiàn)[5]的方法，取50 mmol/L pH 8.2的緩沖液3 mL，加入25 mmol/L 鄰苯三酚10μL，迅速混勻，置于石英比色杯中，在325 nm處每隔30 s測(cè)定一次吸光值，反應(yīng)4.5 min結(jié)束，以吸光值對(duì)時(shí)間作圖，斜率即為鄰苯三酚自氧化速率A0。在3 mL 緩沖液中加入不同濃度的胞外多糖，同法測(cè)定樣品的自氧化速率As，按照以下公式計(jì)算超氧陰離子自由基清除率：

超氧陰離子自由基清除率（%）=（A0-As）/ A0×100

5. 戊糖片球菌P36胞外多糖對(duì)羥自由基的清除作用。參照文獻(xiàn)[7]的方法，1 mL 2.5 mmol/L的1，10-鄰菲羅啉，1 mL pH 7.4的 PBS和1 mL蒸餾水充分混勻后，再加入1 mL 2.5 mmol/L的FeSO4，充分混勻后，加入1 mL 20 mmol/L的H2O2，37℃中水浴1.5 h，在536 nm處測(cè)定其OD值為A空白。把1mL水替換為1 mL 不同濃度的胞外多糖記為A樣品，將1 mL的H2O2替換為1 mL的水記為A對(duì)照。按照如下公式計(jì)算乳酸菌清除羥自由基的能力：

清除羥自由基能力（%）= [A樣品-A空白）]/[ A對(duì)照-A空白] ×100

6. 戊糖片球菌P36胞外多糖對(duì)ABTS+的清除作用。參照文獻(xiàn)[8]的方法。將7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L的過(guò)硫酸鉀（終濃度）混合，在室溫避光條件下靜置過(guò)夜，將生成的ABTS+溶液用水稀釋，使其在30℃，734 nm 波長(zhǎng)下的吸光度為0.6至0.8之間，即得到ABTS+工作液。取不同濃度胞外多糖溶液1 mL，加入試管中，再分別加入1.5 mL的ABTS+溶液，空白管用蒸餾水代替樣品溶液，對(duì)照管用蒸餾水代替ABTS+工作液，室溫避光放置 6 min，于波長(zhǎng)734 nm下測(cè)定其吸光度。計(jì)算公式為：

ABTS+的清除率（%）=[ A空白-（A樣品-A對(duì)照）]/A空白×100

（三）數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 16.0進(jìn)行one-way ANOVA， Tukeys多重檢驗(yàn)（P < 0.05），數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

二、結(jié)果與討論

（一）戊糖片球菌P36胞外多糖對(duì)DPPH自由基的清除率

本研究對(duì)戊糖片球菌P36不同濃度的胞外多糖清除DPPH的能力進(jìn)行測(cè)定，由圖1可知，戊糖片球菌P36胞外多糖具有一定的抗氧化性，其對(duì)DPPH自由基清除能力均高于10%，并且隨多糖濃度的升高而增加。多糖濃度為5 mg/mL對(duì)DPPH自由的清除率顯著高于濃度為3 mg/mL時(shí)的清除率（P<0.05）。

（二）戊糖片球菌P36胞外多糖對(duì)超氧陰離子的清除率

目前，國(guó)內(nèi)主要通過(guò)鄰苯三酚自氧化法來(lái)測(cè)定抗氧化物對(duì)超氧陰離子的清除率。本研究測(cè)定了戊糖片球菌P36胞外多糖對(duì)超氧陰離子的清除率。如圖2所示，戊糖片球菌P36胞外多糖對(duì)超氧陰離子的清除能力隨胞外多糖濃度的升高而增加。當(dāng)胞外多糖濃度為5 mg/mL時(shí)，其清除率可達(dá)到13.04%。

（三）多糖對(duì)羥自由基的清除作用研究

鄰二氮菲-Fe2+是一種氧化還原指示劑，F(xiàn)e2+與H2O2反應(yīng)后產(chǎn)生羥自由基，其具有很強(qiáng)的氧化能力。鄰二氮菲-Fe2+被羥自由基氧化后生成鄰二氮菲-Fe3+，導(dǎo)致其在536 nm波長(zhǎng)處的最大吸收值減少。加入抗氧化劑之后，羥自由基的濃度減少，所以體系中的吸光值隨之升高。因此羥自由基的變化量可以根據(jù)加入樣品前后吸光值的大小變化來(lái)評(píng)價(jià)，以此來(lái)判定胞外多糖清除羥自由基的能力。本文研究表明，戊糖片球菌P36胞外多糖對(duì)羥基自由基的清除能力隨多糖濃度的升高而增加，多糖濃度為5 mg/mL對(duì)DPPH自由的清除率顯著高于濃度為4 mg/mL時(shí)的清除率（P<0.05）。

（四）多糖對(duì)ABTS+的清除作用研究

ABTS+清除實(shí)驗(yàn)是測(cè)定化合物抗氧化能力的重要方法[9]。ABTS+自由基的產(chǎn)生是通過(guò) ABTS原液與過(guò)硫酸鉀在室溫黑暗中反應(yīng)12-16 h 完成，在供氫抗氧化劑存在的情況下，ABTS+自由基將會(huì)減少。如圖4所示，戊糖片球菌P36胞外多糖對(duì)ABTS+自由基的清除能力隨多糖濃度的升高而顯著增加。多糖濃度為5 mg/mL時(shí)對(duì)ABTS+自由基的清除率比濃度為4 mg/mL時(shí)顯著提高了11%（P<0.05）。

三、結(jié)論

本研究對(duì)戊糖片球菌P36的胞外多糖進(jìn)行了體外抗氧化能力的測(cè)定。隨著胞外多糖濃度的升高，其體外抗氧化的能力隨之升高，當(dāng)胞外多糖濃度為5 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH的清除率達(dá)到了30%以上。結(jié)果表明，戊糖片球菌P36的胞外多糖在體外具有一定的抗氧化作用。因此，可進(jìn)一步在動(dòng)物體內(nèi)評(píng)價(jià)戊糖片球菌P36胞外多糖的抗氧化能力，為以后的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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