適于煙草生物反應(yīng)器的真核生物源蝦青素合成酶篩選

方寧 王春凱 劉曉峰 等

摘 ?要：為揭示不同真核生物源蝦青素合成酶在煙草中的異源表達(dá)生物活性特征，明確開發(fā)蝦青素?zé)煵萆锓磻?yīng)器的關(guān)鍵分子基礎(chǔ)，本研究對(duì)夏側(cè)金盞花（Adonis aestivalis）、雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）及紅發(fā)夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）3種真核生物源蝦青素合成酶基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化合成及表達(dá)載體構(gòu)建，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)試驗(yàn)比較了其在煙草中合成蝦青素的活性差異。結(jié)果表明，3種來源的蝦青素合成酶基因均能在煙草中表達(dá)，但是僅夏側(cè)金盞花和雨生紅球藻來源的合成酶能在煙草中特異合成蝦青素，且夏側(cè)金盞花蝦青素合成酶的活性最高。此外，穩(wěn)定表達(dá)體系優(yōu)于瞬時(shí)表達(dá)體系，能準(zhǔn)確展示不同蝦青素合成酶的活性差異。本研究為真核生物源蝦青素合成酶在煙草生物反應(yīng)器中的應(yīng)用提供了重要基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：生物反應(yīng)器;煙草;蝦青素合成酶;植物;微藻;酵母

中圖分類號(hào)：S572.03 ?????????文章編號(hào)：1007-5119（2019）01-0009-08 ?????DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.01.002

Abstract： In order to determine the bioactivity of eukaryotes astaxanthin synthase ectopically expressed in tobacco， and to reveal the molecular basis for the development of tobacco bioreactor for astaxanthin， we codon-optimized and synthesized three eukaryotic-type astaxanthin synthases from Adonis aestivalis， Haematococcus pluvialis and Xanthophyllomyces dendrorhous respectively， and compared their astaxanthin synthetic bioactivities in tobacco using both transient and stable expression experiments. The results showed that the genes of the three resources were all successfully expressed in tobacco， whereas only the A. aestivalis- and H. pluvialis-derived synthases could specifically synthesize astaxanthin， and the A. aestivalis-derived astaxanthin synthases possessed a higher activity. The results also suggested that the stable expression system was more sensitive than the transient expression system in determining the activity of astaxanthin synthetic enzymes in tobacco. This study has provided molecular basis for the construction of tobacco bioreactor for astaxanthin synthesis.

Keywords： bioreactor; tobacco; astaxanthin synthetic enzyme; plant; algae; yeast

蝦青素是一種含酮基的氧化型類胡蘿卜素，廣泛存在于蝦、蟹、魚、藻以及鳥類羽毛中[1-3]。蝦青素的特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)使其具有極強(qiáng)的抗氧化活性，在心腦血管疾病、糖尿病、癌癥及免疫疾病等的預(yù)防和治療中有積極意義，具有廣闊的市場前景[4-7]。目前，天然蝦青素的生產(chǎn)主要依賴于雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）及蝦蟹廢棄物的提取，普遍存在原料獲取效率低、生產(chǎn)成本高的客觀問題，無法滿足快速增長的市場需求[1]。研究蝦青素生物合成的分子基礎(chǔ)，開發(fā)其高效生物反應(yīng)器是克服現(xiàn)有原料問題的重要途徑。

煙草（Nicotiana tabacum）具有生物量大、次生代謝旺盛的突出優(yōu)勢，是重要的植物生物反應(yīng)器開發(fā)平臺(tái)[8-10]，在蝦青素生物反應(yīng)器開發(fā)研究中一直受到關(guān)注[11-12]。研究表明，蝦青素的生物合成以β-胡蘿卜素為前體物，通過對(duì)β-紫羅蘭酮環(huán)3，3’和4，4’位添加羥基和酮基形成[13-14]。能夠自身合成蝦青素的生物包括：微生物、微藻以及數(shù)量有限的真菌和植物。不同生物對(duì)β-紫羅蘭酮環(huán)添加羥基和酮基的機(jī)理不同，相關(guān)功能酶類也存在極大分子差異。在細(xì)菌中，以副球菌（Paracoccus sp.）為例，該過程依賴于β-胡蘿卜素酮基化酶CrtW和羥基化酶CrtZ的作用[15-16];在藻類中，以雨生紅球藻為例，該過程由β-胡蘿卜素酮基化酶BKT（CtrO）和羥基化酶CHYb催化[11，17];在植物夏側(cè)金盞花（Adonis aestivalis）中，由類胡蘿卜素4-羥基-β-環(huán)4-脫氫酶（HBFD）的加羥基作用和類胡蘿卜素β-環(huán)-4-脫氫酶（CBFD）的脫氫作用分兩步完成4和4’位酮基添加，最后在HBFD的加羥基作用下添加3和3’位羥基，最終形成蝦青素[18-19];在紅發(fā)夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）中，由蝦青素合成酶CrtS借助細(xì)胞色素還原酶CrtR的輔助完成β-胡蘿卜素的酮基和羥基添加[20-21]。在前期研究中，蝦青素的煙草生物反應(yīng)器構(gòu)建主要采用改造的微生物源蝦青素合成酶進(jìn)行，有關(guān)真核生物源蝦青素合成酶在煙草生物反應(yīng)器中的應(yīng)用研究還非常欠缺。深入研究真核生物源蝦青素合成酶在煙草生物反應(yīng)器中的活性，對(duì)高效蝦青素?zé)煵萆锓磻?yīng)器的開發(fā)具有重要科學(xué)意義。

本試驗(yàn)將夏側(cè)金盞花、雨生紅球藻及紅發(fā)夫酵母的蝦青素合成酶關(guān)鍵基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化合成后，通過瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)試驗(yàn)將上述基因?qū)霟煵葜仓闠N90，比較分析了不同真核生物源蝦青素合成關(guān)鍵酶在煙草中合成蝦青素的活性差異，以期為蝦青素?zé)煵萆锓磻?yīng)器的開發(fā)提供分子基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所需煙草（Nicotiana tabacum cv. TN90）材料，大腸桿菌DH5α，農(nóng)桿菌GV3101、LBA4404，以及穩(wěn)定表達(dá)載體pBin19-attR-HA為本實(shí)驗(yàn)室保存材料。瞬時(shí)表達(dá)載體pCAM：pGR106[22]由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院惠贈(zèng)。大腸桿菌熱激感受態(tài)細(xì)胞及農(nóng)桿菌凍融法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞均按常規(guī)方法制備。

試驗(yàn)所需常規(guī)化學(xué)試劑、分子生物學(xué)試劑、細(xì)菌抗生素，配制LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基、YEB（Yeast Extract Beef）培養(yǎng)基和MS（Murashige & Skoog）培養(yǎng)基所需生物試劑，以及構(gòu)建質(zhì)粒載體所需內(nèi)切酶、質(zhì)粒小量提取試劑盒和DNA片段瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自生物工程（上海）股份有限公司。Gateway克隆所需LR Clonase? II重組酶購自美國Invitrogen公司。蝦青素提取和高效液相檢測所需有機(jī)溶劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品購自SIGMA公司。

1.2 ?植物材料培養(yǎng)

試驗(yàn)所需煙草植株均于25 ℃，光周期為14 h光照/10 h黑暗的室內(nèi)溫室中培養(yǎng)。6周齡的煙草植株用于農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)。在穩(wěn)定表達(dá)試驗(yàn)中，用MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的無菌TN90煙草幼苗作為外植體，以農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法培育穩(wěn)定表達(dá)材料。

煙草TN90的無菌苗培養(yǎng)：將煙草種子用消毒液（含5%立白?漂洗液，0.05% Tween20）消毒7 min，并用無菌水洗滌3次后，播種于MS固體培養(yǎng)基上于室內(nèi)溫室培養(yǎng)。

1.3 ?蝦青素合成酶基因的密碼子優(yōu)化及合成修飾

雨生紅球藻是植物界綠藻門生物，紅發(fā)夫酵母是真菌界真菌門生物，與煙草的生物差異較大。為使二者的蝦青素合成酶能在煙草中取得異源表達(dá)效果，在合成雨生紅球藻蝦青素合成酶基因BKT（CtrO）（AY603347.1）和chyb（KP866868.1）以及紅發(fā)夫酵母蝦青素合成酶基因CrtS（HG939455.2）和CrtR（LN554258.1）時(shí)，先依據(jù)其GenBank的登錄序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以符合植物的密碼子偏好性。夏側(cè)金盞花與煙草同屬植物界被子植物門雙子葉植物綱，相互間可實(shí)現(xiàn)基因的異源表達(dá)，因此，其蝦青素合成酶基因AdKeto（AY644757.1）和AdKc

（DQ902555.1）的合成依據(jù)其在GenBank的登錄序列直接進(jìn)行。

為使各生物來源的β-胡蘿卜酮基化酶和羥基化酶在煙草中的表達(dá)水平相對(duì)一致，本研究采用了單轉(zhuǎn)錄框的雙基因串聯(lián)表達(dá)設(shè)計(jì)，兩個(gè)串聯(lián)基因間通過2A剪切肽進(jìn)行連接，以使兩個(gè)編碼蛋白在翻譯后可通過2A肽段剪切分離并發(fā)揮各自功能[23]。2A肽段的添加以及雙基因的串聯(lián)均通過全基因合成完成。此外，因雨生紅球藻和紅發(fā)夫酵母中合成蝦青素的細(xì)胞器與植物不同，特意在其蝦青素合成酶序列的末端增加了葉綠體定位肽（CTS），以使編碼蛋白能夠在煙草葉綠體內(nèi)發(fā)揮功能。圖1的載體構(gòu)建示意圖中可見雙基因串聯(lián)設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)。

1.4 ?瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建及試驗(yàn)方法

在合成以2A肽段序列串聯(lián)的酮基化酶和羥基化酶基因序列片段后，利用限制性內(nèi)切位點(diǎn)Sca I和Asc I將其克隆入pCam：pGR106瞬時(shí)表達(dá)載體，借助菌落PCR擴(kuò)增從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α菌落中鑒定陽性克隆，并進(jìn)行測序驗(yàn)證，分別獲得夏側(cè)金盞花、雨生紅球藻和紅發(fā)夫酵母的蝦青素合成酶表達(dá)載體pCam：pGR106-Aa、pCam：pGR106-Hp和pCam：pGR106-Xd，其PCR擴(kuò)增鑒定引物分別為：5'-ATGGCTGCTATTTCCGTGTTCTC-3'和5'-TAA TAGCTGGCACGTTAGCA-3';5'-ATGCATGTTGCT TCCGCTCTCAT-3'和5'-GCCTTGTGAGCGTACCT AGC-3'以及5'-ATGTTCATCCTTGTGCTTCTTAC-

3'和5'-CTCAACTGGCTTCACCTGAAGCC-3'。

通過液氮凍融法將上述瞬時(shí)表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，借助菌落PCR擴(kuò)增鑒定陽性克隆。將得到的陽性菌落接種至5 mL含有50 mg/mL卡那霉素和50 mg/mL利福平的YEB培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)24 h后;取100 μL菌液接種至50 mL含50 mg/mL卡那霉素、50 mg/mL利福平和20 μmol/L乙酰丁香酮的YEB培養(yǎng)基，過夜振蕩培養(yǎng)。然后，離心收集菌體，重新懸浮于含10 mmol/L MES-KOH （pH 5.5）、10 mmol/L MgCl2和100 μmol/L乙酰丁香酮的懸浮液，至OD600=0.8，室溫靜置誘導(dǎo)3 h，并用注射器將菌液注入煙草葉片內(nèi)，將注射葉片用保鮮膜包裹，置于室內(nèi)培養(yǎng)間培養(yǎng)。2 d后，揭去保鮮膜，繼續(xù)培養(yǎng)4～6周，并在此期間觀察注射葉片及位于其上部的葉片中蝦青素的合成情況。

1.5 ?穩(wěn)定表達(dá)載體構(gòu)建及試驗(yàn)方法

為檢驗(yàn)瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)的結(jié)果可靠性，構(gòu)建了上述不同真核生物源蝦青素合成酶基因的穩(wěn)定表達(dá)載體。將上述以2A肽段序列串聯(lián)的酮基化酶和羥基化酶基因序列片段通過限制性內(nèi)切位點(diǎn)Sac II和Asc I克隆入pENTR-D-Top載體，鑒定出陽性克隆后，將其質(zhì)粒通過Gateway克隆方法在LR Clonase? II重組酶作用下與pBin19-attR載體重組，并鑒定陽性克隆，分別獲得夏側(cè)金盞花、雨生紅球藻和紅發(fā)夫酵母的蝦青素合成酶表達(dá)載體pBin19-Aa、pBin19-Hp和pBin19-Xd，其PCR擴(kuò)增鑒定引物分別為5'-ATGGCTGCTATTTCCGTGTTCTC-3'和5'-

CTGCTTCATGATGAAGTTGATGG-3';5'-ATGCAT GTTGCTTCCGCTCTCAT-3'和5'-ACGCTTGGA

CCAATCCAACTCCA-3'以及5'-ATGTTCATCCTTG

TGCTTCTTAC-3'和5'-CTCAACTGGCTTCACCT GAAGCC-3'。

通過液氮凍融法將上述瞬時(shí)表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，借助菌落PCR擴(kuò)增鑒定陽性克隆。將得到的陽性菌落接種至5 mL含有50 mg/mL卡那霉素和50 mg/mL利福平的YEB培養(yǎng)基，

振蕩培養(yǎng)48 h后;取500 μL菌液接種至50 mL含50 mg/mL卡那霉素、50 mg/mL利福平的YEB培養(yǎng)基，過夜振蕩培養(yǎng)。然后，離心收集菌體，用新鮮YEB培養(yǎng)基重新懸浮后，侵染剪為1cm×1cm的無菌煙草葉片;7 min后除去菌液，將侵染葉片轉(zhuǎn)移至MS固體培養(yǎng)基上于暗中培養(yǎng)2 d;然后，轉(zhuǎn)移至含1 mg/mL 6-BA、250 mg/mL頭孢和50 mg/mL卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基上，于光周期為14 h光照/10 h黑暗的25 ℃溫室培養(yǎng)，直至獲得轉(zhuǎn)基因愈傷及再生苗，并觀察愈傷及再生苗的蝦青素合成情況。

1.6 ?瞬時(shí)及穩(wěn)定表達(dá)材料中的蝦青素合成酶基因表達(dá)鑒定

分別取瞬時(shí)及穩(wěn)定表達(dá)材料0.2 g，用Trizol試劑提取總RNA，并用隨機(jī)引物做反轉(zhuǎn)錄引物，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后，分別用夏側(cè)金盞花、雨生紅球藻和紅發(fā)夫酵母的蝦青素合成酶基因特異引物，檢測基因表達(dá)情況。肌動(dòng)蛋白基因Actin作為表達(dá)分析的內(nèi)參基因。取樣時(shí)，瞬時(shí)表達(dá)材料在注射2周后取樣，剪取注射部位葉片;穩(wěn)定表達(dá)材料，取抗性愈傷及再生苗。表1所示為基因的表達(dá)鑒定引物序列。

1.7 ?蝦青素的提取與測定

取瞬時(shí)或穩(wěn)定表達(dá)蝦青素合成酶的新鮮材料0.5 g，液氮充分研磨后加入2 mL丙酮進(jìn)行色素提取，于7800 r/min離心后取上清液，以相同體積丙酮對(duì)樣品重復(fù)提取3次后，合并上清液并定容至10 mL。取2 mL在暗中于穩(wěn)定氮?dú)饬飨聦⒈舾珊?，用微量氯仿溶解樣品粉末，再以甲醇稀釋? mL，經(jīng)孔徑0.22 μm的尼龍66微孔濾膜過濾后取10 μL進(jìn)行超高效液相色譜（ACQUITY UPLC，Waters）檢測。進(jìn)行UPLC檢測時(shí)，以蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品做參照，所用色譜柱為Waters公司的BEH C18 色譜柱（1.6 μm， 2.1 mm×50 mm），色譜柱溫度為35 ℃，用流速為0.3 mL/min的水-乙腈梯度流動(dòng)相進(jìn)行樣品分離，檢測波長為465 nm。表2所示為水-乙腈梯度流動(dòng)相的組成。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?不同真核生物源蝦青素合成酶基因的瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建

通過全基因合成獲得以2A肽段串聯(lián)的不同真核生物源蝦青素合成酶（含酮基化酶和羥基化酶）DNA片段后，通過限制性內(nèi)切酶Sca I和Asc I克隆至瞬時(shí)表達(dá)載體pCam：pGR106，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，通過菌落PCR擴(kuò)增進(jìn)行了陽性克隆鑒定（圖2），并進(jìn)行了測序檢測，分別獲得夏側(cè)金盞花、雨生紅球藻和紅發(fā)夫酵母的蝦青素合成酶瞬時(shí)表達(dá)載體pCam：pGR106-Aa、pCam：pGR106-Hp和pCam：pGR106-Xd。

2.2 ?不同真核生物源蝦青素合成酶的煙草瞬時(shí)表達(dá)分析

在葉片注射含瞬時(shí)表達(dá)目的載體農(nóng)桿菌GV3101后，通過6周連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，含pCam：pGR106-Aa載體農(nóng)桿菌的葉片注射部位在3～4周后會(huì)出現(xiàn)遍布注射部位的暗紅色斑點(diǎn)，但與葉片的色差并不明顯（圖3A），植株上部的非注射葉片在6周后會(huì)出現(xiàn)一些散布的紅褐色斑塊（圖3A）。而注射含空載體pCam：pGR106農(nóng)桿菌的葉片注射部位未觀察到任何紅色斑點(diǎn)出現(xiàn)，植株上部的非注射葉片在后期會(huì)出現(xiàn)一些散布的花葉斑塊，但無任何紅色斑點(diǎn)（圖3A）。此外，注射含表達(dá)載體pCam：pGR106-Hp或pCam：pGR106-Xd農(nóng)桿菌的植株葉片也未觀察到任何紅色斑點(diǎn)出現(xiàn)。

同時(shí)，以注射4周后的葉片注射部位為材料，提取了總RNA，并通過反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測了不同真核生物源蝦青素合成酶基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示所有目的基因都得到了不同程度的表達(dá)（圖3B）。

以這些結(jié)果推測，來源于夏側(cè)金盞花的蝦青素合成酶在煙草內(nèi)合成蝦青素的活性要高于來源于雨生紅球藻和紅發(fā)夫酵母的蝦青素合成酶。上述試驗(yàn)也表明，瞬時(shí)試驗(yàn)所觀察到的現(xiàn)象不夠明顯，所能獲得的可檢測材料有限。為進(jìn)一步揭示不同真核生物源蝦青素合成酶在煙草中的生物活性差異，進(jìn)行了穩(wěn)定表達(dá)分析。

2.3 ?不同真核生物源蝦青素合成酶基因的穩(wěn)定表達(dá)載體構(gòu)建

將上述以2A肽段串聯(lián)的不同真核生物源蝦青素合成酶（含酮基化酶和羥基化酶）DNA片段通過限制性內(nèi)切位點(diǎn)Sac II和Asc I克隆入pENTR-D-

Top載體，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，通過菌落PCR擴(kuò)增進(jìn)行了陽性克隆鑒定（圖4A），并測序檢測獲得目的克隆。隨后，將陽性克隆質(zhì)粒通過Gateway克隆方法在LR Clonase? II重組酶作用下與目的載體pBin19-attR-HA進(jìn)行重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，通過菌落PCR擴(kuò)增進(jìn)行了陽性克隆鑒定（圖4B），并測序檢測，分別獲得夏側(cè)金盞花、雨生紅球藻和紅發(fā)夫酵母的蝦青素合成酶穩(wěn)定表達(dá)載體pBin19-Aa、pBin19-Hp和pBin19-Xd。

2.4 ?不同真核生物源蝦青素合成酶的煙草穩(wěn)定表達(dá)分析

用含穩(wěn)定表達(dá)目的載體的農(nóng)桿菌LBA4404侵染煙草葉片后，通過4周培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，含表達(dá)載體pBin19-Aa農(nóng)桿菌侵染的葉片分化出了紅色愈傷組織，從紅色愈傷組織發(fā)出的再生苗也呈紅色（圖5A），紅色愈傷及再生苗發(fā)生的比例約占愈傷總數(shù)的2%。而含表達(dá)載體pBin19-Hp農(nóng)桿菌侵染的葉片可分化出淡紅色愈傷組織，但從淡紅色愈傷組織發(fā)出的再生苗均為綠色（圖5A），淡紅色愈傷發(fā)生的比例約占愈傷總數(shù)的1%。然而，含表達(dá)載體pBin19-Xd農(nóng)桿菌侵染的葉片，與含空載體農(nóng)桿菌侵染的葉片類似，未能分化出紅色愈傷組織或再生苗（圖5A）。

隨后，將分化的抗性愈傷擴(kuò)繁后，取樣進(jìn)行總RNA提取，并通過反轉(zhuǎn)錄PCR檢測了不同真核生物源蝦青素合成酶基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示所有抗性愈傷都在不同程度上表達(dá)了目的基因（圖5B）。

從穩(wěn)定表達(dá)試驗(yàn)結(jié)果分析，來源于夏側(cè)金盞花的蝦青素合成酶在煙草內(nèi)合成蝦青素的活性最高，來源于雨生紅球藻的蝦青素合成酶的活性次之，但是未觀察到紅發(fā)夫酵母蝦青素合成酶的活性。與瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)相比，穩(wěn)定表達(dá)試驗(yàn)對(duì)不同生物源蝦青素合成酶在煙草中的生物活性觀察更靈敏，更準(zhǔn)確。

2.5 ?穩(wěn)定表達(dá)材料的蝦青素提取與檢測

在獲得不同生物源真核生物蝦青素合成酶的穩(wěn)定表達(dá)愈傷及再生苗后，從不同材料中取等量樣

品進(jìn)行了蝦青素提取，并以蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品做參照，進(jìn)行了超高效液相色譜分析。在蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間處，表達(dá)夏側(cè)金盞花蝦青素合成酶的材料有一明顯色譜峰，表達(dá)雨生紅球藻蝦青素合成酶的材料有一微弱色譜峰，而表達(dá)紅發(fā)夫酵母蝦青素合成酶的材料無明顯色譜峰（圖6）。這一結(jié)果與穩(wěn)定表達(dá)材料的愈傷及再生苗中觀察到的現(xiàn)象一致，證明夏側(cè)金盞花的蝦青素合成酶在煙草內(nèi)活性最高，雨生紅球藻的蝦青素合成酶活性次之，而紅發(fā)夫酵母的蝦青素合成酶活性未能檢出。

3 ?討 ?論

如前所述，自然界中僅數(shù)量有限的細(xì)菌、真菌、藻類和植物等有機(jī)體具有天然蝦青素的從頭合成能力[5]，不同生物的蝦青素合成酶在分子結(jié)構(gòu)及作用方式上存在極大差異[11，15-21]。本研究系統(tǒng)分析了自然界中具有蝦青素從頭合成能力的真菌、藻類和植物中的蝦青素合成酶在煙草中合成蝦青素的生物活性差異，有助于揭示不同真核生物源蝦青素合成酶在煙草中的異源表達(dá)生物活性特征，同時(shí)，可為蝦青素?zé)煵萆锓磻?yīng)器的開發(fā)提供關(guān)鍵的分子基礎(chǔ)。

通過對(duì)分別來源于夏側(cè)金盞花、雨生紅球藻和紅發(fā)夫酵母的蝦青素合成酶在煙草中瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)后的蝦青素合成活性研究，兩種試驗(yàn)結(jié)果都表明來源于夏側(cè)金盞花的蝦青素合成酶在煙草中合成蝦青素的活性最高。但僅有穩(wěn)定表達(dá)試驗(yàn)?zāi)軌騾^(qū)別來源于雨生紅球藻和紅發(fā)夫酵母的蝦青素合成酶在煙草中的蝦青素合成活性差異。這些試驗(yàn)結(jié)果在一定程度上反映出穩(wěn)定表達(dá)試驗(yàn)對(duì)不同生物源蝦青素合成酶在煙草中的生物活性檢測要比瞬時(shí)試驗(yàn)更靈敏，更準(zhǔn)確。造成瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)不易檢測低活性蝦青素合成酶生物活性的原因可能與病毒介導(dǎo)的表達(dá)方式有關(guān)，也可能與不同生物來源蝦青素合成酶在煙草中的作用方式差異有關(guān)。

盡管夏側(cè)金盞花、雨生紅球藻和紅發(fā)夫酵母3種來源的蝦青素合成酶在煙草中合成蝦青素的活性存在極大差異，但表達(dá)分析顯示這些基因都能在煙草中得到表達(dá)。推測導(dǎo)致生物活性差異的原因有兩個(gè)：一是不同來源蝦青素合成酶在煙草中的作用方式差異，二是其蛋白水平的調(diào)控差異，這在一定程度上反映出蝦青素合成酶生物活性調(diào)控的復(fù)雜性。未來的蝦青素?zé)煵萆锓磻?yīng)器研究工作不僅要加強(qiáng)適于煙草的蝦青素合成酶來源研究，同時(shí)，也要加強(qiáng)蝦青素合成酶在煙草中的生物作用機(jī)制研究，并在此基礎(chǔ)上開展蛋白水平的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，進(jìn)一步提高其在煙草內(nèi)的生物活性，以期獲得更加高效的蝦青素?zé)煵萆锓磻?yīng)器。

4 ?結(jié) ?論

通過對(duì)植物的夏側(cè)金盞花、藻類的雨生紅球藻及真菌的紅發(fā)夫酵母等3種真核生物源蝦青素合成酶在煙草中的生物活性比較研究，證明植物夏側(cè)金盞花的蝦青素合成酶在煙草中合成蝦青素的活性

最高，是蝦青素?zé)煵萆锓磻?yīng)器開發(fā)中最具潛力的真核生物源蝦青素合成酶。

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