胃復方對人胃癌BGC-823細胞移植瘤裸鼠作用及其對c-Myc、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因表達的影響

張順榮 李東芳 何寄琴

摘要 目的：觀察胃復方對人胃癌BGC-823裸鼠的抑瘤作用及c-Myc、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因表達的影響，評估胃復方作用及其可能的作用機制。方法：建立人胃癌BGC-823裸鼠模型;將成功建立的裸鼠胃癌皮下移植瘤模型的40只荷瘤鼠隨機分為5組（n=8）：模型對照組、胃復方低劑量組、胃復方高劑量組、氟尿嘧啶組、氟尿嘧啶聯(lián)合中藥組，連續(xù)給藥4周。每7天記錄腫瘤長徑、短徑，計算瘤體體積并繪制腫瘤生長曲線圖;給藥4周后處死所有荷瘤鼠，剝離皮下移植瘤，稱瘤重、計算抑瘤率;免疫組織化學法檢測瘤體組織c-Myc、hTERT蛋白表達。結(jié)果：1）胃復方對人胃癌BGC-823裸鼠移植瘤具有明顯抑制作用，各劑量間有量效關(guān)系。其中胃復方低劑量組、胃復方高劑量組、氟尿嘧啶組、氟尿嘧啶聯(lián)合中藥組的抑瘤率分別為21.06%、45.89%、30.65%、59.42%。氟尿嘧啶聯(lián)合中藥組效果最好。2）瘤重顯示與模型組比較，各藥物組瘤重均有不同程度的減輕，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;其中氟尿嘧啶聯(lián)合中藥組降低明顯。3）腫瘤生長曲線圖顯示與模型組比較，各藥物組瘤體積均有一定程度縮小，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。4）與模型組比較，藥物組均能下調(diào)c-Myc、hTERT蛋白表達量，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中氟尿嘧啶聯(lián)合中藥組下降最明顯。結(jié)論：胃復方能夠抑制人胃癌BGC-823細胞BALB/c-nu裸鼠皮下移植瘤生長，可能與下調(diào)c-Myc、hTERT蛋白表達有關(guān)，并且與氟尿嘧啶聯(lián)合用藥有增效作用。

關(guān)鍵詞 胃復方;胃癌BGC-823細胞;移植瘤;c-Myc基因;人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因

Abstract Objective：To observe tumor inhibiting effect of Weifu Formula in nude mice with human gastric cancer BGC-823 and its effects on gene expression of C-Myc and hTERT，and to evaluate the effects of Weifu Formula and its possible mechanism of action.Methods：The nude mouse model with human gastric cancer BGC-823 was established.A total of 40 tumor-bearing mice were performed successful modeling for nude mice with subcutaneous xenograft tumor of gastric cancer.They were randomly divided into 5 groups（n=8）：model group，low dose Weifu Formula group，high dose Weifu Formula group，5-Fu group，and 5-Fu combined with Chinese materia medica group，with continuous administration for 4 weeks.Long diameter and short diameter of tumor were recorded every 7 d，tumor volume was calculated and tumor growth curve chart was drawn.All the tumor-bearing mice were killed after 4 weeks of administration，and the subcutaneous xenograft tumor was resected.The tumor was weighed and tumor inhibition rate was calculated.Protein expression of C-Myc and hTERT in tumor tissue was detected by immunohistochemistry.Results：1）Weifu Formula had obvious inhibiting effect on xenograft tumor in nude mice with human gastric cancer BGC-823 and there was dose-effect relationship between different doses.The tumor inhibition rates in the low dose Weifu Formula group，the high dose Weifu Formula group，the 5-Fu group and the 5-Fu combined with Chinese materia medica group were 21.06%，45.89%，30.65% and 59.42%，respectively.Efficacy in the 5-Fu combined with Chinese materia medica group was the best.2）In terms of tumor weight compared with the model group，the tumor weight in each medicine group showed different degrees of decrease（P<0.05）.Among them，the decrease in the 5-Fu combined with Chinese materia medica group was significant.3）The tumor growth curve chart showed that the tumor volume in each medicine group was decreased to some extent compared with the model group（P<0.05）.4）In comparison with the model group，the immunohistochemical results showed that the expression levels of C-Myc and hTERT proteins were decreased in each medicine group（P<0.05），among which the decrease in the 5-Fu combined with Chinese materia medica group was the most obvious.Conclusion：Weifu Formula can inhibit the growth of subcutaneous xenograft tumor in BALB/c-nu nude mice with human gastric cancer BGC-823 cell，which may be related to the down-regulation of C-Myc and hTERT protein expression.And it has synergistic effect when combining with 5-Fu for medication，indicating that Weifu Formula has certain efficacy in human gastric cancer.

Key Words Weifu Formula; BGC-823 cell of gastric cancer; Xenograft tumor; C-Myc; hTERT

中圖分類號：R242;R735.2 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.10.016

據(jù)最新流行病學統(tǒng)計顯示，2015年我國胃癌估計發(fā)病率為679.1/10萬，估計死亡率為498.0/10萬，高居惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的第2位[1]。鑒于胃癌早期癥狀隱匿，診斷較困難，導致國內(nèi)胃癌的早期確診率低于10%[2]，就診時超過8O%的胃癌患者為進展期胃癌[3]。常規(guī)化療不良反應(yīng)大，長期治療會導致患者耐受性下降，影響臨床療效[4]。近年來國內(nèi)外研究者一直致力于靶向及中草藥治療胃癌途徑的探索，為臨床治療胃癌開辟新的思路。胃復方作為湖南省腫瘤醫(yī)院中醫(yī)科經(jīng)驗方，臨床運用治療胃癌患者取得較好療效，故探討其作用機制具有重要臨床指導意義。我們課題組在一前期體外實驗中證實胃復方有抑制胃癌細胞增殖，誘導凋亡作用[5]，本研究采用動物實驗，進一步探討胃復方的抑瘤作用及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與細胞株 BALB/c-nu裸鼠50只，4～6周齡，體質(zhì)量（18±2）g，雄性，SPF級，購自湖南省腫瘤醫(yī)院動物實驗中心[使用許可證號：SYXK（湘）2014-0016、生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2011-0003）]，飼養(yǎng)于恒溫（22～24 ℃）、恒濕（40% ～60%）、足量光照（12 h）的IVC籠具中，自由攝入標準的裸鼠飼料及蒸餾水，通過檢疫期1周后開始實驗。人胃癌BGC-823細胞株（武漢博士德公司）。

1.1.2 藥物 胃復方主要組成有黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、香附、郁金、蘇木、莪術(shù)、蚤休、半枝蓮、女貞子、菟絲子、白花蛇舌草等。所有生藥購自湖南省腫瘤醫(yī)院中藥房，并經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學藥學院教研室鑒定并制成含生藥濃度為1.3 g/mL的湯劑，灌裝滅菌后置于4 ℃冰箱中備用。

1.1.3 試劑與儀器 尿嘧啶注射液（上海旭東海普藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號H31020593），RPMI-1640培養(yǎng)基、FBS、胰蛋白酶（Hyclone公司）;二步法試劑盒、DAB試劑盒（中衫金橋）、中性樹膠（Sigma）;蘇木素、磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）、枸櫞酸鹽緩沖液（Wellbio）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1）分組：篩選瘤體積均一的成瘤裸鼠40只，按隨機數(shù)字表隨機分為模型對照組、胃復方低、高劑量組、氟尿嘧啶組、氟尿嘧啶聯(lián)合中藥組，每組8只。2）細胞培養(yǎng)：將人胃癌BGC-823細胞復蘇后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，于飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37 ℃，5%CO2）。2～3 d更換培養(yǎng)液，按1：2進行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞（2×107/L濃度細胞懸液）用于實驗。3）肺癌皮下移植瘤模型建立：裸鼠皮下接種在超凈工作臺內(nèi)進行，將配置好的濃度為2×107個/mL的人胃癌BGC-823單細胞懸液以0.2 mL/只接種于4只裸鼠右側(cè)腋窩皮下。裸鼠接種后每天觀察，取2只皮下游標卡尺可測長徑約1.5 cm且腫瘤生長良好的荷瘤鼠。予以10%水合氯醛麻醉后斷髓安樂死，剝離瘤塊，制備成1 mm3左右小塊，作鼠間傳代至第3代（2只/代）。然后用套針將腫瘤組織接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下，建立移植瘤模型。接種后觀察腫瘤生長情況，約7 d，再按荷瘤鼠精神狀態(tài)及瘤體積大小進行篩選，精神狀態(tài)差、瘤體積過大及未成瘤者不予入選。

1.2.2 給藥方法 根據(jù)人與小鼠體表面積換算法，小鼠生藥劑量為0.52 g（臨床劑量）作為高劑量組，低劑量組為0.26 g。模型組予以生理鹽水灌胃，0.2 mL/次，2次/d，5次/周，并與生理鹽水腹腔注射，0.2 mL/次，2次/周，連續(xù)4周。低、高劑量組分別以胃復方0.26 g/20 g、0.52 g/20 g灌胃，并與生理鹽水腹腔注射;氟尿嘧啶組腸以生理鹽水灌胃，并給予氟尿嘧啶20 mg/kg腹腔注射;氟尿嘧啶聯(lián)合中藥組予以胃復方0.52 g/20 g灌胃，并予以氟尿嘧啶20 mg/kg腹腔注射，以上給藥方法及時間均同前。

1.2.3 檢測指標與方法 荷瘤鼠的一般情況觀察：每日上午9點和下午4點觀察荷瘤鼠的飲食、精神狀態(tài)、活動度、反應(yīng)度、皮膚及二便情況。同時每隔7 d稱量荷瘤鼠體質(zhì)量觀察體質(zhì)量變化。

荷瘤鼠瘤體積的測定：實驗過程中，每隔7 d測一次裸鼠瘤體的長徑（a）、短徑（b），計算腫瘤體積（V），繪制腫瘤生長變化曲線圖。腫瘤體積具體計算公式：V=1/2ab2。

測量瘤體質(zhì)量及計算抑瘤率：末次用藥24 h后對荷瘤鼠實施安樂死，無菌環(huán)境剝離瘤體，稱量瘤質(zhì)量。計算抑瘤率IRTW，計算公式為IRTW=（W生理鹽水組-W給藥組）/W生理鹽水組×100%。

免疫組織化學SP法檢測各組荷瘤鼠C-Myc、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因的表達，具體步驟按試劑盒說明進行，樣本用10%中性甲醛固定過夜，石蠟包埋、切片，切片常規(guī)脫蠟和水化，滴加山羊血清封閉，室溫孵育20 min，傾去。滴加一抗，稀釋c-Myc或 hTERT單克隆抗體，4 ℃過夜。滴加生物素化二抗，37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片鏡檢。判定標準：鏡下觀察細胞核（或胞質(zhì)）內(nèi)出現(xiàn)深淺不一的棕色顆粒的細胞為陽性細胞。普通電腦采像;采用IPP（Image-Pro-Plus）軟件分析，目標觀測值為平均IOD[視野下的陽性表達部位的累積吸光度和視野下樣品面積的比值（針對400倍視野的圖）]。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行實驗數(shù)據(jù)處理，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 荷瘤鼠一般情況觀察 干預(yù)前，選取接種7 d后體質(zhì)量及瘤體體積比較無明顯差異的荷瘤鼠隨機分組，保證各組基線水平一致，具有可比性。干預(yù)后觀察荷瘤鼠，模型組荷瘤鼠精神稍差、皮膚褶皺、活動欠佳，明顯消瘦。用藥組荷瘤鼠，精神狀態(tài)、飲食、飲水、二便、皮膚及活動均良好，體質(zhì)量雖有不同程度下降，但較模型組維持較好。整個實驗過程未出現(xiàn)荷瘤鼠死亡，后期各組均有1只或者2只荷瘤鼠瘤體輕度破潰，但不影響瘤體體積。

2.2 藥物干預(yù)對荷瘤鼠瘤體積變化的影響 依據(jù)腫瘤生長曲線可看出，藥物干預(yù)2周內(nèi)，腫瘤生長速度相當，之后腫瘤生長出現(xiàn)不同趨勢，其中模型對照組瘤體體積增長速度最快，其次是胃復方低劑量組、氟尿嘧啶組、高劑量組、氟尿嘧啶聯(lián)合中藥組。見圖1;接種35 d（灌胃28 d）與模型組比較，各藥物組瘤體積均有不同程度縮小，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），氟尿嘧啶組與氟尿嘧啶聯(lián)合中藥組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.3 藥物干預(yù)對荷瘤鼠瘤體質(zhì)量及抑制率的影響 ?各藥物組與模型組比較，平均瘤重有一定程度減輕，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），氟尿嘧啶組與氟尿嘧啶聯(lián)合中藥組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中瘤重大小按順序排列：模型組>胃復方低劑量組>氟尿嘧啶組>胃復方高劑量組>氟尿嘧啶聯(lián)合中藥組;抑瘤率方面，氟尿嘧啶聯(lián)合中藥組>胃復方高劑量組>氟尿嘧啶組>胃復方低劑量組。見表2，圖2。

2.4 藥物干預(yù)后各組荷瘤鼠C-Myc、hTERT蛋白的表達 鏡下觀察c-Myc蛋白表達產(chǎn)物呈棕黃色或者淡黃色顆粒定位于細胞質(zhì)中;hTERT蛋白呈棕黃色或淡黃色顆粒定位于細胞質(zhì)或細胞核中。見圖3。與模型對照組比較，胃復方低劑量組、胃復方高劑量組、氟尿嘧啶組、氟尿嘧啶聯(lián)合中藥組c-Myc、hTERT蛋白表達的IOD值均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;氟尿嘧啶聯(lián)合中藥組與氟尿嘧啶組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;按IOD值得大小排列順序為模型對照組>胃復方低劑量組>氟尿嘧啶組>胃復方高劑量組>氟尿嘧啶聯(lián)合中藥組。藥物組能下調(diào)C-Myc、hTERT蛋白表達，以氟尿嘧啶聯(lián)合中藥組降低最明顯。見表3。

3 討論

胃癌是常見惡性消化道腫瘤之一，其早期診斷率低，大部分錯失最佳手術(shù)時機，加之Ⅱ期以上術(shù)后患者復發(fā)率高，總生存率未有明顯突破[6]，需要尋找新的臨床解決思路。而中藥在改善患者臨床癥狀、延長生存期、提高生命質(zhì)量等方面具有獨到優(yōu)勢[7]。胃復方為湖南省腫瘤醫(yī)院中醫(yī)科經(jīng)驗方，經(jīng)過30余年的臨床實踐，其對胃癌患者具有較好的臨床療效[8-9]，本課題組前期也研究證實胃復方含藥血漿能抑制胃癌SGC-7901細胞增殖，誘導凋亡。對其抗癌機制進一步探索，為臨床提供理論依據(jù)具有重大意義。

本研究建立人胃癌BGC-823細胞BALB/c-nu裸鼠移植瘤模型，通過藥物干預(yù)后觀察荷瘤鼠一般情況及瘤體體積的變化，結(jié)合免疫組織化學檢測瘤體組織c-Myc、hTERT基因表達水平，探索胃復方對人胃癌抑制作用的可能機制。實驗結(jié)果表明，瘤重方面，與模型對照組比較，藥物組荷瘤鼠的瘤重均有不同程度降低，組間差異有統(tǒng)計學意義;抑瘤率按大小順序排列：氟尿嘧啶聯(lián)合中藥組>胃復方高劑量組>氟尿嘧啶組>胃復方低劑量組;依據(jù)腫瘤生長曲線圖，我們發(fā)現(xiàn)胃復方組的瘤體體積小于模型對照組，并隨著濃度的增加，腫瘤抑瘤率也隨之提高，組間比較差異有統(tǒng)計學意義，胃復方高劑量組與氟尿嘧啶組及聯(lián)合組的瘤體體積比較，差異無統(tǒng)計學意義，其中氟尿嘧啶聯(lián)合中藥組的瘤體積明顯減小，說明胃復方在體內(nèi)能夠抑制人胃癌細胞的生長，且呈劑量依賴性。免疫組織化學結(jié)果表明與模型對照組比較，藥物組均能夠下調(diào)c-Myc、hTERT基因表達，以氟尿嘧啶聯(lián)合中藥組下調(diào)最明顯，說明胃復方的抑瘤作用可能與下調(diào)c-Myc、hTERT基因表達有關(guān)，胃復方對氟尿嘧啶有增效作用。

c-Myc是由原癌基因myc編碼的一種轉(zhuǎn)錄因子，既能促進細胞增殖，又能促進細胞凋亡，是多個細胞信號通路的靶基因。在體內(nèi)外實驗中發(fā)現(xiàn)，下調(diào)c-Myc蛋白表達可抑制胃癌增殖，誘導凋亡[10-14]。c-Myc還可調(diào)控端粒酶活性，其水平升高將誘導端粒酶的活化進而導致腫瘤的發(fā)生[15]，而hTERT是端粒酶催化亞單位，其表達與端粒酶活性相平行，是端粒酶活性的決定因素。研究發(fā)現(xiàn)，hTERT的異常表達與多種腫瘤密切相關(guān)[16]。研究發(fā)現(xiàn)，hTERT mRNA及蛋白在胃癌組織及癌旁組織中高表達[17-19]，說明其與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，hTERT可能通過提高FOXO3a泛素化和上調(diào)ITGB1即hTERT/MDM2-FOXO3a-ITGB1細胞信號通路的調(diào)控抑制胃癌細胞增殖及侵襲[20]。說明c-Myc及hTERT基因表達水平可以預(yù)測治療胃癌的療效及預(yù)后指標。本研究發(fā)現(xiàn)，胃復方干預(yù)后有抑瘤作用，呈劑量依賴性，聯(lián)合氟尿嘧啶后，其抑制作用明顯得到增強，與模型對照組比較下調(diào)C-Myc、hTERT基因表達，推測機制可能與其下調(diào)c-Myc、hTERT基因表達，調(diào)控相關(guān)腫瘤細胞通路有關(guān)，有待進一步探索。

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（2018-10-16收稿 責任編輯：楊覺雄）