甘藍(lán)冷脅迫相關(guān)基因BobHLH18克隆與表達(dá)分析

秦文斌 戴忠良 山溪 唐君 王神云 李建斌

冷脅迫是影響作物生長、發(fā)育和產(chǎn)量的重要非生物脅迫因子之一。已有研究者指出，轉(zhuǎn)錄因子作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)在植物應(yīng)答冷脅迫過程中起重要作用。轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)構(gòu)上通常具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄調(diào)控域及核定位信號區(qū)等功能域，其中DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域決定著轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件結(jié)合的特異性，使其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。bHLH轉(zhuǎn)錄因子作為一類重要的植物逆境相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白，因其在結(jié)構(gòu)上含有1個由10-15個氨基酸的氨基酸-基本區(qū)和40個氨基酸左右的α-螺旋環(huán)α-螺旋區(qū)（HIM區(qū)）構(gòu)成的50-60個氨基酸組成的bHLH保守結(jié)構(gòu)域而得名。其中，基本區(qū)域位于bHLH結(jié)構(gòu)域的N-端，具有DNA識別和結(jié)合順式元件的功能。近年來隨著多個植物基因組的測序完成，大量的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員已被鑒定，在擬南芥和水稻中bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族分別有超過140個和160個成員，而在煙草、二柄短麥草、白菜和番茄中則分別含有190、146、230和159個bHLH成員。

甘藍(lán)（Brassica oleracea var.capitata L.）是中國一種重要的蕓薹屬蔬菜，全國各地均有栽培。隨著近年來甘藍(lán)種植區(qū)的擴(kuò)大，尤其露地越冬甘藍(lán)品種的大面積推廣，生產(chǎn)上對耐低溫的品種需求逐漸提高。而目前對甘藍(lán)耐寒材料篩選多依賴于田間自然低溫條件下的人工篩選，易受環(huán)境干擾，選擇效率不高，因而開展耐寒基因鑒定及利用與耐寒基因緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，是提高甘藍(lán)耐寒育種效率的重要手段。目前，在模式植物擬南芥上已有多個與耐寒性相關(guān)的基因被鑒定，如bHLH類的ICEl基因、AP2/DREB類的CBFl/CBF2/CBF3基因、COR基因、bZIP類RISBZ5、HOSl基因等。且已有研究結(jié)果表明，擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子具有廣泛的生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)種子萌發(fā)，表皮細(xì)胞形成，心皮發(fā)育，花藥發(fā)育，果實(shí)開裂，黃酮類及花青素生物合成及響應(yīng)光敏色素，激素信號，脅迫誘導(dǎo)等過程。

甘藍(lán)Y923為重組自交系，具有耐寒，抽薹遲等特性，目前該材料已進(jìn)行了三代基因組測序，以其為研究對象鑒定耐寒相關(guān)基因，能為后續(xù)整合其基因組信息解析甘藍(lán)耐寒機(jī)制奠定前期基礎(chǔ)。為探討bHLH轉(zhuǎn)錄因子在甘藍(lán)耐寒方面的功能，本研究利用同源克隆方法，設(shè)計(jì)甘藍(lán)類bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因的特異擴(kuò)增引物，結(jié)合RT-PCR技術(shù)在甘藍(lán)Y923冷處理全長cDNA文庫中，獲得一個受冷脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因，并根據(jù)其與擬南芥bHLH基因的同源性，將其命名為BobHLHl8。本研究對該基因在甘藍(lán)中的序列特征、基因結(jié)構(gòu)、染色體定位及其在冷脅迫下的時空表達(dá)模式進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步研究該基因功能提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

用于轉(zhuǎn)錄因子克隆的甘藍(lán)冷脅迫全長cDNA文庫由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建?；蛐蛄锌寺『屠涿{迫處理所用的甘藍(lán)材料為結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleracea var.cap-itata）自交系Y923。選“四葉一心”期用1/2MS培養(yǎng)液在培養(yǎng)室水培7 d的甘藍(lán)幼苗，轉(zhuǎn)入4℃的低溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行冷脅迫處理，以培養(yǎng)室正常生長的植株為對照，分別在Oh、6 h、12 h、24 h和48 h時收集處理甘藍(lán)和對照植株的根、莖、葉，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 BobHLHl8基因全長序列的克隆

以T1和T2（表1）為引物，對篩選到的bHLHl8全長eDNA克隆進(jìn)行雙向測序，通過DNAMAN軟件對序列進(jìn)行拼接組裝，得到一致序列后提交NCBI進(jìn)行ORF的預(yù)測。根據(jù)bHLHl8的eDNA序列設(shè)計(jì)引物，在甘藍(lán)gDNA中和eDNA中擴(kuò)增bHLHl8基因，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收并克隆到pMDl8-T載體上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.3 BobHLHl8基因染色體定位

通過搜索蕓薹屬基因組數(shù)據(jù)庫Brassica database（BRAD;http：//brassieadb.org/brad/）中與BobHLHl8基因序列完全相同的基因座序列及其基因組位置信息，對BobHLHl8進(jìn)行電子定位及拷貝數(shù)分析。

1.4 BobHLHl8基因序列分析

利用DNAMAN和ORF Finder在線軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸同源序列比對和開放閱讀框預(yù)測。利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de）在線工具對bHLH進(jìn)行保守域預(yù)測。用EXPASy在線工具Prot-Param（http：//www.expasy，org/tools/protparam.html）進(jìn)行蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)計(jì)算。用PSORT（http：//psort.ims.u-tokyo.ac.jp/）在線工具進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定.位預(yù)測。同時，以BobHLHl8蛋白質(zhì)氨基酸序列作為母序列，在GenBank中搜索其他物種中與該基因同源的序列，并通過MEGA軟件進(jìn)行進(jìn)化分析。