鎮(zhèn)驚溫膽湯藥物指紋圖譜研究及對PTSD大鼠行為學(xué)影響的實驗觀察

孫天石 高妍 李衛(wèi)紅

摘要 目的：通過SPS模型建立大鼠PTSD模型，研究鎮(zhèn)驚溫膽湯對SPS模型大鼠的影響。方法：將40只大鼠隨機分為正常組、模型組、鎮(zhèn)驚溫膽湯組和帕羅西汀組，后3組給予SPS造模，之后連續(xù)灌胃7 d。結(jié)束后檢測曠場實驗和僵立行為測試。結(jié)果：與模型組比較鎮(zhèn)驚溫膽湯、帕羅西汀組，在大鼠運動總距離，最大運動距離，穿格次數(shù)等多個指標(biāo)上都出現(xiàn)了明顯的區(qū)別，尤其是在僵立時間方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），其中鎮(zhèn)驚溫膽湯對大鼠產(chǎn)生了顯著的作用，使得該組在最長運動距離，直立次數(shù)，單次最大運動距離等多個指標(biāo)（P<0.01），作用優(yōu)于帕羅西汀組，但在大鼠僵立時間方面與帕羅西汀組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：本實驗成功通過單次延長應(yīng)激復(fù)了創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠模型，鎮(zhèn)驚溫膽湯使得SPS模型焦慮和恐懼狀態(tài)得到改善。

關(guān)鍵詞 鎮(zhèn)驚溫膽湯;創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙;單次延長應(yīng)激;曠場試驗;僵立行為;超高效液相色譜;帕羅西汀;氣機

Abstract Objective：To establish a rat model of post-traumatic stress disorder（PTSD）through single-prolonged stress（SPS）and to observe the effect of Zhenjing Wendan Decoction on the behavior of the SPS model rats.Methods：A total of 40 rats were randomly divided into a normal group，a model group，a Zhenjing Wendan Decoction group and a Paroxetine group.The rats in the last 3 groups were modeled by SPS.And then the rags were receiving gavage for 7 days.After that，Open Field Test and Freezing Time Test were performed.Results：Compared with the model group，all groups except the normal group had significant differences in several indicators，such as the total distance of movement，maximum distance of movement and the number of grid penetration，especially in freezing time（P<0.05）.Among them，Zhenjing Wendan Decoction had significant difference，making the indicators of maximum distance of movement，erect times，and single movement distance better than the Paroxetine group，but there was no significant difference in freezing time.Conclusion：This study succeeded repairing PTSD model rats through SPS.Zhenjin Wendan improved the anxiety and fear state of SPS model.

Key Words Zhenjing Wendan Decoction; Post-traumatic stress disorder; Single-prolonged stress; Open Field Test; Freezing Time; Ultra Performance Liquid Chromatography; Paroxetine; Qi movement

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.10.015

近年來因為生活條件的改良人門越來越注意到心理疾病對人類的危害，而隨著各種自然災(zāi)害和日常突發(fā)事件的頻繁發(fā)生，幸存者常會出創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（Post-traumatic Stress Disorder，PTSD），這也引起了人們對此疾病的關(guān)注[1]。鎮(zhèn)驚溫膽湯是由主治“心膽虛怯，觸事易驚”的溫膽湯與《四圣心源》治“驚悸之證，土濕胃逆，相火不藏”之金鼎湯二方相合而成。二者立方之意皆為從膽論治。鎮(zhèn)驚溫膽湯組方為清半夏6 g、生牡蠣9 g、竹茹6 g、生龍骨6 g、陳皮9 g、白芍9 g、枳實6 g、炙甘草3 g、茯苓4.5 g、桂枝9 g、生姜5片（8 g）、大棗1枚（3 g）。在臨床使用中鎮(zhèn)驚溫膽湯對于PTSD等情志疾病取得了一定的療效，但鮮有其對行為學(xué)影響的報道。本試驗采用超高效液相色譜（Ultra-high Performance Liquid Chromatography，UPLC）法建立鎮(zhèn)驚溫膽湯指紋圖譜，為該方的穩(wěn)定性提供科學(xué)依據(jù)。同時，以西藥帕羅西汀為對照，探究鎮(zhèn)驚溫膽湯對應(yīng)用單次延長應(yīng)激造模后對大鼠在行為學(xué)方面的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雄性大鼠40只，平均體質(zhì)量（170±10）g，為確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，本次參加實驗的大鼠均選購于維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SYXK（京）2006-0012]，所有大鼠均飼養(yǎng)于清潔級動物房中，生活環(huán)境溫度為：22.0～24.0 ℃，40 W日光燈照射，光照節(jié)律12L：12D（8：00-20：00），相對濕度：60% ～70%。試驗期內(nèi)飼喂大鼠維持飼料，自由飲水。565BAB24-E58C-4B62-BC45-301E26F8074C

1.1.2 藥物 帕羅西?。ㄕ憬夥逅帢I(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20040533）;鎮(zhèn)驚溫膽湯中藥分為3次購買于北京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院東方醫(yī)院，浸膏加工則委托北京創(chuàng)立科創(chuàng)醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限公司完成。

1.1.3 試劑與儀器 超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司，型號KQ250DB）;超高效液相色譜系統(tǒng)（美國Waters公司，型號LC-2030，包含超高壓溶劑系統(tǒng)和二極管陣列檢測器、Empower 3色譜工作站、自動進(jìn)樣恒溫樣本管理器）;電子天平（上海卓精電子科技有限公司，型號BSM 220.4）;甲酸（色譜純、德國CNW公司，批號CAS 64-18-6）;大鼠固定裝置（北京中醫(yī)藥大學(xué)方劑教研室自制）;大鼠運動行為分析系統(tǒng)（荷蘭Nodule公司引進(jìn)，包含先進(jìn)的數(shù)學(xué)計算軟件，電子設(shè)備，監(jiān)控系統(tǒng)等，型號Ethevision）;水箱（安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司，鑒于本實驗的需要，選擇正方形的水箱，型號ZH-CSC）;曠場箱（自制）;小型水泵（成都新為誠科技有限公司，型號CSP24120）;加熱器（安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司，型號ZH-CSC）;溫度計（常州市希雅儀表有限公司，型號XY003）;娃哈哈純凈水（吉林娃哈哈食品有限公司，生產(chǎn)許可證號SC10621011400578）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 大鼠購買回來后先飼養(yǎng)1周，按照隨機數(shù)字表法隨機分為4組。即正常組、模型組、鎮(zhèn)驚溫膽湯組和西藥對照帕羅西汀組，目前PTSD的造模方法有電擊模型（Electric Shocks Model）、捕食場景應(yīng)激模型（Predator Scent Stress，PSS）、連續(xù)單一應(yīng)激（Single-prolonged Stress，SPS）等[2]，本研究采用國際公認(rèn)的SPS方法建立PTSD大鼠模型[3]，首先緊密束縛實驗鼠2 h，隨后強迫其在水中游泳20 min（水深45 cm以上保證老鼠尾部不會接觸到箱底），之后將實驗鼠撈出，經(jīng)過15 min休息后，使用乙醚罐將大鼠進(jìn)行乙醚麻醉，使其進(jìn)入昏迷狀態(tài)，造模至此結(jié)束。

1.2.2 給藥方法 造模完成后，各組大鼠每天早上8：00開始給藥，給藥方式為灌胃，持續(xù)7 d。所有藥物使用前以蒸餾水配成所需濃度的混溶液，給藥量則需經(jīng)過精準(zhǔn)的計算，一般是按照人的用量的6倍進(jìn)行換算。鎮(zhèn)驚溫膽湯組：按照大鼠的實際重量計算給藥量，一般來說，灌注37.5 g/kg的震驚溫膽湯;帕羅西汀組：按照大鼠的實際體質(zhì)量計算給藥量，一般來說，灌注20 mg/kg的帕羅西汀;正常組、模型組：按照等同上述2組的蒸餾水灌胃處理。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 鎮(zhèn)驚溫膽湯指紋圖譜制備 1）色譜條件的確定：采用Waters Cortecs UPLC C18柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）。常規(guī)流速0.4 L/min，柱溫為35 ℃。著重選擇流動相及測試波長。2）流動相的選擇：比較了甲醇-水、乙腈-水和乙腈-0.5%甲酸水3種梯度洗脫系統(tǒng)。結(jié)果表明乙腈-0.5%甲酸水的梯度洗脫分離效果最好，23 min內(nèi)出峰完全。見圖1。以乙腈（B）-0.5%甲酸水（A）為流動相，洗脫梯度（以B相濃度表示）。見表1。3）檢測波長的選擇：首先針對鎮(zhèn)驚溫膽湯浸膏在190～330 nm進(jìn)行紫外波長測試，著重觀察出峰情況，發(fā)現(xiàn)在257 nm、283 nm和327 nm時出峰較多，分析后發(fā)現(xiàn)在327 nm下出峰較多，各峰比例合適峰形良好，分離度佳，因此選擇以327 nm作為檢測波長進(jìn)行后續(xù)檢測。4）提取溶劑的選擇：浸膏的有效成分包含了水溶性成分和脂溶性成分，為了讓其均能被有效的提出，查詢文獻(xiàn)后采用75%甲醇對浸膏進(jìn)行稀釋，并且為了避免產(chǎn)生偏移，提取各單味藥材時也同樣選用75%甲醇作為提取溶劑。5）稀釋倍數(shù)的選擇：人工選擇將浸膏稀釋5倍、10倍、20倍和50倍后觀察，稀釋50倍時濃度最為適宜，各峰出峰良好，波形佳，所以在后續(xù)檢測中將稀釋倍數(shù)定為50倍。6）供試藥物溶液的配備：在50 mL容量瓶中加入1 mL鎮(zhèn)驚溫膽湯浸膏后再用甲醇定容，為確保鎮(zhèn)驚溫膽湯的檢測效果，本實驗選擇濃度為75%的甲醇溶液，經(jīng)過超聲波處理后放在室內(nèi)靜置，待容量瓶中析出沉淀，再用吸管將上層清液吸出，用0.22 μm微孔濾膜過濾，去除初始過濾液，繼續(xù)過濾液至液相進(jìn)樣瓶中即得。

1.2.3.2 指紋圖譜穩(wěn)定性根據(jù)UPLC 圖譜分析色譜峰的出峰時間及峰面積是否一致。

1.2.3.3 曠場試驗（Open Field Test，OFT）于實驗開始前，先對被測試大鼠進(jìn)行3 d的行為學(xué)訓(xùn)練后進(jìn)行正式實驗。正式試驗前將大鼠放入實驗室中，讓大鼠有一個過渡的適應(yīng)期，15 min后，啟動大鼠行為分析系統(tǒng)，對箱內(nèi)的大鼠進(jìn)行攝像，工作人員需穿著深色衣服，進(jìn)入實驗室內(nèi)抓住大鼠的尾部，并將其迅速放入曠場箱。整個過程中不應(yīng)發(fā)出聲音及隨意運動，以減少聲音和光線的影響，進(jìn)行觀察的同時要記下大鼠的運動數(shù)據(jù)，包括大鼠的直立次數(shù)，運動情況等，若大鼠出現(xiàn)長時間靜止行為則應(yīng)額外標(biāo)注。5 min后取出大鼠，并用乙醇清潔曠場箱擦除大鼠遺留的大小便，防止實驗動物在曠場箱內(nèi)留下自身的特征信息，以避免對之后的試驗產(chǎn)生干擾，對大鼠穿格次數(shù)進(jìn)行詳細(xì)的觀察和記錄。

1.2.3.4 僵立行為（Freezing Time）實驗 開始前，首先把被測大鼠放入行為學(xué)室內(nèi)適應(yīng)15 min左右，隨后調(diào)整燈光到水面反光狀態(tài)消除。隨后，工作人員需穿著深色衣服，抓住大鼠的尾部，迅速將其放置到水箱中，使大鼠盡快進(jìn)入游泳狀態(tài)，并觀察大鼠在5 min內(nèi)的行為，記錄下大鼠進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)的時間，用行為分析系統(tǒng)分析大鼠的行為。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，為了清楚描述數(shù)據(jù)間的關(guān)系，本文采用均值，方差，標(biāo)準(zhǔn)差等多個指標(biāo)，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析的統(tǒng)計方法，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)則使用非參數(shù)檢驗的統(tǒng)計方法進(jìn)行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。565BAB24-E58C-4B62-BC45-301E26F8074C