加味丹參飲作用內(nèi)源性H2S合成途徑保護(hù)心肌缺血/再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究

陳聰 成細(xì)華 任婷 吳若霞 周暢 袁夢(mèng) 廖菁 蔡雄

〔摘要〕 目的 通過(guò)觀察益氣活血中藥組方加味丹參飲（JWDS）對(duì)心肌缺血/再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury， MIRI）模型大鼠血清硫化氫（H2S）合成酶/胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyse， CSE）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzymes， CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， DH）含量、心肌組織超微結(jié)構(gòu)、心肌組織CSE mRNA表達(dá)的影響，從內(nèi)源性H2S合成途徑探討JWDS治療MIRI的作用機(jī)制。方法 給藥組大鼠按劑量6.19 g/（kg·d）要求給藥14 d，末次給藥2 h后采用結(jié)扎冠脈左前降支/再灌流方法復(fù)制MIRI模型。HE染色觀察心肌組織機(jī)構(gòu)改變情況;ELISA法檢測(cè)血清CK、LDH、CSE含量;Western-blot檢測(cè)心肌組織CSE蛋白表達(dá);Real-time PCR檢測(cè)心肌組織CSE mRNA表達(dá)。結(jié)果 JWDS可明顯改善MIRI模型大鼠心肌組織病理改變，降低血清LDH、CK含量（P<0.01），升高CSE含量（P<0.01），上調(diào)心肌組織CSE及mRNA表達(dá)（P<0.05，P<0.01）。PPG可明顯降低JWDS組大鼠血清CSE含量（P<0.01），下調(diào)心肌CSE mRNA表達(dá)（P<0.01）。結(jié)論 JWDS對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌缺血/再灌注（MIR）大鼠心肌損傷具有明顯保護(hù)作用，其機(jī)制與促進(jìn)內(nèi)源性H2S生成從而保護(hù)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，抑制CK、LDH漏出，上調(diào)心肌組織CSE蛋白及mRNA表達(dá)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 心肌缺血再灌注;加味丹參飲;益氣活血; H2S;CSE

〔中圖分類號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.10.003

Experimental Study on Effects of Jiawei Danshen Decoction on Endogenous H2S Synthesis

Pathway to Protect Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury

CHEN Cong1，2， CHENG Xihua1， REN Ting1， WU Ruoxia1， ZHOU Chang1， YUAN Meng1， LIAO Jing1*， CAI Xiong2*

（1. School of Chinese Medicine， Hunan University of Chinese medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. State Key Laboratory Breeding Base of Chinese Materia Medica Powder and Innovative Medicine Co-founded by Hunan Province

and Ministry of Science and Technology， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To observe effects of a prescription for strengthening Qi and promoting blood-Jiawei Danshen Decoction （JWDS） on serum contents of H2S synthetase/cystathionine-γ-lyase （CSE）， creatine kinase isoenzyme （CK） and lactate dehydrogenase （LDH）， myocardial tissue ultrastructure， and CSE mRNA expression in myocardial tissue of model rats with myocardial ischemia reperfusion injury （MIRI）， so as to explore the mechanism of JWDS in treating MIRI through synthesis pathway of endogenous H2S. Methods Rats in medication group were given medicine 6.19 g/（kg·d） for 14 d， and 2 h after the last medication， the MIRI model was replicated by ligation of left anterior descending coronary artery/reperfusion method. Ultrastructural changes of myocardial tissue were observed by HE staining. The contents of serum CK， LDH and CSE were detected by ELISA method. The expression of CSE protein in myocardial tissue was detected by Western-blot. The expression of CSE mRNA in myocardial tissue was detected by Real-time PCR. Results JWDS significantly improved pathological changes of myocardial tissue in model rats with MIRI， decreased serum LDH and CK contents （P<0.01）， increased CSE content （P<0.01）， and up-regulated CSE and mRNA expression in myocardial tissue （P<0.05， P<0.01）. PPG significantly decreased serum CSE content in rats of the JWDS group （P<0.01）， and down-regulated CSE mRNA expression in myocardial tissue （P<0.01）. Conclusion JWDS demonstrates significant protective effect on myocardial injury in experimental MIRI model rats， which is associated with promoting endogenous H2S generation to protect myocardial cell structure， inhibit CK and LDH leakage， and up-regulate CSE protein and mRNA expression in myocardial tissue.

〔Keywords〕 myocardial ischemia reperfusion; Jiawei Danshen Decoction; strengthening Qi and promoting blood; H2S; CSE

心肌缺血/再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury， MIRI）是指心肌缺血后冠狀動(dòng)脈再通，恢復(fù)供血后導(dǎo)致的復(fù)雜心肌損傷反應(yīng)，是導(dǎo)致溶栓治療、心臟移植及冠脈搭橋等治療手段失敗的主要原因[1-4]。MIRI可導(dǎo)致包括再灌注性心律失常、心肌頓抑、血液無(wú)復(fù)流、微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及微循環(huán)障礙等在內(nèi)的一系列功能、結(jié)構(gòu)、代謝方面的損傷，臨床治療心血管疾病應(yīng)盡量避免MIRI帶來(lái)的負(fù)面作用，對(duì)MIRI的臨床表現(xiàn)、發(fā)病機(jī)制以及防治途徑的研究具有重要意義[5-6]。硫化氫（H2S）是一種類似于一氧化氮（NO）、一氧化碳（CO）的內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，主要由胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyse， CSE）催化底物L(fēng)-半胱氨酸生成[7]。研究發(fā)現(xiàn)H2S可自由穿過(guò)細(xì)胞膜，是細(xì)胞防御的內(nèi)源性機(jī)制，外源性H2S干預(yù)對(duì)離體心臟缺血預(yù)處理具有明顯的保護(hù)作用[8]。

加味丹參飲（JWDS）是跟據(jù)大量臨床經(jīng)驗(yàn)，從《時(shí)方歌括》丹參飲化裁而來(lái)，由黃芪、丹參、檀香、川芎、赤芍等組成，全方共奏益氣活血之功，在臨床上對(duì)防治冠心病心絞痛有很好的療效。部分研究證實(shí)該方可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡、抗炎等有效途徑的減輕心肌缺血再灌注損傷。但其多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)作用的確切機(jī)制還未完全闡明。為探究是否通過(guò)內(nèi)源性H2S調(diào)節(jié)通路對(duì)MIRI發(fā)揮治療作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察加味丹參飲JWDS對(duì)MIRI模型大鼠心肌組織細(xì)胞形態(tài)、血清合成酶/胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyse， CSE）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzymes， CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， DH）含量、心肌組織CSE及mRNA表達(dá)的影響，以及H2S合成酶抑制劑PPG對(duì)JWDS治療效果的影響，進(jìn)一步闡釋JWDS保護(hù)MIRI的作用機(jī)制。

1 材料

1.1? 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（湘）2014-0008。

1.2? 主要藥物與試劑

加味丹參飲（由丹參、檀香、赤芍、川芎、當(dāng)歸、紅花、生地黃、黃芪等組成），湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供;LDH、CK、CSE ELISA試劑盒均購(gòu)于武漢基因美生物，批號(hào)201804;硫氫化鈉（NaHS），美國(guó)Sigma公司;RIPA（強(qiáng)）組織細(xì)胞快速裂解液（批號(hào)PAB180006）、Goat-anti-rabbit IgG二抗（批號(hào)PAB150011）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)PAB180007）均購(gòu)于BIOSWAMP公司;Anti-rabbit CSE抗體（批號(hào)Ab80643）、Anti-rabbit抗β-Actin抗體（批號(hào)Ab8227）均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司;Trizol試劑（批號(hào)15596026），ambion公司;YBR Green PCR試劑盒（批號(hào)KM4101），KAPA Biosystems公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)639505），TAKARA公司。

1.3? 儀器

小動(dòng)物呼吸機(jī)（DW-3000，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）;FX-211小動(dòng)物心電圖機(jī)（北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司）;MK3型酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃）;AC8型自動(dòng)洗板機(jī)（Thermo公司）;TG16W型微量高速離心機(jī)（湖南湘儀）;GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏）;mini protean 3 cell型電泳儀、Real-time PCR、Universal Hood Ⅱ型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD）;K30型干式恒溫器（杭州爽盛儀器）;Centriguge 5424 R型離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf）;Tanon-5200型ECL分析儀（上海天能）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? 分組與給藥

取SD大鼠70只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、MIRI模型組（MIRI組）、缺血預(yù)適應(yīng)組（IP組）、NaHS+MIRI組（NaHS組）、加味丹參飲+MIRI組（JWDS組）、加味丹參飲+PPG+MIRI組（JWDS+PPG組），每組10只。JWDS組與JWDS+PPG組每日以加味丹參飲（6.19 g/kg）灌胃，JWDS+PPG組于再灌注前30 min以CSE合成酶抑制劑PPG（33.9 mg/kg）腹腔注射干預(yù)，NaHS組以28 μmol/kg NaHS腹腔注射，空白組、假手術(shù)組、MIRI、IP組以等量生理鹽水灌胃，給藥體積均為10 mL/kg。每日給藥1次，連續(xù)14 d。

2.2? 缺血再灌注模型建立

末次給藥2 h后建立MIRI模型。除空白組外，各組大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定于解剖臺(tái)上，頸部備皮消毒。切開氣管，以8號(hào)灌胃針進(jìn)行氣管插管，動(dòng)物呼吸機(jī)（呼吸頻率60～80次/min，潮氣量5～7 mL）輔助呼吸。沿第3/4肋骨上緣打開胸腔暴露心臟，剪開心包，沿冠狀動(dòng)脈于左前降支下方約2 mm處用無(wú)創(chuàng)縫合線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，連續(xù)監(jiān)視心電圖的變化，出現(xiàn)ST段弓背抬高，T波高聳/倒置或左心室變?yōu)樯n白色即確認(rèn)阻斷成功。30 min后放松結(jié)扎線，再灌注90 min以ST 段回落1/2以上，T波下降或左心室由蒼白變?yōu)榘导t色表示再灌注成功。假手術(shù)組僅做開胸處理，不結(jié)扎。

2.3? HE染色觀察心肌組織病理變化

取大鼠心肌組織，10%多聚甲醛浸泡固定，石蠟包埋，間斷連續(xù)切片，HE染色，正置顯微鏡下觀察心肌組織病理變化并拍照。

2.4? ELISA檢測(cè)大鼠血清CSE、CK、LDH含量

大鼠心肌缺血/再灌注24 h后，脫頸處死大鼠，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，取上清，分裝后置于-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩⒄誆LISA試劑盒說(shuō)明，檢測(cè)血清CSE、CK、LDH含量。

2.5? Western blot檢測(cè)心肌組織CSE表達(dá)

取大鼠左心室心肌組織，加入預(yù)冷RIPA裂解液研磨，提取總蛋白，測(cè)定蛋白含量。制備好的蛋白樣品，經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜后置于含5%脫脂奶粉封閉液中封閉2 h，Anti-rabbit CSE/β-actin一抗（CSE 1∶1 000稀釋;β-Actin1∶10 000稀釋）4 ℃下孵育過(guò)夜。加HRP標(biāo)記的Goat-anti-rabbit IgG二抗（1∶10 000稀釋）室溫孵育1 h后，加入ECL發(fā)光液顯影，ECL分析系統(tǒng)檢測(cè)并拍照，Image J軟件計(jì)算條帶吸光度值。

2.6? Real-time PCR檢測(cè)心肌組織CSE mRNA表達(dá)

再灌注結(jié)束后取大鼠左心室組織，Trizol試劑冰上提取總RNA后，測(cè)定樣品RNA純度及濃度。以總RNA為模板，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列：CSE-F：CCACCACAACGATTACCC;CSE-R：AGTCCAAACTCGGATGCC，引物長(zhǎng)度：112 bp;β-Actin-F：CGTTGACATCCGTAAAGAC;β-Actin-R：TAGGAGCCAGGGCAGTA，引物長(zhǎng)度：110 bp。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃ 5 s，56 ℃10 s，72 ℃ 25 s循環(huán) 40 次。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算CSE mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2.7? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以Excel表格進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，Graphpad prism 7軟件進(jìn)行分析。結(jié)果以“x±s”表示，組間比較以one-way ANOVA單因素方差分析及q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? JWDS對(duì)MIRI模型大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)的影響

與空白組比較，模型組大鼠心肌組織局部壞死，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，邊界不清，胞內(nèi)水腫明顯，心肌細(xì)胞走形紊亂。與模型組比較，JWDS組大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)明顯改善，細(xì)胞走形規(guī)律，輪廓完整，水腫程度減輕，JWDS+PPG組大鼠心肌組織壞死程度加重，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多。見圖1。

3.2? JWDS對(duì)MIRI模型大鼠血清CSE、CK、LDH含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清LDH、CK含量明顯升高（P<0.01），CSE含量明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，JWDS組LDH、CK含量明顯降低（P<0.01），CSE含量明顯升高（P<0.01）。與JWDS組比較，JWDS+PPG組CSE含量明顯降低（P<0.01）。見圖2。

3.3? JWDS對(duì)MIRI模型大鼠心肌組織CSE蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠心肌組織CSE表達(dá)明顯降低（P<0.05）;與模型組比較，JWDS組CSE表達(dá)明顯升高（P<0.05）;JWDS+PPG組CSE蛋白未見明顯改變。見圖3。

3.4? JWDS對(duì)MIRI模型大鼠心肌組織CSEmRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠心肌組織CSE mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.05）。與模型組比較，JWDS組CSE mRNA表達(dá)升高（P<0.01）。與JWDS組比較，JWDS+PPG組CSE mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.01）。見圖4。

4 討論

MIRI發(fā)病機(jī)制主要為心臟經(jīng)缺血/再灌流刺激，心肌細(xì)胞損傷，能量供應(yīng)障礙，氧自由基（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生過(guò)多且生成過(guò)量脂質(zhì)過(guò)氧化物，細(xì)胞內(nèi)鈣超載觸發(fā)線粒體攝取Ca2+增加以及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡或自噬，細(xì)胞內(nèi)LDH、CK等酶類異常升高，最終導(dǎo)致心肌梗死發(fā)生。同時(shí)再灌注損傷使得心肌代謝產(chǎn)物聚集，大量ROS產(chǎn)生，誘導(dǎo)細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)化，降低細(xì)胞膜流動(dòng)性，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損導(dǎo)致內(nèi)源性NO合成減少，導(dǎo)致抑制ROS活性及OH生成能力下降[9]。研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體對(duì)MIRI具有內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制，因此以藥物激活/模擬機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制可以發(fā)揮心肌保護(hù)作用，且無(wú)明顯創(chuàng)傷性，臨床使用更為方便，目前有諸如極化液、阿托伐他汀、環(huán)孢霉素A等藥物已被證明具有干預(yù)MIRI發(fā)生/發(fā)展的作用，但鑒于MIRI是一種機(jī)制復(fù)雜的多因素疾病，對(duì)藥物干預(yù)MIRI的作用機(jī)制及給藥方案研究仍未得出明確結(jié)果[10-11]。

H2S是一種無(wú)色，有臭雞蛋氣味且易燃的水溶性氣體，以NaHS形式存在于機(jī)體內(nèi)，可分解為Na+與-HS，-HS與體內(nèi)H+結(jié)合形成H2S，隨著血液循環(huán)到達(dá)靶器官發(fā)揮保護(hù)作用。H2S是繼NO、CO后發(fā)現(xiàn)的第三種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，參與機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)過(guò)程。內(nèi)源性H2S的合成受CSE調(diào)控，CSE活性降低可導(dǎo)致H2S含量減少，減弱其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。炔丙基甘氨酸（propargylglycine， PPG）對(duì)CSE活性具有不可逆性阻斷作用，抑制機(jī)體H2S產(chǎn)生，進(jìn)而引發(fā)或加重心肌缺血/再灌注損傷[12-15]。本實(shí)驗(yàn)研究將JWDS灌胃后14 d的大鼠再灌注前30 min以CSE合成酶抑制劑PPG（33.9 mg/kg）腹腔注射干預(yù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與僅用JWDS組相比，JWDS+PPG組血清中CSE含量明顯降低，大鼠心肌組織損傷明顯加重，心肌CSE表達(dá)也明顯降低，可見反饋性加重對(duì)H2S合酶CSE的抑制，會(huì)使內(nèi)皮源性H2S進(jìn)一步減少，心肌損傷加重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示JWDS對(duì)心肌的保護(hù)作用與H2S生成有較密切的聯(lián)系。

中醫(yī)認(rèn)為心肌缺血/再灌注損傷屬“胸痹”范疇，“心脈閉阻”為其基本病機(jī)，臨床多以活血化瘀法治療，化瘀之法多以益氣、行氣為主?！鹅`樞·刺節(jié)真邪篇》云：“宗氣不下，脈中之血，凝而留止”;《難經(jīng)·二十二難》曰：“氣主呴之，血主濡之”;王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》云：“元?dú)饧忍?，必不能達(dá)于血管，血管無(wú)氣必停留為瘀”;氣能生血、行血和攝血，故“氣為血之帥”，氣虛則血瘀。吳煥林等[16]從319例冠心病患者證候分布規(guī)律分析發(fā)現(xiàn)，氣虛占87.1%，血瘀占79.9%，提示氣虛血瘀為臨床主要證型。

JWDS是經(jīng)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐總結(jié)出的治療胸痹、防治缺血性心肌病的有效方劑，方中黃芪、丹參補(bǔ)氣活血，當(dāng)歸、赤芍、川芎、紅花、生地黃活血化瘀、養(yǎng)血和脈，全方共奏益氣活血之效。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)JWDS不同配伍組方均對(duì)MIRI模型大鼠心肌組織具有保護(hù)作用，可抑制p38 MAPK信號(hào)通路，降低下游基因COX-2及ICAM-1表達(dá)，降低CK、LDH含量，減輕心肌損傷，且丹參、黃芪、赤芍、紅花在組方中發(fā)揮主要作用[17-19]。然而JWDS是否通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源性H2S合成發(fā)揮心肌保護(hù)作用的機(jī)制尚不明確，為闡明JWDS與內(nèi)源性H2S合成的關(guān)系，本研究以外源性NaHS與JWDS以及CSE抑制劑（PPG）分別干預(yù)實(shí)驗(yàn)大鼠，再以結(jié)扎冠脈左前降支/再灌注方法復(fù)制MIRI模型，觀察JWDS對(duì)MIRI模型大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)、血清CSE、CK、LDH含量、心肌組織CSE與mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)JWDS可明顯改善MIRI模型大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)，降低血清LDH、CK含量，升高CSE含量，減輕細(xì)胞水腫及壞死程度，上調(diào)心肌組織CSE與mRNA表達(dá)。研究結(jié)果顯示JWDS對(duì)心肌缺血/再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制與促進(jìn)內(nèi)源性H2S生成以保護(hù)心肌組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)、抑制CK、LDH漏出、上調(diào)CSE及mRNA表達(dá)有關(guān)。

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