消渴痹通膠囊對高糖誘導的RSC96雪旺細胞損傷的保護作用及其機制

張文靜 孫亞克

摘要 目的：探討消渴痹通膠囊對高糖誘導的RSC96雪旺細胞損傷的保護作用及其機制。方法：將RSC96雪旺細胞復蘇及培養(yǎng)，采用免疫細胞化學法檢測RSC96細胞的特異性蛋白S-100的表達情況，進行雪旺細胞鑒定;以高糖誘導造成RSC96雪旺細胞損傷，梯度高糖濃度比較，確定后續(xù)研究所采用的高糖濃度;通過MTT法檢測消渴痹痛膠囊對高糖誘導的RSC96雪旺細胞的保護作用，采用免疫組織化學檢測NGF蛋白水平和蛋白質(zhì)印跡法檢測P-AKT/AKT通路及caspase-3的蛋白水平。結(jié)果：1）RSC96雪旺細胞存活率隨著消渴痹痛膠囊藥物濃度的升高而增加（P<0.05）。2）NGF蛋白表達量隨著消渴痹痛膠囊藥物濃度增加（P<0.05）。3）p-AKT/t-AKT和caspase-3蛋白表達下調(diào)，且隨著消渴痹痛膠囊藥物濃度增加而減少（P<0.05）。結(jié)論：消渴痹痛膠囊可能通過抑制PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路的激活，從而下調(diào)caspase-3蛋白的表達水平，抑制雪旺細胞的細胞凋亡，同時又上調(diào)NGF的表達水平，為周圍神經(jīng)的髓鞘細胞提供神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)，從而對高糖誘導的RSC96雪旺細胞起到保護作用。

關鍵詞 消渴痹通膠囊;高糖;RSC96雪旺細胞;損傷;保護作用;機制;NGF;AKT

Protective Effects of Xiaoke Bitong Capsules on High Glucose-Induced Injury of RSC96 Schwann Cells and Its Mechanism

Zhang Wenjing，Sun Yake

Abstract Objective：To investigate the protective effects of Xiaoke Bitong Capsules on RSC96 Schwann cell injury induced by high glucose and its mechanism.Methods：RSC96 Schwann cells were resuscitated and cultured.The expression of specific protein S100 in RSC96 cells was detected by immunocytochemistry and identified by Schwann cells.The damage of RSC96 Schwann cells induced by high glucose was compared with the gradient high glucose concentration，and the high glucose concentration used in the follow-up study was determined.The protective effects of Xiaoke Bitong Capsule on RSC96 Schwann cells induced by high glucose was detected by MTT method.The level of NGF protein was detected by immunohistochemistry and the protein level of P-AKT/AKT pathway and caspase-3 was detected by Western blot.Results：1）The survival rate of RSC96 Schwann cells increased with the increase of Xiaoke Bitong Capsules concentration.2）The expression of NGF protein increased with the concentration of Xiaoke Bitong Capsules.3）The expression of p-AKT/t-AKT and caspase-3 protein was down-regulated and decreased with the increase of the concentration of Xiaoke Bitong Capsules（P<0.05）.Conclusion：Xiaoke Bitong Capsules may down-regulate the expression of caspase-3 protein，inhibit the apoptosis of Schwann cells and up-regulate the expression of NGF by inhibiting the activation of PI3K/AKT signal transduction pathway.The myelin sheath cells of peripheral nerves are provided with neuronutrients，which can protect RSC96 Schwann cells induced by high glucose.

Key Words Xiaoke Bitong Capsules; High glucose; RSC96 Schwann cell; Injury; Protective effects; Mechanism; NGF; AKT

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.013

糖尿病是臨床上常見的慢性疾病之一，其發(fā)生不同程度的糖尿病周圍神經(jīng)病變的概率達60%以上[1]，患者出現(xiàn)以遠端對稱性感覺和運動性多發(fā)性神經(jīng)病變等臨床癥狀[2]，主要由神經(jīng)元的損傷和血管病變等病理因素所致[3]。然而復雜的發(fā)病機制使得糖尿病周圍神經(jīng)病變的治療相當棘手，盡管控制血糖可以緩解糖尿病周圍神經(jīng)病變的臨床癥狀，但是卻不能遏制該疾病的進一步發(fā)展。本團隊在臨床上除控制患者血糖外，采用院內(nèi)制劑消渴痹痛膠囊治療患者，經(jīng)益氣活血，化瘀通絡進一步延緩糖尿病周圍神經(jīng)病變的進展[4]。目前關于消渴痹痛膠囊對糖尿病周圍神經(jīng)病變的機制研究報道較少，基于雪旺細胞是周圍神經(jīng)的髓鞘細胞[5]，對周圍神經(jīng)損傷的修復和再生具有重要的作用[6]，因此本研究采用高糖誘導RSC96雪旺細胞模擬糖尿病周圍神經(jīng)病變，并以消渴痹痛膠囊進行干預探究其保護作用及機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 所用的RSC96雪旺細胞購買于ATCC細胞庫（批號：CRL-2765）。RSC96雪旺細胞復蘇及培養(yǎng)：從液氮罐中快速取出RSC96細胞，37 ℃水浴快速解凍約1 min，將細胞懸浮液（1 mL）吸入15 mL離心管內(nèi)并加入1 mL DMEM完全培養(yǎng)基，混勻后1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入5 mL含10%FBS、1%雙抗、5 mmol/L葡萄糖的完全DMEM培養(yǎng)基;置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察復蘇的RSC96細胞生長狀態(tài)，當細胞生長狀態(tài)良好且鋪滿T25培養(yǎng)瓶的90%時進行細胞傳代。1～2 d換液1次，2～4 d傳代。取對數(shù)生長期的RSC96細胞進行后續(xù)實驗。

1.1.2 藥物 消渴痹痛膠囊（黃芪30 g、桑枝10 g、威靈仙10 g、牛膝10 g、雞血藤15 g、豨薟草15 g、全蝎3 g等）為本院院內(nèi)制劑，取1.5 mL EP管，每個EP管分裝消渴痹痛膠囊內(nèi)容物50 mg，-20 ℃冰箱保存待用。

1.1.3 試劑與儀器

1.1.3.1 試劑 1640培養(yǎng)基購買于Hyclone公司;胎牛血清（FBS）購買于Gibco公司;MTT檢測試劑盒購買于美國Amresco公司;二甲基亞砜（DMSO）和多聚左旋賴氨酸購買于Sigma公司;Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody購買于CST公司;Anti-mouse IgG、HRP-linked Antibody購買于CST公司，兔抗鼠NGF抗體購買于Eptomics公司;鼠抗GAPDH抗體、Caspase-3 Antibody、p-Akt1/2/3 Antibody（Ser473）-R和Akt1/2/3Antibody（H-136）購買于Santa公司;免疫組化試劑盒購買于碧云天生物技術公司。

1.1.3.2 儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱（日本SANYO公司，型號：MCO-170AICUVL）、96孔板（CORNING公司，型號：Costar 3897）;熒光顯微鏡購買于日本Nikon公司，型號：E200;全波長酶標儀購買于美國ThermoFisher公司，型號：multiskan-go;超聲波細胞破碎儀購買于南京凡帝朗信息科技有限公司，型號：FDL-1000D;垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購買于美國Bio-Rad公司，型號：165-8001，170-3940;凝膠成像系統(tǒng)購買于美國Bio-Rad公司，型號：Gel-Doc XR+。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 用96孔板接種細胞，每孔加入200 μL培養(yǎng)液，設置空白對照、control對照組和高糖處理組，于正常培養(yǎng)24 h后，在高糖處理在中用不同濃度（50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、400 mmol/L）的高糖對細胞進行處理，在培養(yǎng)24 h后行MTT實驗。測定并記錄各孔的OD值，計算細胞存活率。結(jié)果顯示，隨著高糖濃度的增加，RSC96雪旺細胞的存活率下降（P<0.05），其中400 mmol/L的存活率約21%，太低，不適宜后續(xù)試驗的開展，因此高糖濃度確定為200 mmol/L，其細胞存活率約53%，處于中線水平，即通過高糖誘導出RSC96雪旺細胞損傷模型，又適宜后續(xù)試驗的開展。見表1。

1.2.2 給藥方法

1.2.2.1 對照組 含糖0 mmol/L、10%FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基、200 μL RSC96雪旺細胞細胞懸液。

1.2.2.2 高糖組 含糖200 mmol/L、10%FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基、200 μL RSC96雪旺細胞細胞懸液。

1.2.2.3 干預組 10%FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基、200 μL RSC96雪旺細胞細胞懸液，在用高糖處理之前，我們先用不同濃度（0.01 mmol/L、0.1 mmol/L、1 mmol/L）的消渴痹痛膠囊對RSC96細胞預干預處理3 h，然后再加入200 mmol/L的高糖共培養(yǎng)24 h。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 RSC96雪旺細胞的鑒定方法 采用免疫細胞化學法對RSC96雪旺細胞進行鑒定，首先取經(jīng)多聚賴氨酸處理后的六孔板上鋪好玻片，做細胞爬片，將第4代細胞接種到六孔板上（5×104），培養(yǎng)24 h后采用免疫細胞化學法檢測RSC96細胞的特異性蛋白S-100的表達情況，進行鑒定，試驗中設置陰性對照組（正常培養(yǎng)的細胞），每組設置3個復孔。

1.2.3.2 MTT法檢測消渴痹痛膠囊對高糖誘導的RSC96雪旺細胞的保護作用 取生長狀態(tài)良好的3～5代細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，用血球計數(shù)板計數(shù)后，按照2×104個/mL密度的接種，實驗分為空白對照組、正常對照組和葛根素干預組3個組，空白對照組中每孔僅加入200 μL的1640基礎培養(yǎng)基，其余各組中每孔均加入200 μL的細胞混懸液，各組分別設置5個復孔。于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，將葛根素干預組的各孔內(nèi)的培養(yǎng)基吸出，換為含不同濃度葛根素的1640培養(yǎng)基，其中葛根素的濃度設置為0.01、0.1、1、10、100 mmol/L，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。3 h后，每孔各加入20 μL MTT液（5 mg/mL），繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μL DMSO，室溫下震蕩5～10 min，操作需避光。在酶標儀上選擇570 nm波長，測定OD值，重復3次實驗，記錄并分析結(jié)果。

1.2.3.3 免疫組織化學檢測NGF蛋白的表達情況 各組細胞以磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗5次后，在含有4%福爾馬林中固定約10 min，PBS沖洗后在細胞上滴加0.3%的H2O2覆蓋蓋玻片，室溫孵育10 min;再以pH值7.4 0.2 mol/L PBS清洗后，滴加BSA于細胞中，室溫封閉孵育20 min，僅用吸水紙從細胞邊吸去多余液體，注意不要碰到細胞以免造成破壞。滴加鼠抗兔NGF一抗（1∶500），4 ℃冰箱中過夜。第2天將切片拿出后以pH值7.4 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗3次×3 min后，滴加生物素化山羊抗兔IgG并于室溫下孵育30 min。以pH值7.4 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗后滴加試劑SABC，室溫孵育30 min，然后滴加DAB顯色液，室溫下孵育30 min，雙蒸水多次洗滌，經(jīng)上行梯度乙醇脫水;再經(jīng)二甲苯透明;中性樹膠封片。室溫晾干后，光學顯微鏡下觀察、攝片。每只大鼠分別隨機選取10個切片，分別計數(shù)每張切片3個視野的細胞中NGF陽性細胞表達數(shù)目，確平均值納入統(tǒng)計分析。

1.2.3.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測P-AKT/AKT通路及caspase-3的蛋白表達情況 收集各組細胞，充分裂解并用超聲波細胞破碎儀進行破碎處理，放置樣品細胞間的粘連;隨即在100 ℃恒溫水浴中進行蛋白變性，并用BCA法測定樣品蛋白濃度，-20 ℃保存待用。將標記蛋白的masker和各組樣品加樣到已經(jīng)裝好電泳液的電泳膠槽后，進行蛋白分離電泳，隨即根據(jù)目標蛋白切膠，進行轉(zhuǎn)膜電泳，將電泳膠上的目標蛋白轉(zhuǎn)到相對穩(wěn)定不易碎的PVDF膜上，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉的封閉液中30 min，TBST洗膜后孵育P-AKT/AKT、caspase-3和GAPDH一抗，4 ℃孵育過夜TBST洗膜后孵育各指標相應的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜后ECL發(fā)光，在凝膠成像系統(tǒng)上查看各組蛋白條帶及其灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。首先對各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性及方差齊性檢驗，若呈正態(tài)性分布且方差齊，則采用單因素方差分析（one-way ANOVA）同時選擇最小顯著性差異檢驗（Least Significant Difference，LSD）進行組間和組內(nèi)的統(tǒng)計;若呈正態(tài)性分布且方差不齊，則采用單因素方差分析（one-way ANOVA）同時選擇非參數(shù)檢驗（Tamhane′s T2）進行組間和組內(nèi)的統(tǒng)計;若不滿足正態(tài)性和方差齊性，采用多樣本秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RSC96雪旺細胞的鑒定結(jié)果 正常培養(yǎng)的RSC96細胞在經(jīng)免疫細胞化學方法處理后，其結(jié)果顯示，對照組中的細胞胞體和軸突呈現(xiàn)棕色，說明RSC96雪旺細胞的特異性抗體S-100表達為陽性;而相應的陰性對照組中細胞胞體不顯色，細胞核為藍色。見圖1。

2.2 消渴痹痛膠囊對高糖誘導的RSC96雪旺細胞的保護作用 對照組比較，高糖組和干預組明顯RSC96雪旺細胞存活率降低（P<0.05），與高糖組比較，干預組中RSC96雪旺細胞存活率增高（P<0.05），且RSC96雪旺細胞存活率隨著消渴痹痛膠囊藥物濃度的升高而增加（P<0.05）。見表2。

2.3 消渴痹痛膠囊對高糖誘導的RSC96雪旺細胞中NGF蛋白表達的影響 對照組中RSC96雪旺細胞、軸突上NGF蛋白表達均呈棕色，即為陽性表達，與之比較，高糖組和干預組均減少（P<0.05），而與高糖組比較，干預組中NGF蛋白表達量增加，且隨著消渴痹痛膠囊藥物濃度增加（P<0.05）。見圖2。

2.4 各組細胞p-AKT/t-AKT和caspase-3比值的比較 與對照組比較，高糖組和干預組中RSC96雪旺細胞p-AKT/t-AKT和caspase-3比值正高（P<0.05），而與高糖組比較，干預組中p-AKT/t-AKT和caspase-3蛋白表達下調(diào)，且隨著消渴痹痛膠囊藥物濃度增加而減少（P<0.05）。見表3。

3 討論

糖尿病周圍神經(jīng)病變在中醫(yī)學中屬于“消渴痹癥”，由于機體正氣虧虛，內(nèi)外感邪氣在體內(nèi)瘀滯而化熱化燥，傷陰耗液，發(fā)為消渴;消渴病況日久，氣血陰陽受損，其病機虛實夾雜，多見陰陽兩虛，以虛為本而以邪實為標，進而痰濁瘀血，阻滯經(jīng)絡[7];正如葉天士所說：“病久氣血推行不利，血絡之中，必有瘀凝……久存脈道，絡中氣血阻滯不通，必猝然而痛”。消渴痹癥病久傷絡，故主張治療時多將“祛瘀通絡”貫穿始終，故多以“扶正祛邪通絡”進行治療[8-10]。而消渴痹痛膠囊中以黃芪為君藥，益氣健脾，固本之時亦能斂瘡生肌;臣以桑枝祛風通絡，雞血藤補血行血，舒經(jīng)活絡;豨薟草和牛膝，同歸肝腎經(jīng)，共奏補肝腎，強筋骨之功，威靈仙祛風除濕，通絡止痛，同為佐藥;全蝎息風止痙，通經(jīng)止痛，引諸藥到肢體末端，為佐使藥[11]。全方補血活血，補益肝腎以治本，化瘀通絡以治標。本研究結(jié)果顯示消渴痹痛膠囊干預后增加了RSC96雪旺細胞的存活率，提示消渴痹痛膠囊對高糖誘導的RSC96雪旺細胞的損傷具有保護作用。

為進一步探討其保護機制，由于在糖尿病周圍神經(jīng)病變病理演變進程中，判定糖尿病周圍神經(jīng)受損的重要標志是神經(jīng)傳導速度的異常，相應的周圍神經(jīng)再生也存在著缺陷。而在神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中，神經(jīng)生長因子（NGF）是最具活力的能夠營養(yǎng)神經(jīng)的生物活性因子之一，存在于周圍神經(jīng)的雪旺氏細胞及神經(jīng)節(jié)等部位[12]。當糖尿病周圍性神經(jīng)病變患者胰島素缺乏或雪旺細胞受損均能夠減少NGF合成，而NGF通過逆向軸漿運輸障礙進一步引起神經(jīng)營養(yǎng)缺乏、神經(jīng)再生障礙[13-14]。有研究顯示[15]，采用不同濃度NGF對RSC96大鼠雪旺細胞株進行干預，發(fā)現(xiàn)NGF對高糖所引起的雪旺細胞損傷和生長抑制有明顯的改善作用。本研究結(jié)果顯示，消渴痹痛膠囊對高糖誘導的RSC96雪旺細胞干預后可上調(diào)NGF的蛋白表達，保護受損雪旺細胞。有實驗研究顯示[16-18]NGF能夠調(diào)控PI3K/Akt和ERK1/2以及GSK3β等3條信號轉(zhuǎn)導通路，抑制由高糖誘導的RSC96雪旺細胞內(nèi)ERS的過度激活，降低雪旺細胞的細胞凋亡水平，從而達到治療糖尿病周圍性神經(jīng)病變的目的。本研究進一步探討研究發(fā)現(xiàn)，消渴痹痛膠囊對高糖誘導的RSC96雪旺細胞干預后，降低p-AKT和caspase-3的蛋白表達水平;提示消渴痹痛膠囊可能通過抑制PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路的激活，從而下調(diào)caspase-3蛋白的表達水平，抑制雪旺細胞的細胞凋亡，同時又上調(diào)NGF的表達水平，為周圍神經(jīng)的髓鞘細胞提供神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)，從而對高糖誘導的RSC96雪旺細胞起到保護作用。

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（2019-05-31收稿 責任編輯：王明）

基金項目：國家自然科學基金項目（81070641）作者簡介：張文靜（1983.01—），女，碩士，主管藥師，研究方向：中醫(yī)藥藥理學研究，E-mail：zhangwenjing0123@163.com通信作者：孫亞克（1990.04—），女，本科，初級藥師，研究方向：中醫(yī)藥藥理學研究，E-mail：984453858@qq.com