BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化解毒止血顆粒的提取工藝

劉李梅 彭偉 涂禾 謝松 向猛 郭宏彥

摘要 目的：優(yōu)選解毒止血顆粒的提取工藝。方法：以黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚含量以及干膏收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)聯(lián)合BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)考察加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)等因素的影響，利用層次分析法（AHP）綜合加權(quán)評(píng)分篩選解毒止血顆粒提取工藝。結(jié)果：最佳提取工藝參數(shù)為11倍量水，加熱回流提取3次，105 min/次。結(jié)論：優(yōu)選的提取工藝科學(xué)合理，穩(wěn)定可行。正交試驗(yàn)聯(lián)合BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化方法實(shí)用高效，適宜于醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥制劑研發(fā)需求。

關(guān)鍵詞 解毒止血顆粒;黃芩苷;漢黃芩苷;丹皮酚;層次分析法;正交試驗(yàn);BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

Optimization of Extraction Process of Jiedu Zhixue Granule by BP Artificial Neural Network and Orthogonal Test

Liu Limei， Peng Wei， Tu He， Xie Song， Xiang Meng， Guo Hongyan

Abstract Objective：To optimize the extraction process of Jiedu Zhixue Granules. Methods：Taking the baicaline， wogonoside， paeonol content and dry extract yield as the evaluation index， the extraction process of Jiedu Zhixue Granule was researched by using the combination methods between orthogonal test and BP artificial neural network to study the influence of water addition， extraction time， extraction times etc.， and using the analytic hierarchy process （AHP） to weighted mark comprehensively for screening extraction process of Jiedu Zhixue Granule. Results：The optimum extraction process was as following： adding 11 times the amount of water， heating reflux extraction 3 times， and each time for 105 minutes. Conclusion：The optimal extraction process is scientific， rational， stable and feasible. The optimization method of orthogonal experiment combined with BP artificial neural network is suitable for R&D needs of TCM preparation in medical institution because of its practical and efficient characteristics.

Key Words Jiedu Zhixue Granule; Baicaline; Wogonoside; Paeonol; Analytic hierarchy process; Orthogonal test; BP artificial neural network

中圖分類號(hào)：R283.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.010

復(fù)方解毒止血湯是四川省骨科醫(yī)院多年的臨床工作經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出來的，經(jīng)醫(yī)院藥事委員會(huì)批準(zhǔn)的協(xié)定方。處方含有黃芩12 g、黃芪20 g、黨參15 g、陳皮6 g、牡丹皮12 g、酒大黃6 g、酒黃連10 g、梔子10 g、紫花地丁20 g、蒲公英15 g等14味藥物組成，具有清熱解毒、消腫止痛、補(bǔ)氣血、止血的功效。此協(xié)定方在我院臨床使用量大，對(duì)治療損傷出血、創(chuàng)面滲血、創(chuàng)面感染癥、骨科術(shù)后感染[1]有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，因此將其開發(fā)為醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑具有重要意義。

目前可應(yīng)用于中藥最佳工藝或最佳處方配比篩選的試驗(yàn)設(shè)計(jì)、優(yōu)化方法豐富，如正交設(shè)計(jì)[2-3]、均勻設(shè)計(jì)、混料設(shè)計(jì)、星點(diǎn)設(shè)計(jì)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化法、效應(yīng)面優(yōu)化法等，不同方法之間各有優(yōu)勢(shì)，但也存在相應(yīng)的局限性。如正交設(shè)計(jì)適宜于水平數(shù)<5的多因素多水平試驗(yàn)，均勻設(shè)計(jì)適宜于水平數(shù)較多的試驗(yàn)，混料設(shè)計(jì)適宜于處方配比的篩選，星點(diǎn)設(shè)計(jì)所涉及變量應(yīng)為連續(xù)變量，且試驗(yàn)次數(shù)相較于正交設(shè)計(jì)大幅增加[4]。

因此，本研究以黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚含量以及干膏收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用層次分析法、正交試驗(yàn)、BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)選其最佳提取工藝參數(shù)，為后續(xù)開發(fā)為醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)探討正交設(shè)計(jì)-BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化聯(lián)用方法在醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥制劑提取工藝研究環(huán)節(jié)的適用性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（Waters，美國(guó)，型號(hào)：e2695、2489UV/Vis Detector）;XS105型分析天平（十萬分之一，METTLER TOLEDO公司，瑞士，型號(hào)：XS105）、電子天平（METTLER TOLEDO公司，瑞士，型號(hào)：PL202-L）;超純水機(jī)（重慶艾科浦公司，型號(hào)：AYJ1-0501-U）。

1.2 試藥 黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110715-201720），漢黃芩苷對(duì)照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：wkq18031409），丹皮酚對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110708-201407）。黨參（批號(hào)：180816）、黃芪（批號(hào)：181022）、黃芩（批號(hào)：171014）、酒黃連（批號(hào)：180820）、白術(shù)（批號(hào)：180919）、牡丹皮（批號(hào)：180920）、酒大黃（批號(hào)：180302）、陳皮（批號(hào)：181008）、梔子（批號(hào)：171130）、甘草（批號(hào)：180926）、蒲公英（批號(hào)：180920）、紫花地?。ㄅ?hào)：181009）、仙鶴草（批號(hào)：180912），以上均購于四川省中藥飲片有限責(zé)任公司。經(jīng)四川省骨科醫(yī)院涂禾主任中藥師鑒定，均符合2015年版中華人民共和國(guó)藥典相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 試劑 乙腈、甲醇為色譜純（Fisher公司，批號(hào)174491、批號(hào)154449），其他試劑為分析純，水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Waters SymmetryShieldTM RP18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）梯度洗脫（0～8 min：A 19%，B 81%;8～35 min：A 19%→50%，B 81%→50%;35～36 min：A 50%→100%，B 50%→0%;36～40 min：A 100%→19%，B 0%→81%），流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為274 nm，進(jìn)樣體積10 μL。在上述色譜條件下，樣品中黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚的保留時(shí)間與對(duì)照品一致，成分色譜峰能達(dá)到較好的分離。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚對(duì)照品適量，分別置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，分別制得每1 mL含黃芩苷478 μg，漢黃芩苷51.85 μg，丹皮酚48.84 μg的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 稱取0.5倍處方量飲片共9份，按照正交設(shè)計(jì)表加水回流提取，趁熱濾過，合并濾液，定容。精密吸取提取液1 mL，加70%乙醇定容至10 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得9批供試品溶液，依次記為S1-S9。

2.4 陰性樣品溶液的制備 分別稱取缺黃芩陰性、缺牡丹皮陰性0.5倍處方量飲片2份，加10倍量水，回流提取1次，每次1 h，濾過，合并濾液，加水定容至1 000 mL。精密吸取提取液1 mL，加70%乙醇定容至10 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.5 專屬性試驗(yàn) 分別精密量取2.1.2項(xiàng)下3種對(duì)照品溶液、2.1.3項(xiàng)下供試品溶液、2.1.4項(xiàng)下2種陰性對(duì)照溶液各10 μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果可見，陰性對(duì)照溶液在黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚峰保留時(shí)間處無干擾，專屬性良好。見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察 將2.1.2項(xiàng)下所得對(duì)照品溶液分別稀釋，每個(gè)對(duì)照品溶液共6個(gè)濃度，得到一系列不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。取各個(gè)濃度的對(duì)照品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程與相關(guān)系數(shù)。見表1。

2.7 中間精密度試驗(yàn) 精密吸取黃芩苷對(duì)照品溶液（23.90 μg/mL）、漢黃芩苷對(duì)照品溶液（51.85 μg/mL）、丹皮酚對(duì)照品溶液（24.42 μg/mL）10 μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定各成分色譜峰峰面積。結(jié)果黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚峰面積的RSD分別為0.30%、0.29%、0.17%，表明儀器精密度良好。

2.8 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液S1，分別于制備后0、2、4、6、20、24 h，精密吸取10 μL進(jìn)樣分析，測(cè)定各成分色譜峰峰面積。結(jié)果黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚峰面積的RSD分別為0.28%、0.96%、0.15%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 平行制備S1供試品溶液6份，精密吸取10 μL進(jìn)樣分析，測(cè)定各成分色譜峰峰面積。結(jié)果黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚峰面積的RSD分別為0.56%、0.01%、0.47%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已測(cè)定的供試品溶液S1 0.5 mL共6份，分別置于10 mL容量瓶中，精密加入黃芩苷對(duì)照品溶液（478 μg/mL）0.1 mL，漢黃芩苷對(duì)照品溶液（51.85 μg/mL）0.1 mL，丹皮酚對(duì)照品溶液（48.84 μg/mL）0.1 mL，精密吸取10 μL進(jìn)樣分析，測(cè)定各成分色譜峰峰面積。結(jié)果黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚的平均回收率分別為101.72%、100.50%、98.53%，RSD分別為1.71%、1.25%、1.17%，表明該方法回收率良好。

2.11 干膏收率測(cè)定 精密吸取提取液適量，置于已恒重蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，再置于烘箱105 ℃干燥至恒重，精密稱定重量，計(jì)算干膏收率（%）。

2.12 正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝

2.12.1 浸泡時(shí)間及吸水率的考察 稱取0.5倍處方量飲片共3份，分別加入1 000 mL水，每隔30 min濾過，收集濾液，記錄剩余水量（mL）;直至藥材全部浸透心，剩余水量不再減少為止，計(jì)算藥材的吸水率（%）。結(jié)果：處方飲片的平均吸水率為228.40%，因此確定在首次提取時(shí)應(yīng)多加2倍量的溶劑，浸泡時(shí)間為30 min后開始提取。

2.12.2 單因素考察

2.12.2.1 提取時(shí)間考察 稱取0.5倍處方量飲片共3份，各加10倍量水，分別回流提取60、90、120 min，濾過，定容至1 000 mL容量瓶中。精密吸取提取液1 mL，加70%乙醇定容至10 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。見表2。

結(jié)果：提取90 min時(shí)，黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚含量最高。

2.12.2.2 加水量考察 稱取0.5倍處方量飲片共4份，分別加入8、10、12、14倍量水，各回流提取60 min，濾過，定容至1 000 mL容量瓶中。精密吸取提取液1 mL，加70%乙醇定容至10 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。溶劑為12倍量水提取時(shí)，黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚含量最高;再增加溶劑用量，黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

2.13 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素考察結(jié)果、臨床應(yīng)用形式并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，以加水量（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）為考察因素，安排L9（34）正交試驗(yàn)，因素水平見表4。

2.14 指標(biāo)權(quán)重的確立 基于處方藥味君臣佐使的配伍關(guān)系，確定各評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)先順序依次為黃芩苷>漢黃芩苷>丹皮酚>干膏收率，構(gòu)建指標(biāo)成對(duì)比較判斷優(yōu)先矩陣[5]。見表5。根據(jù)表5評(píng)分結(jié)果，AHP法計(jì)算結(jié)果可得到黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚、干膏收率4項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)分別為48.72%、27.40%、13.30%、10.58%。一致性比率（CR）=0.012，CR<0.1，即判斷矩陣具有滿意的一致性，表明權(quán)重系數(shù)合理有效，可用在解毒止血顆粒提取工藝優(yōu)選的綜合評(píng)分中。

2.15 含量測(cè)定及干膏率計(jì)算 按2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取各供試品溶液10 μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定各供試品中成分含量及提取液干膏率，結(jié)果見表6。

從方差分析結(jié)果可知，提取次數(shù)（C）對(duì)干膏率、黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚的提取有顯著影響，為主要因素。加水量（A）、提取時(shí)間（B）對(duì)提取的影響不大，為次要因素。結(jié)合直觀分析，各因素作用主次為C>A>B，且C3>C2>C1，A3>A2>A1，B2>B3>B1，所優(yōu)選最佳工藝確定為A3B2C3，即14倍量水、1.5 h/次、提取3次。

2.16 基于正交試驗(yàn)的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化 以正交試驗(yàn)中加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)3個(gè)因素?cái)?shù)值作為輸入層，以黃芩苷含量、漢黃芩苷含量、丹皮酚含量、干膏率數(shù)值作為輸出層，運(yùn)用MATLAB（R2014b版本，Math Works，美國(guó)）軟件編程，建立BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。采用Levenberg-Marquardt算法，最大迭代次數(shù)1 000次，網(wǎng)絡(luò)計(jì)算精度為1×10-5，建立并訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)，很快即獲得性能與預(yù)測(cè)能力良好的BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（均方誤差為2.02×10-6）?；谒⒌腂P人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，以加水量等3個(gè)因素值為自變量，并分別對(duì)3個(gè)因素制定合適的步長(zhǎng)，采用MATLAB相關(guān)函數(shù)對(duì)每個(gè)因素定義域值進(jìn)行編程，利用sim函數(shù)對(duì)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行仿真輸出，以尋求輸出值最大組合。結(jié)果BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型仿真優(yōu)化最佳提取工藝為：11倍量水，提取105 min，提取3次。

2.17 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取0.5倍處方量飲片，按正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)與BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)所優(yōu)選最佳提取工藝參數(shù)，分別平行安排3組試驗(yàn)，與正交試驗(yàn)最佳工藝所得結(jié)果比較，BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化工藝試驗(yàn)的考察指標(biāo)均處于更優(yōu)水平，且重復(fù)性良好，具有可操作性;同時(shí)節(jié)約能源。由此確定解毒止血顆粒最佳提取工藝參數(shù)為11倍量水，加熱回流提取3次，提取105 min/次。見表8。

3 討論

基于中藥多成分、多靶點(diǎn)的作用特性，多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分是目前中藥提取工藝質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要手段。AHP法作為一種介于主、客觀權(quán)重系數(shù)法之間的賦權(quán)方法，既可體現(xiàn)研究者對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的主觀重視程度，又可通過數(shù)學(xué)處理反映各項(xiàng)指標(biāo)之間的相互聯(lián)系與影響，降低經(jīng)驗(yàn)性權(quán)數(shù)法的主觀影響，使各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)具有較好的合理性和科學(xué)性，目前已被廣泛應(yīng)用于中藥的提取工藝研究并具較好的實(shí)用價(jià)值[6-8]。

正交試驗(yàn)因其“均勻分散、整齊可比”的特點(diǎn)，在篩選影響因素主次、優(yōu)化最佳參數(shù)組合等方面的研究中應(yīng)用廣泛，但受限于因素水平的設(shè)定，正交試驗(yàn)所篩選出的最佳參數(shù)只是已設(shè)水平的組合，有可能只是較優(yōu)組合而非最佳組合。BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)基于其輸入層、隱藏層、輸出層的三層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可通過相應(yīng)函數(shù)完成輸入層與輸出層的高度非線性擬合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多因素多指標(biāo)的試驗(yàn)優(yōu)化。因此，通過正交試驗(yàn)獲得訓(xùn)練數(shù)據(jù)和樣本，再利用BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行優(yōu)化篩選的方法，只需進(jìn)行較少次數(shù)試驗(yàn)即可獲取理想試驗(yàn)參數(shù)組合，可操作性強(qiáng)，目前在中藥炮制工藝與提取工藝的相關(guān)研究中均有應(yīng)用[9-11]。

本文聯(lián)合多種方法得出解毒止血顆粒最優(yōu)提取工藝參數(shù)，為制劑開發(fā)奠定基礎(chǔ)。但是本文僅基于解毒止血方在臨床以湯劑的形式給藥，采用正交試驗(yàn)聯(lián)合BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)選出解毒止血湯水提工藝參數(shù)，未比較其他溶劑提取。下一步擬將醇提工藝優(yōu)選，并結(jié)合水提、醇提2種提取物的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)的提取工藝。

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（2019-05-21收稿 責(zé)任編輯：王明）

基金項(xiàng)目：四川省骨科醫(yī)院科研課題項(xiàng)目（2017-9）作者簡(jiǎn)介：劉李梅（1988.10—），女，碩士研究生，中藥師，研究方向：中藥新制劑、新技術(shù)，E-mail：834321452@qq.com通信作者：涂禾（1965.05—），男，本科，主任中藥師，研究方向：中藥制劑、醫(yī)院藥事管理及臨床藥學(xué)，E-mail：297983480@qq.com