基于AQC衍生和液質(zhì)聯(lián)用的茶葉游離氨基酸分析

陳思肜 趙峰 王淑燕 金珊 周鵬 危賽明 葉乃興

摘要：【目的】開發(fā)一種能快速、準(zhǔn)確、可靠地對(duì)各茶葉中蛋白質(zhì)氨基酸和低含量非蛋白質(zhì)氨基酸進(jìn)行測(cè)定的方法，為分析茶葉氨基酸組分提供新途徑。【方法】質(zhì)控樣品經(jīng)提取和氨基喹啉-N-羥基丁二酰氨基甲酸酯（AQC）衍生后，通過三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行測(cè)定，優(yōu)化質(zhì)譜條件，評(píng)估35種氨基酸的線性范圍、檢出限、定量限、重現(xiàn)性和回收率，并應(yīng)用該方法對(duì)市售的六大茶類（紅茶、綠茶、白茶、黃茶、烏龍茶和黑茶）共50批次樣本的游離氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定。【結(jié)果】采用AQC衍生—液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法可在20 min內(nèi)完成35種氨基酸的定性定量檢測(cè)，線性回歸良好（R >0.9900）;定量限在2.1×10-6～1.8×10-2 mg/L，檢出限在6.3×10-7～5.5×10-3 mg/L;日內(nèi)重現(xiàn)性≤4.6%，日間重現(xiàn)性≤5.4%;加標(biāo)回收率81.0%～99.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）≤9.5%。對(duì)六大茶類游離氨基酸的測(cè)定結(jié)果顯示，除綠茶和黃茶的氨基酸構(gòu)成相似外，其他茶類的氨基酸構(gòu)成均呈現(xiàn)出各自的規(guī)律性特征，氨基酸的定量結(jié)果可通過3個(gè)主成分（累積方差為66.5%）實(shí)現(xiàn)茶類區(qū)分。其中，蛋氨酸、苯丙氨酸、肌氨酸、茶氨酸、瓜氨酸、3-甲基-L-組氨酸、精氨酸、色氨酸、組氨酸和1-甲基-L-組氨酸的變量權(quán)重值（VIP）大于1.0，對(duì)茶類判別貢獻(xiàn)較大?！窘Y(jié)論】AQC衍生結(jié)合液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用是一種快速、可靠、有效的分析方法，能對(duì)茶葉中的蛋白質(zhì)氨基酸和低含量非蛋白質(zhì)氨基酸進(jìn)行高靈敏度定量。

關(guān)鍵詞： 茶葉;游離氨基酸;AQC衍生;三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀

中圖分類號(hào)： S571.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）10-2278-08

Analysis of free amino acids in tea based on AQC derivation with liquid chromatography-mass spectrometry

CHEN Si-rong1， ZHAO Feng1，2*， WANG Shu-yan1， JIN Shan1， ZHOU Peng3，

WEI Sai-ming4， YE Nai-xing 1*

（1College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Key Laboratory of Tea Science at Universities in Fujian， Fuzhou? 350002， China; 2College of Pharmacy， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou? 350122， China; 3Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality， Fuzhou? 350002，China; 4Fujian Tea Import & Export Company Limited， Fuzhou? 350014， China）

Abstract：【Objective】To develop a rapid， accurate and reliable method for the determination of protein amino acids and low content non protein amino acids in tea. 【Method】The quality control samples（QC） were extracted and derived from 6-aminoquinolyl-n-hydroxysuccinyl carbamate（AQC）， then determined by triple quadrupole liquid chromatography-mass spectrometry， optimized the mass spectrum conditions， evaluated the linear range， detection limit， quantitative li-mit， reproducibility and recovery rate of 35 amino acids. The content of free amino acids in 50 batches of six kinds of tea （black tea， green tea， white tea， yellow tea， oolong tea and black tea） was determined.【Result】Using AQC derivative liquid chromatography tandem triple quadrupole mass spectrometry， 35 kinds of amino acids were detected qualitatively and quantitatively in 20 minutes， with good linear regression（R>0.9900）; quantitative limit was 2.1×10-6-1.8×10-2 mg/L， detection limit was 6.3×10-7-5.5×10-3 mg/L; daily reproducibility was less than or equal to 4.6%， daytime reproducibility was less than or equal to 5.4%; recovery rate was 81.0%-99.9%， relative standard deviation（RSD） was ≤9.5%. The results showed that the amino acid composition of other tea groups showed their own regularity except green tea and yellow tea. The quantitative results of amino acids could be distinguished by three main components（cumulative variance was 66.5%）. Among them， the variable weight value（VIP） of methionine， phenylalanine， sarcosine， theanine， citrulline， 3-methyl-l-histidine， arginine， tryptophan， histidine and 1-methyl-l-histidine is greater than 1.0， which contributes a lot to tea discrimination. 【Conclusion】AQC derivatization combined with liquid chromatography-mass spectrometry is a rapid， reliable and effective method for the quantitative analysis of protein amino acids and low content non protein amino acids in tea.

Key words：tea; free amino acid composition; AQC derivatization; triple quadrupole liquid chromatography mass spectrometry

0 引言

【研究意義】茶葉中的游離氨基酸占其干重的2%～4%，不僅是茶湯鮮味的主要貢獻(xiàn)成分，還參與加工過程中的多種化學(xué)反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化為香氣成分，因而茶葉中的氨基酸對(duì)茶葉品質(zhì)有重要貢獻(xiàn)（Wang et al.，2010;邵濟(jì)波等，2012;鄧代信等，2018;王富花，2018）。但由于氨基酸自身具有極性高、難揮發(fā)、無發(fā)色基團(tuán)等特點(diǎn)，加之茶葉中不同種類氨基酸的含量差異巨大，且基質(zhì)構(gòu)成較復(fù)雜，給準(zhǔn)確定量分析工作造成一定困難。因此，構(gòu)建一種能同時(shí)準(zhǔn)確定量分析茶葉中35種游離氨基酸的方法，對(duì)進(jìn)一步探究茶葉游離氨基酸構(gòu)成規(guī)律具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】間接分析是通過衍生化試劑與提取液中的氨基酸分子反應(yīng)后，再進(jìn)行檢測(cè)的方法（Jemal and Xia，2006）。根據(jù)衍生化反應(yīng)發(fā)生位置的不同，間接法又可分為柱后衍生和柱前衍生兩種?，F(xiàn)有的自動(dòng)氨基酸分析儀多采用柱后衍生法，但其缺點(diǎn)在于分離耗時(shí)長(zhǎng)（約120 min），通常需要使用配套專用的流動(dòng)相，耗材成本較高，不適于大批量樣品的檢測(cè)（陳然等，2017;肖涵等，2018）。常見的衍生試劑包括異硫氰酸苯酯（PITC）、二甲氨基萘磺酰氯（Dansly-CL）、2，4-二硝基氟苯（DNFB）（Ekborg-Ott et al.，1997）、鄰苯二甲醛（OPA）（Alcázar et al.，2007）和茚三酮（Ninhydrin）（杜穎穎等，2018）等，但多數(shù)衍生化操作存在過程繁瑣、穩(wěn)定性差、副產(chǎn)物有干擾或毒性，使其在大批量樣品分析工作中難以大面積推廣應(yīng)用。氨基喹啉-N-羥基丁二酰氨基甲酸酯（AQC）是一種近年來被用于茶葉氨基酸測(cè)定的衍生劑（Sharma et al.，2014），其是一種雜環(huán)氨基甲酸酯，能特異性地與一級(jí)、二級(jí)氨基酸反應(yīng)，生成具有強(qiáng)紫外吸收的脲。AQC衍生法操作簡(jiǎn)單、副反應(yīng)少、生成物毒性低、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，適用于復(fù)雜基質(zhì)樣本的氨基酸檢測(cè)（Jemal and Xia，2006;Castellanos et al.，2016;杜穎穎等，2018），已在食品氨基酸的測(cè)定分析中廣泛應(yīng)用。朱旗等（2001）采用AccQ·Tag衍生法經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)分析綠茶中16種氨基酸含量，樣品中茶氨酸含量最高，占氨基酸總量的56.03%;李梅等（2007）采用AQC柱前衍生，紫外、熒光雙檢測(cè)器串接，通過梯度洗脫，在AccQ·Tag C18氨基酸專用分析柱上同時(shí)分離并定量測(cè)定了啤酒中21種游離氨基酸，結(jié)果表明不同釀造工藝對(duì)啤酒中氨基酸組分構(gòu)成有明顯影響;于榮賢等（2017）采用AQC柱前衍生反相高效液相色譜法測(cè)定了洋槐蜜中18種氨基酸含量，樣品氨基酸總量為4.554 mg/g，其中脯氨酸含量最高?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，常見的氨基酸分析方法大多只能測(cè)定20種蛋白質(zhì)氨基酸，非蛋白質(zhì)氨基酸則鮮有關(guān)注，基于AQC衍生和液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)茶葉中游離氨基酸的研究也鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜，通過AQC衍生法，對(duì)六大類茶葉中的35種游離氨基酸進(jìn)行定性和定量分析，為快速準(zhǔn)確地測(cè)定茶葉中蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)氨基酸提供新途徑。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 供試樣品 市售茶葉50批次，編號(hào)1～50，包括綠茶（編號(hào)1～10）、黃茶（編號(hào)11～15）、白茶（編號(hào)16～25）、烏龍茶（武夷巖茶，編號(hào)26～35）、紅茶（編號(hào)36～45）和黑茶（普洱熟茶，編號(hào)46～50），逐一縮分后粉碎，過100目篩。各茶對(duì)應(yīng)的參試樣中，去等量樣本進(jìn)行混合制備，用于分析過程的質(zhì)量控制（Quality control，QC）;然后根據(jù)優(yōu)化方法對(duì)50批次樣品游離氨基酸進(jìn)行定量。

1. 1. 2 試劑 色譜級(jí)甲醇和乙腈購自美國(guó)Sigma公司，AccQ·FluorTM氨基酸衍生試劑盒購自美國(guó)Waters公司，試劑級(jí)甲酸銨購自J & K Scientific公司。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液A（Sigma公司，美國(guó)）：含5 nmol/mL丙氨酸（Ala，44.5 mg/L）、L-2-氨基己二酸（α-AAA，80.6 mg/L）、α-氨基丁酸（α-ABA，51.6 mg/L）、β-氨基丁酸（β-ABA，51.6 mg/L）、γ-氨基丁酸（GABA，51.6 mg/L）、精氨酸（Arg，87.1 mg/L）、天冬氨酸（Asp，66.6 mg/L）、瓜氨酸（Cit，87.6 mg/L）、羥脯氨酸（Hy-Pro，65.6 mg/L）、胱氨酸[（Cys）2，120.2 mg/L]、谷氨酸（Glu，73.6 mg/L）、甘氨酸（Gly，37.5 mg/L）、組氨酸（His，77.6 mg/L）、同型半胱氨酸（Hcy，134.2 mg/L）、羥賴氨酸（Hy-Lys，81.1 mg/L）、異亮氨酸（Ile，65.6 mg/L）、亮氨酸（Leu，65.6 mg/L）、賴氨酸（Lys，73.1 mg/L）、蛋氨酸（Met，74.6 mg/L）、1-甲基-L-組氨酸（1-M-His，84.6 mg/L）、3-甲基-L-組氨酸（3-M-His，84.6 mg/L）、鳥氨酸（Orn，66.1 mg/L）、苯丙氨酸（Phe，82.6 mg/L）、脯氨酸（Pro，57.6 mg/L）、肌氨酸（Sar，44.5 mg/L）、絲氨酸（Ser，52.6 mg/L）、蘇氨酸（Thr，59.6 mg/L）、色氨酸（Trp，102.1 mg/L）、酪氨酸（Tyr，90.6 mg/L）和纈氨酸（Val，58.6 mg/L）。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液B（華培貿(mào)易公司和索萊寶科技有限公司，中國(guó)）：分別稱取豆葉氨酸（Pip）、天冬酰胺（Asn）、半胱氨酸（Cys）、茶氨酸（Thea）和谷氨酰胺（Gln）各20 mg，以0.02 mol/L鹽酸定容至10.00 mL，配制成濃度為2000 mg/L的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液B。

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別移取2.00 mL氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液A和0.50 mL儲(chǔ)備液B，以0.02 mol/L鹽酸定容至10.00 mL。

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：使用0.02 mol/L鹽酸溶液，將氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)中間液逐級(jí)稀釋，配得氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1. 2 樣品提取及AQC衍生

稱取粉碎的茶樣0.20 g，加40 mL純水并渦旋混合（IKA MS3 basic，上海芃奇科學(xué)儀器有限公司），室溫下45 kHz超聲提?。↘Q100E，昆山市超聲儀器有限公司）30 min后，在4 ℃下10000 g離心5 min（Heraeus Multifuge X3R，美國(guó)Thermo Scientific公司）;取10.0 μL經(jīng)0.22 μm微孔濾膜（聚四氯乙烯，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）過濾的上清液，與70.0 μL AccQ-Fluor硼酸鹽緩沖液（pH 8.8）混合，加AccQ-Fluor試劑（3000 mg/L）20.0 μL并渦旋，置于55 ℃烘箱中加熱10 min后，冷卻至室溫上機(jī)測(cè)試。

1. 3 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀分析條件

液質(zhì)聯(lián)用儀：Sciex 4500 QTrap質(zhì)譜儀（美國(guó)Sciex公司）配Nexera X2LC-30A高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）。

色譜條件：色譜柱為Waters HSS T3 C18分析柱（1.8 μm，2.1 mm×150 mm）;柱溫40 ℃;流動(dòng)相A：甲酸銨—水溶液（10 mmol/L，pH 6.0）;流動(dòng)相B：乙腈;流速0.3 mL/min。梯度洗脫程序：0～12 min，0% B～20% B;12～16 min，20% B～35% B，16～18 min，35% B～90% B，18～20 min，90% B～5% B。進(jìn)樣量0.5 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離（ESI）源;正離子模式為多反應(yīng)檢測(cè)模式;電噴霧電壓4500 V;氣簾氣壓力0.21 MPa;霧化氣壓力0.38 MPa;輔助氣壓力0.38 MPa;輔助氣溫度550 ℃。各氨基酸的保留時(shí)間、母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能等見表1。

1. 4 方法考察試驗(yàn)

線性范圍、檢出限和定量限：以各氨基酸質(zhì)量濃度為X軸、峰面積為Y軸，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并在線性范圍內(nèi)計(jì)算相關(guān)系數(shù)。按3倍信噪比和10倍信噪比，計(jì)算方法檢出限和定量限。

日內(nèi)重現(xiàn)性：精確稱取5份QC樣品，按1.3方法進(jìn)行制備，在24 h內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

日間重現(xiàn)性：精確稱取5份QC樣品，按1.3方法進(jìn)行制備，平行測(cè)定5次，連續(xù)5 d，計(jì)算RSD。

加標(biāo)回收率：在QC樣品中分別添加低、中、高濃度的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，每個(gè)濃度平行測(cè)定5次，計(jì)算加標(biāo)回收率和RSD。

1. 5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

樣品中氨基酸含量以干基計(jì)，水分含量測(cè)定方法參照GB/T 8304—2013進(jìn)行。采用在線數(shù)據(jù)分析平臺(tái)Metabo Analysis 4.0（https：//www.metaboanalyst.ca/faces/home.xhtml）對(duì)50批次參試樣品的氨基酸定量結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化（log2 Transformation）和歸一化（Pareto scaling）處理，并繪制熱圖，采用偏最小二乘法（PLS-DA）分析氨基酸構(gòu)成（Chong et al.，2018）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 方法學(xué)考察結(jié)果

由圖1可知，采用AQC衍生—液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定氨基酸含量，可在20 min內(nèi)完成定性、定量檢測(cè)35種氨基酸，而參試樣品中未檢測(cè)到β-氨基丁酸、同型半胱氨酸、胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸等5種氨基酸;3組同分異構(gòu)體氨基酸[α-氨基丁酸（10.52 min）、β-氨基丁酸（8.86 min）和γ-氨基丁酸（9.21 min）;1-甲基-L-組氨酸（8.41 min）和3-甲基-L-組氨酸（8.08 min）;亮氨酸（15.16 min）和異亮氨酸（14.95 min）]雖然在質(zhì)譜上無法進(jìn)行區(qū)分，但其在色譜上的保留時(shí)間不同，因此能準(zhǔn)確定量。

各氨基酸的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限、日間重現(xiàn)性、日內(nèi)重現(xiàn)性和加標(biāo)回收率如表1所示，結(jié)果表明，35種氨基酸均顯示出良好的線性關(guān)系，各回歸方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.9900，定量限為2.1×10-6～1.8×10-2 mg/L，檢出限為6.3×10-7～5.5×10-3 mg/L;各種氨基酸的日內(nèi)重現(xiàn)性均≤4.6%，日間重現(xiàn)性≤5.4%;加標(biāo)回收率81.0%～99.9%，RSD≤9.5%。表明該AQC衍生—液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法的準(zhǔn)確度和精密度能夠滿足定量要求。

2. 2 各茶類游離氨基酸的構(gòu)成分析

從圖2可看出，綠茶和黃茶的氨基酸構(gòu)成較接近，表明黃茶的悶黃工藝對(duì)茶葉氨基酸組分影響小;白茶、烏龍茶、紅茶和黑茶的氨基酸構(gòu)成則迥然不同，說明做青、發(fā)酵及渥堆等工藝流程會(huì)對(duì)茶葉的氨基酸組分產(chǎn)生明顯影響。

對(duì)不同茶類的氨基酸構(gòu)成特征進(jìn)行標(biāo)識(shí)（紅色方框），從氨基酸種類及滋味貢獻(xiàn)的角度進(jìn)行剖析（圖2）。1號(hào)框?yàn)辄S茶和綠茶中相對(duì)含量較高的13種氨基酸，其中，有7種氨基酸呈甜味或鮮味，2種呈苦味，該結(jié)果符合綠茶和黃茶甜鮮品質(zhì)屬性特征，因此可將其看作是綠茶和黃茶的氨基酸構(gòu)成特征。2號(hào)框?yàn)榘撞璧?種特征氨基酸，其呈味以鮮味和甜味為主，白茶在氨基酸構(gòu)成種類的豐富程度上雖然不及綠茶和黃茶，但谷氨酰胺和天冬酰胺含量明顯高于其他茶類，而這兩種氨基酸恰好是茶葉中已知的兩種重要呈鮮氨基酸，該結(jié)果從另一側(cè)面說明白茶不同于綠茶和黃茶的鮮味品質(zhì)構(gòu)成物質(zhì)基礎(chǔ)。3號(hào)框是參試烏龍茶（武夷巖茶）的特征氨基酸，包含的6種氨基酸多屬于苦味和甜味氨基酸，未涉及鮮味氨基酸，該氨基酸組合也較好地解釋了武夷巖茶苦澀和厚味為主體的滋味品質(zhì)構(gòu)成，即武夷巖茶中的鮮味氨基酸含量較低。4號(hào)框?yàn)榧t茶的11種特征氨基酸，其中6種為鮮味和甜味氨基酸，2種為苦味氨基酸;尤其是谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸、苯丙氨酸和茶氨酸等重要的鮮味氨基酸含量均較高;與其他茶類氨基酸特征構(gòu)成的橫向?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn)，紅茶與綠茶和黃茶的氨基酸構(gòu)成相對(duì)接近。黑茶（普洱熟茶）的9種特征氨基酸中（5號(hào)框），鮮味氨基酸也較少，主要由苦味和甜味氨基酸構(gòu)成;尤以脯氨酸、組氨酸、亮氨酸和色氨酸的含量高于其他茶類。

為從測(cè)定的氨基酸組分中篩選出對(duì)茶類判別有決定意義的氨基酸種類，采用PLS-DA對(duì)50批次茶樣的氨基酸構(gòu)成進(jìn)行分析，如圖3-A所示，氨基酸的定量結(jié)果經(jīng)降維后，除綠茶和黃茶外，其他茶類均可通過3個(gè)主成分（累積方差為66.5%）實(shí)現(xiàn)茶類區(qū)分;各氨基酸在判別模型中的貢獻(xiàn)程度，依據(jù)變量權(quán)重值（VIP）由高至低如圖3-B所示，共有10種氨基酸（蛋氨酸、苯丙氨酸、肌氨酸、茶氨酸、瓜氨酸、3-甲基-L-組氨酸、精氨酸、色氨酸、組氨酸和1-甲基-L-組氨酸）的VIP值大于1.0，說明這10種氨基酸對(duì)于茶類判定的貢獻(xiàn)大。該分析結(jié)果顯示，可通過對(duì)茶葉氨基酸構(gòu)成的PLS-DA判別分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)茶類氨基酸構(gòu)成的判別分析。

3 討論

游離氨基酸對(duì)茶葉滋味品質(zhì)具有重要貢獻(xiàn)，由于茶葉的水浸出物構(gòu)成復(fù)雜，加之不同種類的游離氨基酸化學(xué)性質(zhì)（極性）差異明顯，從而對(duì)茶葉氨基酸組分的準(zhǔn)確定性定量造成困難。目前，常見的分析方法多集中于測(cè)定茶葉中以蛋白質(zhì)氨基酸為主的20種游離氨基酸和茶氨酸（陳丹等，2014;張丹丹等，2016;鄧代信等，2018）。采用鋰離子交換柱和生理鹽水體系的自動(dòng)氨基酸分析是最常見的能實(shí)現(xiàn)全面氨基酸組分分析方法，該方法雖然在理論上能對(duì)樣品中包括蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)氨基酸在內(nèi)的35種氨基酸進(jìn)行色譜分離和定量（陳然等，2017），但受制于其所使用的光學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)限制約，仍無法獲得茶葉中的諸多低含量氨基酸及其衍生物定量結(jié)果。此外，由于氨基酸在光學(xué)檢測(cè)器上的光譜特征較相似，因此目前主要通過保留時(shí)間進(jìn)行定性，對(duì)于色譜分離困難的同分異構(gòu)氨基酸的準(zhǔn)確定性能力明顯不足（林太鳳等，2015）。張峻松等（2004）采用氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)煙草中的17種氨基酸，需耗時(shí)135 min，檢出限范圍10×10-3～5.5×10-2 mg/L;Sharma等（2014）基于AQC衍生和裝備光學(xué)檢測(cè)器的液相色譜對(duì)煙草中28種氨基酸進(jìn)行測(cè)定的分析時(shí)長(zhǎng)為53 min，檢出限≥0.2 mg/L，定量限≥0.4 mg/L。此外，由于茶葉水提物中多酚絡(luò)合物的存在，簡(jiǎn)單的微孔濾膜過濾難以完全實(shí)現(xiàn)樣品凈化，并極易導(dǎo)致自動(dòng)氨基酸分析儀上的離子交換柱發(fā)生堵塞。

本研究采用AQC衍生—液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中的35種氨基酸，可在20 min內(nèi)完成定性定量檢測(cè)，較傳統(tǒng)的AQC衍生—液相色譜法和自動(dòng)氨基酸分析法極大縮短分析耗時(shí)，氨基酸的檢測(cè)效率得到明顯提高，且定量限在2.1×10-6～1.8×10-2 mg/L，檢出限在6.3×10-7～5.5×10-3 mg/L;日內(nèi)重現(xiàn)性≤4.6%，日間重現(xiàn)性≤5.4%;加標(biāo)回收率81.0%～99.9%，RSD≤9.6%。檢測(cè)過程中，茶葉氨基酸經(jīng)AQC柱前衍生后，極性明顯降低，故能在反相色譜柱上獲得較好的保留;此外，衍生化操作過程使得茶葉樣品的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)一步降低，極大緩解了各種污染問題;再次，質(zhì)譜檢測(cè)器的定性能力，使得對(duì)茶葉中各種氨基酸的定性變得簡(jiǎn)單和可靠，特別是三重四極桿的高靈敏度使得各種微量氨基酸能夠得以準(zhǔn)確定量。該方法極大程度縮短了單個(gè)樣品的分析時(shí)間，使得茶葉氨基酸構(gòu)成的大樣本量分析更容易。

游離氨基酸的絕對(duì)含量和構(gòu)成比例對(duì)茶葉品質(zhì)有重要貢獻(xiàn)（Kaneko et al.，2006）。在本研究中，白茶的游離氨基酸總量明顯高于其他茶類;綠茶和紅茶的游離氨基酸總量間未見明顯差異;而烏龍茶（武夷巖茶）和黑茶的游離氨基酸總量相對(duì)較低，不同茶類游離氨基酸的構(gòu)成對(duì)其品質(zhì)的影響也不盡相同，是造成不同品類茶葉風(fēng)味差別的重要因素（陳丹等，2014;張丹丹等，2016;楊晨，2018）。在本研究涉及的六大類別50批次茶葉樣本中，除了β-氨基丁酸、同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱氨酸和酪氨酸等5種氨基酸未檢出外，其余30種氨基酸的含量均高于方法定量限;統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，綠茶和黃茶的氨基酸構(gòu)成較接近，其他茶類的氨基酸構(gòu)成均呈現(xiàn)出各自的特征，具體表現(xiàn)為綠茶、黃茶和紅茶的鮮味、甜味氨基酸較突出，且分布均衡;白茶則以鮮味氨基酸構(gòu)成最突出;黑茶（普洱熟茶）和烏龍茶（武夷巖茶）中的鮮味氨基酸相對(duì)含量較低，而苦味氨基酸含量較高。現(xiàn)有方法的開發(fā)，使得對(duì)茶葉氨基酸組分構(gòu)成的研究從以往圍繞常量組分和蛋白質(zhì)氨基酸研究為主迅速地拓展至各種微量氨基酸和非蛋白質(zhì)氨基酸研究，由于該方法簡(jiǎn)便、可靠、易行，特別適合用于大量茶葉樣本的分析，通過對(duì)更大數(shù)量樣本和更全面氨基酸構(gòu)成的研究，能進(jìn)一步拓展人們對(duì)茶葉氨基酸組分的認(rèn)識(shí)。

4 結(jié)論

AQC衍生結(jié)合液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用是一種快速、可靠、有效的分析方法，適用于大規(guī)模地對(duì)茶葉中的常量和微量游離氨基酸進(jìn)行準(zhǔn)確定量;對(duì)不同茶類樣本的氨基酸構(gòu)成特征分析顯示，除綠茶和黃茶的氨基酸構(gòu)成較接近外，其余茶類的氨基酸構(gòu)成各具特征，從呈味貢獻(xiàn)角度對(duì)各茶類氨基酸構(gòu)成進(jìn)行分析，能較好地支持和解釋其滋味品質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

陳丹，葉小輝，俞瀅，王丹紅，趙恬歡，葉乃興. 2014. 不同等級(jí)云南紅碎茶的氨基酸組分分析[J]. 福建茶葉，36（4）：24-26. [Chen D，Ye X H，Yu Y，Wang D H，Zhao T H，Ye N X. 2014. Analysis of amino acid composition of different grades of Yunnan red tea[J]. Tea in Fujian，36（4）：24-26.]

陳然，孟慶佳，劉海新，李頌，王春玲. 2017. 不同種類茶葉游離氨基酸組分差異分析[J]. 食品科技，42（6）：258-263. [Chen R，Meng Q J，Liu H X，Li S，Wang C L. 2017. Variance analysis of free amino acid composition in different kinds of tea[J]. Food Science and Technology，42（6）：258-263.]

鄧代信，成凱，劉進(jìn)平，陳正武，喬大河，李忠朝，周紹均，牛素貞. 2018. 古茶樹優(yōu)系品種氨基酸分析[J]. 種子，37（4）：5-10. [Deng D X，Cheng K，Liu J P，Chen Z W，Qiao D H，Li Z C，Zhou S J，Niu S Z. 2018. Analysis of amino acid of the ancient tea tree superior lines[J]. Seed，37（4）：5-10.]

杜穎穎，葉美君，劉相真. 2018. 茶葉中氨基酸分析方法研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)茶葉加工，（3）：15-21. [Du Y Y，Ye M J，Liu X Z. 2018. Advance in analysis methods of amino acids in tea[J]. China Tea Processing，（3）：15-21.]

李梅，楊朝霞，解彬，單連菊，董建軍. 2007. AQC柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定啤酒中的21種游離氨基酸[J]. 色譜，25（6）：939-941. [Li M，Yang Z X，Xie B，Shan L J，Dong J J. 2007. Determination of 21 free amino acids in beer by HPLC with AQC pre-column derivatization[J]. Chinese Journal of Chromatography，25（6）：939-941.]

林太鳳，趙夢(mèng)柯，王妍鳴，李想，宋梓慧，王惠琴，鄭大威. 2015. 氨基酸檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，43（18）：16-19. [Lin T F，Zhao M K，Wang Y M，Li X，Song Z H，Wang H Q，Zheng D W. 2015. Research progress on the detection technology of amino acids[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，43（18）：16-19.]

邵濟(jì)波，唐茜，周曉蘭，韓楠，謝文鋼. 2012. 四川引種安吉白茶主要生化成分分析[J]. 食品科學(xué)，33（16）：179-183. [Shao J B，Tang Q，Zhou X L，Han N，Xie W G. 2012. Major biochemical components in introduced Anji Baicha tea in Sichuan[J]. Food Science，33（16）：179-183.]

王富花. 2018. HPLC分析測(cè)定不同茶葉中的游離氨基酸[J]. 食品研究與開發(fā)，39（1）：141-146. [Wang F H. 2018. Analysis and determination of free amino acids in diffe-rent tea by HPLC[J]. Food Research and Development，39（1）：141-146.]

肖涵，陳圓圓，陳春月. 2018. 不同加工方式茶葉游離氨基酸組分分布特征初探[J]. 昆明學(xué)院學(xué)報(bào)，40（6）：32-37. [Xiao H，Chen Y Y，Chen C Y. 2018. Preliminary study on distribution characteristics of free amino acid components in different processed tea leaves[J]. Journal of Kunming University，40（6）：32-37.]

楊晨. 2018. 基于代謝組學(xué)的不同花色種類白茶滋味品質(zhì)研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院. [Yang C. 2018. Study of the taste quality in different types of white tea based on metabolomics analysis[D]. Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences.]

于榮賢，劉兵，孫政，曹煒. 2017. AQC衍生法測(cè)定洋槐蜜中游離氨基酸含量[J]. 中國(guó)蜂業(yè)，68（12）：45-48. [Yu R X，Liu B，Sun Z，Cao W. 2017. Determination amino acid contents in acacia honey using AQC derivatization[J]. Apiculture of China，68（12）：45-48.]

張丹丹，葉小輝，趙峰，王丹紅，危賽明，鄭德勇，葉乃興. 2016. 基于游離氨基酸組分的白茶滋味品質(zhì)研究[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，31（5）：515-520. [Zhang D D，Ye X H，Zhao F，Wang D H，Wei S M，Zheng D Y，Ye N X. 2016. Flavor and amino acids of brewed white teas[J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences，31（5）：515-520.]

張峻松，賈春曉，李炎強(qiáng)，毛多斌，張文葉. 2004. 煙草中游離氨基酸的自動(dòng)分析儀測(cè)定[J]. 煙草科技，（8）：26-32. [Zhang J S，Jia C X，Li Y Q，Mao D B，Zhang W Y. 2004. Determination of free amino acids in tobacco by automatic ana-lyzer[J]. Tobacco Science &Technology，（8）：26-32.]

朱旗，施兆鵬，童京漢，任春梅. 2001. HPLC檢測(cè)分析速溶綠茶游離氨基酸[J]. 茶葉科學(xué)，21（2）：134-136. [Zhu Q，Shi Z P，Tong J H，Ren C M. 2001. HPLC determination of free amino acids in instant green tea[J]. Journal of Tea Science，21（2）：134-136.]

Alcázar A，Ballesteros O，Jurado J M，Pablos F，Mjesus M，Vilches J L，Navalón A. 2007. Differentiation of green，white，black，Oolong，and Pu-erh teas according to their free amino acids content[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，55（15）：5960-5965.

Castellanos M，Van Eendenburg C V，Gubern C，Sánchez J M. 2016. Ethyl-bridged hybrid column as an efficient alternative for HPLC analysis of plasma amino acids by pre-column derivatization with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate[J]. Journal of Chromatog-raphy B，1029-1030：137-144.

Chong J，Soufan O，Li C，Caraus I，Li S Z，Bourque G，Wishart D S，Xia J G. 2018. MetaboAnalyst 4.0：Towards more transparent and integrative metabolomics analysis[J]. Nucleic Acids Research，46（W1）：486-494.

Ekborg-Ott K H，Taylor A D，Armstrong D W. 1997. Varietal differences in the total and enantiomeric composition of theanine in tea[J]. Journal of Agricultural and Food Che-mistry，45（2）：353-363.

Jemal M，Xia Y Q. 2006. LC-MS development strategies for quantitative bioanalysis[J]. Current Drug Metabolism，7（5）：491-502.

Kaneko S，Kumazawa K，Masuda H，Henze A，Hofmann T. 2006. Molecular and sensory studies on the umami taste of Japanese green tea[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，54（7）：2688-2694.

Sharma G，Attri S V，Behra B，Bhisikar S，Kumar P，Tageja M，Sharda S，Singhi P，Singhi S C. 2014. Analysis of 26 amino acids in human plasma by HPLC using AQC as derivatizing agent and its application in metabolic laboratory[J]. Amino Acids，46（5）：1253-1263.

Wang L，Xu R J，Hu B，Li W，Sun Y，Tu Y Y，Zeng X X. 2010. Analysis of free amino acids in Chinese teas and flower of tea plant by high performance liquid chromatography combined with solid-phase extraction[J]. Food Chemistry，123（4）：1259-1266.

（責(zé)任編輯 羅 麗）