解淀粉芽孢桿菌液體肥在茶葉上的應(yīng)用研究

林斌 黃菊青 官雪芳 鄭炎 徐慶賢 王琦 錢蕾 鄭怡 張臣心 湯銅華 趙孟濤

摘要：【目的】考察解淀粉芽孢桿菌Bacillus Amyloliquefaciens液體肥w208YF施用對(duì)鐵觀音烏龍茶產(chǎn)量、品質(zhì)和茶園土壤相關(guān)指標(biāo)的影響?！痉椒ā坎捎锰镩g小區(qū)試驗(yàn)，設(shè)w208YlF（解淀粉芽孢桿菌液體肥，菌液濃度為4.00×10cfu·mL，使用量100L·hm）和等量清水對(duì)照（cK）2個(gè)處理，重復(fù)4次，進(jìn)行差異性比較?！窘Y(jié)果】w208YF處理的茶葉產(chǎn)量、水浸出物含量和游離氨基酸總量較cK均顯著增加，增幅分別為11.10%、10.60%和8.10%，而茶葉咖啡堿含量則顯著下降，降幅為24.30%;同時(shí)，w208YF的茶園土壤肥力（全氮、堿解氮、有效磷、速效鉀、有機(jī)質(zhì)和腐殖酸含量）及微生物多樣性指數(shù)（shannon、simpson指數(shù)及β多樣性）均明顯優(yōu)于cK?！窘Y(jié)論】施用解淀粉芽孢桿菌液體肥w208YF能夠明顯提升茶園土壤肥力及微生物群落多樣性，并顯著提高茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌;液體肥;茶葉;生化品質(zhì);土壤肥力

中圖分類號(hào)：S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008.0384（2019）10-1173-06

0引言

【研究意義】作為世界上的主要產(chǎn)茶國(guó)，中國(guó)國(guó)內(nèi)茶葉消費(fèi)近年來(lái)快速增加，中國(guó)產(chǎn)業(yè)信息網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示2017年中國(guó)茶葉消費(fèi)量達(dá)到193萬(wàn)t左右，比2015年增長(zhǎng)12.21%。同時(shí)期全球茶葉消費(fèi)量由2015年的500萬(wàn)t增加到2017年的544萬(wàn)t，無(wú)論是從增長(zhǎng)的絕對(duì)值，還是增長(zhǎng)幅度，中國(guó)都已成為全球發(fā)展最快和潛力最大的茶葉市場(chǎng)。施肥是提高茶葉產(chǎn)量、品質(zhì)和茶園可持續(xù)發(fā)展最重要的農(nóng)業(yè)措施之一。近年來(lái)，茶園化肥的盲目使用和不合理的施肥模式引起的茶園生態(tài)環(huán)境問(wèn)題日益凸顯，開(kāi)發(fā)能夠促進(jìn)茶園可持續(xù)發(fā)展的環(huán)保高效肥料，顯得尤為重要與迫切?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前關(guān)于茶葉施肥的研究已有較多報(bào)道，但主要為化肥、有機(jī)肥和豆科綠肥的施用，微生物肥料在茶園中的應(yīng)用報(bào)道較少。Kim等研究表明解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液能夠顯著促進(jìn)西瓜的生長(zhǎng)。周晨光等研究表明解淀粉芽孢桿菌微生物菌劑能夠顯著提高茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)。微生物肥料是活體肥料，是21世紀(jì)的新型肥料，是一種低碳、純天然、無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)污染的微生物菌劑。它主要靠大量有益微生物的生命活動(dòng)代謝來(lái)完成，可提高土壤肥力，增加土壤中有益微生物數(shù)量及活性，改善土壤性狀，防止土壤板結(jié)，提高土壤保肥、保水及抗寒、抗病能力，阻止病原菌入侵，減少植物的病蟲(chóng)害，促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)，提高農(nóng)作物產(chǎn)量，改善和還原農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)等。微生物肥料從形態(tài)來(lái)分有固體和液體兩種。其中液體微生物肥料以其速溶、均勻、即用、能夠噴灌和澆灌以及不易吸濕和結(jié)塊等優(yōu)勢(shì)受到種植行業(yè)的青睞?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】解淀粉芽孢桿菌Bacillus amy-lotiquefaciens是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細(xì)菌，它屬于植物促生菌，具有很強(qiáng)的生命力和定植能力，但尚未見(jiàn)該菌劑對(duì)茶園土壤肥力及微生物多樣性影響的報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究在福建省龍巖市上杭縣蛟潭茶場(chǎng)開(kāi)展試驗(yàn)，探討茶園施用解淀粉芽孢桿菌液體肥對(duì)茶葉產(chǎn)量、品質(zhì)以及茶園土壤肥力和微生物多樣性的影響，為茶園微生物肥料的應(yīng)用及茶葉的可持續(xù)發(fā)展提供參考。

1材料與方法

1.1材料

解淀粉芽孢桿菌W208YF：由本課題組從含腐爛稻草的農(nóng)田土壤中分離篩選得到，該菌株于2016年9月13日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：CGMCC No.13006。

解淀粉芽孢桿菌液體肥W208YF：將解淀粉芽孢桿菌W208接種到LB培養(yǎng)基上，在37°C恒溫?fù)u床中，180r·min振蕩培養(yǎng)24h，制成液體種子;按質(zhì)量體積比為5%的接種量將液體種子接種于發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基（以馬鈴薯淀粉廢水為原料，添加豆粕粉20g·L，調(diào)節(jié)pH值為7.00，在121℃滅菌20min），曝氣，于37%下發(fā)酵72h，在發(fā)酵第24h第一次補(bǔ)充發(fā)酵培養(yǎng)基，補(bǔ)液體積為補(bǔ)充前發(fā)酵液體積的50%，在發(fā)酵第56h第二次補(bǔ)充發(fā)酵培養(yǎng)基，補(bǔ)液體積為補(bǔ)充前發(fā)酵液體積的30%，發(fā)酵72h時(shí)檢測(cè)其含解淀粉芽孢桿菌活菌數(shù)為2.06×10cfu·mL，收集發(fā)酵液，即得解淀粉芽孢桿菌液體肥W208YF。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)地情況：福建省龍巖市上杭縣蛟潭茶場(chǎng)（海拔1000m左右），茶樹(shù)品種為鐵觀音，樹(shù)齡12年。栽植方式為畦栽密植，栽植密度45000～60000株.hm。該茶園基礎(chǔ)土壤肥力：pn為5.80，全氮0.20%，全磷0.03%，全鉀1.12%，堿解氮138.10mg·kg，有效磷106.70mg·kg，速效鉀297.00mg.kg，有機(jī)質(zhì)4.50%，腐殖酸1.71%。

試驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照（CK）和W208YF 2個(gè)處理，重復(fù)4次，每個(gè)處理小區(qū)面積333m。W208YF處理施用解淀粉芽孢桿菌液體肥，使用前用發(fā)酵培養(yǎng)基稀釋50倍（菌液終濃度約為4.00×10cfu·mL），施用量：100L·hm，于2016年8月10日和9月1日分別進(jìn)行葉面噴施和溝施，用量各占50%;空白對(duì)照施用等量清水。

于2016年10月20日按“s”法進(jìn)行布點(diǎn)，沿茶樹(shù)樹(shù)冠滴水線挖30cm的剖面，在剖面上均勻采集土壤250g，取8個(gè)采樣點(diǎn)土壤混合，四分法取500g土樣，采摘按中小開(kāi)面3～4葉新梢并分小區(qū)計(jì)產(chǎn)。統(tǒng)一按鐵觀音做青工藝加工，制成干茶，測(cè)定茶葉品質(zhì)生化成分、茶園土壤肥力和微生物多樣性。

1.2.2茶葉品質(zhì)檢測(cè)

茶葉水浸出物測(cè)定參照《GBT8305-2013茶水浸出物測(cè)定》。

游離氨基酸總量參照《GBT8314-2013茶游離氨基酸總量的測(cè)定》。

茶多酚測(cè)定參照《GBT 8313-2008茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》。

咖啡堿測(cè)定參照《GBT 8312-2013茶咖啡堿測(cè)定》。

1.2.3茶園土壤肥力及微生物多樣性檢測(cè)pH、有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷、速效鉀、全氮、全磷、全鉀，腐殖酸含量分別根據(jù)NY/T 1377-2007、NY/T1121.6_2006、《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析法》、NY/T1121.7-2006、NY/T 889_2004、NY/T 53.1987、NY/T88-1988、NY/T 87-1988、《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析法》進(jìn)行檢測(cè)。茶園土壤微生物檢測(cè)：按試劑盒說(shuō)明書(shū)（FastDNA SPINKitforSoil，美國(guó)MPBIO公司）提取土壤總DNA，采用16S和ITSMiseqPE300測(cè)序平臺(tái)對(duì)16S rDNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序分析，采用QIIME分析軟件分析土壤微生物多樣性。

1.3數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x+SD）表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用Duncan多重比較法，以P<0.05表示組問(wèn)具有顯著差異。

2結(jié)果與分析

2.1施用解淀粉芽孢桿菌液體肥W208YF對(duì)茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)的影響

由表1可看出，與CK相比，W208YF處理茶葉的產(chǎn)量顯著增加（P<0.05），增幅為11.10%。同時(shí)，生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，W208YF處理茶葉的水浸出物含量和游離氨基酸含量均顯著增加（P<0.05），二者相對(duì)于CK的增幅分別為10.60%和8.10%，而咖啡堿含量顯著降低（P<0.05），降低幅度為24.30%，茶多酚含量稍有增加，但差異不顯著（P>0.05），說(shuō)明施用W208YF可顯著優(yōu)化茶葉品質(zhì)生化成分。

2.2施用解淀粉芽孢桿菌液體肥W208YF對(duì)茶園土壤肥力的影響

表2顯示，與CK比，W208YF處理茶園土壤的全氮、堿解氮、有效磷、速效鉀、有機(jī)質(zhì)和腐殖酸含量均顯著增加（P<0.05），增幅分別達(dá)76.30%、81.40%、53.00%、30.50%、81.70%和73.90%，說(shuō)明施用W208YF能夠顯著提高茶園土壤肥力。

2.3施用解淀粉芽孢桿菌液體肥W208YF對(duì)茶園土壤微生物多樣性的影響

土壤微生物是土壤生物的重要組成部分，在土壤結(jié)構(gòu)形成、有機(jī)物質(zhì)分解與轉(zhuǎn)化、營(yíng)養(yǎng)元素循環(huán)與利用、作物生長(zhǎng)和生態(tài)環(huán)境改善、植物病害抑制或拮抗、溫室氣體排放等方面起著重要的作用，是土壤肥力的重要調(diào)控因子和土壤地力的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子之一，可敏感反映土壤質(zhì)量變化、表征土壤有機(jī)質(zhì)代謝旺盛程度，是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的主要指標(biāo)之一。本研究采用16s rDNA法對(duì)茶園土壤微生物進(jìn)行鑒定，采用ACE、Cha01、Shannon和Simpson等指數(shù)來(lái)評(píng)估施用解淀粉芽孢桿菌液體肥W208YF對(duì)茶園土壤微生物多樣性的影響。其中ACE和Cha01表示群落中含有OTU數(shù)目，以估計(jì)群落中實(shí)際存在的物種數(shù)和物種總數(shù)，ACE和Cha01指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高。

表3結(jié)果顯示，施用解淀粉芽孢桿菌液體肥W208YF的茶園土壤微生物群落Shannon及Simpson指數(shù)明顯較CK更高（p<0.05），說(shuō)明施用W208YF可顯著提高茶園土壤微生物群落的豐富度和均勻度。

微生物群落的β多樣性一般可采用有度量多維標(biāo)定法PCoA（Prineipal Coordinate Analysis，主坐標(biāo)分析）法進(jìn)行，該方法將樣品排在一定的空間內(nèi)，可體現(xiàn)出樣品間的空間差異。通過(guò)PCoA法對(duì)CK和W208YF處理（每處理4個(gè)重復(fù)）茶園土壤微生物群落差異進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示。由圖1可看出，W208YF處理與CK能夠明顯的區(qū)分開(kāi)來(lái)，說(shuō)明施用W208YF能夠顯著調(diào)節(jié)茶園土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)。

3討論與結(jié)論

解淀粉芽孢桿菌已被證實(shí)對(duì)多種作物如玉米、小麥、番茄、黃瓜等多種農(nóng)作物均有良好的促生作用，它主要通過(guò)改變土壤營(yíng)養(yǎng)元素的存在形態(tài)或分泌生長(zhǎng)素促進(jìn)作物生長(zhǎng)，改善作物品質(zhì)。本研究通過(guò)自主篩選獲得一株解淀粉芽孢桿菌W208YF，研究表明該菌可顯著增加茶葉產(chǎn)量，顯著提高茶葉水浸出物、游離氨基酸和茶多酚的含量，這與周晨光等報(bào)道的結(jié)果相一致，進(jìn)一步證實(shí)淀粉芽孢桿菌可提高茶葉產(chǎn)量、改善品質(zhì)。另外，與解淀粉芽孢桿菌親緣性極高的枯草芽孢桿菌也被證實(shí)對(duì)可顯著提高茶葉的產(chǎn)量，是否提高茶葉產(chǎn)量是該類菌的共性還有待進(jìn)一步研究。

土壤微生物是土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與循環(huán)的主要驅(qū)動(dòng)力，現(xiàn)有研究表明使用菌肥可以提高土壤的肥力和作物產(chǎn)量，如張姍姍等采用4種不同產(chǎn)家的菌肥施用西藏桃后，顯著提高了桃樹(shù)土壤中機(jī)碳、堿解氮、全氮、速效鉀、速效磷及全磷含量，改善了土壤肥力，提高西藏桃產(chǎn)量和品質(zhì)。楊超才等在植煙土壤中施用枯草芽孢桿菌后，土壤堿解氮、速效磷、土壤有機(jī)質(zhì)含量顯著增加。本研究首次使用解淀粉芽孢桿菌作為菌肥用于茶園，發(fā)現(xiàn)施用菌W208YF液體肥后可顯著提高堿解氮、有效磷、速效鉀、有機(jī)質(zhì)和腐殖酸含量，提高幅度高達(dá)30.50%～81.70%，證實(shí)菌W208YF亦可提高土壤肥力。曾令濤等研究表明解淀粉芽孢桿菌x益生菌的添加活化了土壤養(yǎng)分，增加了土壤細(xì)菌、放線菌、解淀粉芽孢桿菌和熒光假單胞菌數(shù)量，降低了土壤真菌數(shù)量，顯著提高了土壤酶活性。本研究也發(fā)現(xiàn)施用菌W208YF液體肥后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生了顯著的變化，說(shuō)明菌W208YF可顯著調(diào)整土壤原土著微生物的群落結(jié)構(gòu)，形成的新的微生物群落更能驅(qū)動(dòng)土壤N、P、K有效態(tài)的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)有機(jī)質(zhì)的和腐殖酸的轉(zhuǎn)化形成，提高土壤營(yíng)養(yǎng)成分并促進(jìn)鐵觀音茶對(duì)土壤營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，進(jìn)而提高鐵觀音茶的產(chǎn)量和質(zhì)量。

茶葉咖啡堿是茶葉中重要的風(fēng)味物質(zhì)，它通過(guò)興奮中樞神經(jīng)，達(dá)到提神醒腦、興奮心臟等功效，長(zhǎng)期飲用富含咖啡堿的茶葉將使人體對(duì)咖啡堿產(chǎn)生依賴癥，對(duì)人體產(chǎn)生不利影響;美國(guó)、日本等國(guó)家甚至對(duì)茶制品中的咖啡堿的含量進(jìn)行了限量規(guī)定。基于此，為了降低茶葉中咖啡堿的含量，研究人員在優(yōu)化提取工藝降低咖啡堿含量、雜交育種選育、基因工程篩選低含量咖啡堿方面進(jìn)行大量的研究。本研究使用菌W208YF菌肥噴灑茶葉后，發(fā)現(xiàn)茶葉咖啡堿的含量?jī)H為1.18g'hg，顯著低于普通茶葉含量中的2%～5%，與對(duì)照組相比降低幅度高達(dá)24.30%，大大高于周晨光等研究中對(duì)咖啡堿降低6.36%的幅度，提示可通過(guò)施用解淀粉芽孢桿菌W208YF生產(chǎn)出低咖啡堿含量鐵觀音茶葉，為開(kāi)發(fā)適合高血壓等人群飲用的低咖啡堿含量茶制品提供了理想的原料來(lái)源。關(guān)于解淀粉芽孢桿菌降低茶葉咖啡堿機(jī)制尚不清晰，相關(guān)研究有待進(jìn)一步深入。