水稻OsPLATZ14基因啟動子的克隆及表達(dá)分析

陳睿 陳建民 吳明基 楊紹華 胡昌泉

摘要：【目的】研究pOsPLATZl4的結(jié)構(gòu)及時(shí)空表達(dá)模式，對深入研究OsPLATZl4基因功能、了解PLATZ轉(zhuǎn)錄因子在水稻生長發(fā)育進(jìn)程的作用具有重要意義?！痉椒ā坷肂DGP、FPROM及Cister預(yù)測分析pOsPLATZl4大小，以水稻日本晴基因DNA為模板擴(kuò)增pOsPLATZl4;應(yīng)用PlantCARE分析序列中的順序作用元件，構(gòu)建pOsPLATZ14：：GUS載體，轉(zhuǎn)化水稻獲得轉(zhuǎn)基因植株;通過GUs組織化學(xué)染色法分析pOsPLATZl4在水稻中的時(shí)空表達(dá)特征?！窘Y(jié)果】經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得pOsPLATZl4長度為1899bp，該區(qū)域含有光信號、逆境響應(yīng)及激素應(yīng)答等多種順式作用元件。pOsPLATZl4驅(qū)動的GUS報(bào)告基因在水稻種子萌發(fā)期，苗期根、莖、葉，抽穗期的根、莖、葉、花穗、小花、葉夾角、莖結(jié)合部位、根莖過渡區(qū)及成熟期種子均有明顯表達(dá)?！窘Y(jié)論】pOsPLATZl4為組成型啟動子，其下游調(diào)控基因OsPLATZl4可能在水稻生長發(fā)育過程中起重要作用。

關(guān)鍵詞：水稻;PLATZ轉(zhuǎn)錄因子;啟動子pOsPLATZl4;表達(dá)分析;GUs活性

中圖分類號：S511 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）10-1137-07

0引言

【研究意義】PLATZ（又稱PLATZl，plant AT-rich sequence and zinc-binding protein 1）是一種新型植物特異性鋅依賴的轉(zhuǎn)錄因子，在植物次生代謝、應(yīng)激反應(yīng)以及特定細(xì)胞類型的識別等特有的過程中發(fā)揮著重要作用。水稻作為單子葉植物模式植物及重要的糧食作物，擁有15個PLATZ基因（http：//PIntfdb.bio.uni-potsdam.de/v3.0/fam mem php？family id=PLATZ&sp id=OSAI），然而該類基因如何參與水稻生長發(fā)育的進(jìn)程卻知之甚少，研究PLATZ轉(zhuǎn)錄因子的功能及調(diào)控模式，加深了解該類基因的研究具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】PLATZ家族蛋白長度約82個氨基酸，包括C-X2-H-X11.C-X2-C-X（4-5）-C-X2-C-X（3-7）-H-X2-H和C-X2-C-X（10-11）-C-X3-c兩個主要分區(qū)的保守PLATZ結(jié)構(gòu)域，廣泛分布于雙子葉植物、單子葉植物、苔蘚和藻類中。至今為止，僅有少數(shù)PLATZ基因的功能已知。PLATZ轉(zhuǎn)錄因子首次由Nagano等于2001年從豌豆中分離，非特異地結(jié)合到富含A/T序列且負(fù)向調(diào)控基因petE的增強(qiáng)子。Hyun-A等2015年從大豆中分離出AtPLATZl基因，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核且參與滲透脅迫條件下種子發(fā)芽過程。Gonzalez-Morales等2016年利用T-DNA插入敲除AtPLATZl和AtPLATZ2基因功能，證實(shí)這兩基因的表達(dá)可提高種子干燥耐受性，在種子干燥耐受性中發(fā)揮重要作用。Li等2017年克隆和功能解析了FL3（ZmPLATZl2）基因，該基因在胚乳淀粉細(xì)胞中特異表達(dá)，與RNAPIII兩個關(guān)鍵亞基RPC53和TFCl相互作用，參與tRNA和5s rRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而調(diào)控胚乳發(fā)育和儲存物質(zhì)合成。Wang等2018年鑒定并克隆了玉米基因組中的17個PLATZ基因，所有ZmPLATZs均位于細(xì)胞核內(nèi)，普遍參與了RNA聚合酶III（RNAPIII）介導(dǎo)的小分子非編碼RNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。Kim等2018年在擬南芥中克隆新AtPLATZ基因ORESARAl5，其通過促進(jìn)早期細(xì)胞增殖的速度和持續(xù)時(shí)間來促進(jìn)葉片生長，通過GRF/GIF調(diào)節(jié)通路來抑制后期葉片衰老。Wang等2019年圖位克隆并功能鑒定了水稻中的第一個PLATZ基因GL6，該基因通過與rpc53和tfcl相互作用，參與RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄機(jī)制，促進(jìn)幼穗和谷粒的細(xì)胞增殖，對谷粒長度起到積極的控制作用。【本研完切人點(diǎn)】截至目前，水稻尚有14個PLATZ基因功能未知。本文選取OsPLATZl4，從基因啟動子的時(shí)空表達(dá)模式入手解析該基因的功能。啟動子是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的重要順式作用元件，研究OsPLATZl4基因的結(jié)構(gòu)及功能將有助于了解該基因在水稻生長發(fā)育的作用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過構(gòu)建OsPLATZl4啟動子與GUS報(bào)告基因的融合表達(dá)載體pOsPLATZl4，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入野生型日本晴獲得轉(zhuǎn)基因植株。通過GUS組織化學(xué)染色分析該基因的時(shí)空表達(dá)特性，旨在為進(jìn)一步研究OsPLATZl4在水稻生長與發(fā)育中的功能奠定基礎(chǔ)。

2.4OsPLATZl4啟動子在水稻中的表達(dá)特征

以日本晴為陰性對照，同時(shí)取10個Tn代陽性轉(zhuǎn)基因株系及其收種后萌發(fā)進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色分析。分別取種子萌發(fā)期，苗期根、莖、葉，抽穗期的根、莖、葉、花穗、小花、葉夾角、莖結(jié)合部位、根莖過渡區(qū)及成熟期種子進(jìn)行GUS染色，通過組織化學(xué)染色法分析OsPLATZ14啟動子在水稻中的時(shí)空表達(dá)特征（圖5）。結(jié)果顯示種子的萌發(fā)期、幼苗的營養(yǎng)生長期及生殖生長期，轉(zhuǎn)基因植株各部分

3討論

基因功能分析是生物學(xué)熱點(diǎn)研究內(nèi)容。啟動子是基因表達(dá)的重要順式作用元件，研究啟動子的結(jié)構(gòu)及其時(shí)空表達(dá)模式，有助于了解其下游調(diào)控基因的表達(dá)模式及調(diào)控機(jī)制。近年來啟動子分析成為開展基因功能研究的有效途徑之一。啟動子是位于基因5’端上游的DNA序列，目前主要采用生物信息學(xué)對目的片段進(jìn)行預(yù)測，常用的分析預(yù)測軟件如Primer-BLAST、Softberry系列工具、Promoter2.0、BDGP、Cister、Match及AliBaba 2.1等。如何截取合理的長度用于研究，需要綜合多個預(yù)測軟件結(jié)果。本研究利用BDGP、FPROM及Cister等3個預(yù)測平臺分析OsPLATZl4基因啟動子長度約1855bp，結(jié)合特異PCR引物擴(kuò)增最終確定pOsPLATZl4長度為1899bp。

通過PlantCARE分析pOsPLATZl4結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該片段中含有確保下游調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的RNAPII核心啟動子元件TATA-box和CAAT-box之外，還包含多種與植物生長發(fā)育、節(jié)律調(diào)控、逆境脅迫及激素響應(yīng)元件，其中響應(yīng)光信號4類、逆境脅迫2類、激素響應(yīng)5類，暗示該基因可能參與水稻的發(fā)育、代謝和對逆境脅迫響應(yīng)等多種生理過程。pOsPLATZl4驅(qū)動的GUS基因的表達(dá)模式顯示在水稻整個生長過程的各組織中具有較強(qiáng)驅(qū)動力，表明OsPLATZl4參與水稻的生長發(fā)育全過程。

Wang等鑒定了水稻和擬南芥中所有的PLATZ成員，并構(gòu)建了玉米ZmPLATZ的最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹，分析顯示OsPLATZl4與ZmPLATZ3和ZmPLATZ13同源性高，暗示可能對植物的生長發(fā)育具有共同的作用。通過酵母雙雜交試驗(yàn)確定ZmPLATZ3與RNAPIII轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中的兩個關(guān)鍵因子RPC53和TFCl相結(jié)合，ZmPLATZl3與RNAPIII轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中的關(guān)鍵因子TFCl相結(jié)合，表明ZmPLATZ3和ZmPLA.TZl3參與RNAPIII介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。RNAPIII轉(zhuǎn)錄復(fù)合物負(fù)責(zé)小分子RNA的轉(zhuǎn)錄，包括tRNA、5s rRNA、7SLRNA、RNaseP和其他小非編碼RNA，調(diào)控RNA和多種細(xì)胞發(fā)育過程的蛋白質(zhì)合成。由此推測OsPLATZl4極有可能具有類似功能，在水稻的生長發(fā)育中發(fā)揮重要的作用。后續(xù)研究將利用CRISPR/CAS9及酵母雙雜等技術(shù)研究該基因在水稻生長發(fā)育中的功能，以進(jìn)一步了解PLATZ轉(zhuǎn)錄因子家族對水稻的調(diào)控機(jī)理。