無瓣海桑果實提取物對衰老小鼠學習記憶能力的影響及其機制研究

易湘茜 李家怡 杜正彩 高程海 郝二偉 鄧家剛

摘?要：無瓣海桑果實為真紅樹無瓣海桑的果實。研究無瓣海桑果實不同提取物對D-半乳糖所致衰老小鼠學習記憶能力影響及其作用機制。采用Morris水迷宮實驗測量無瓣海桑果實不同提取物對小鼠的學習記憶能力影響，HE染色觀察各組小鼠腦部神經細胞的變化情況，并測定腦組織超氧化物歧化酶（SOD）活力、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力、一氧化氮（NO）含量和單胺氧化酶（MAO）活力。結果表明：與模型組相比，無瓣海桑果實不同提取物處理組小鼠在水迷宮實驗中逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05），目標象限停留時間明顯增加（P<0.05）。無瓣海桑果實不同提取物處理組小鼠腦部神經細胞損傷與模型組相比明顯減少，小鼠腦部SOD酶活力和GSH-Px酶活力提高（P<0.05），NO含量和MAO活力在腦部顯著降低（P<0.05）。無瓣海桑果實不同提取物對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶能力有改善作用，無瓣海桑果實不同提取物通過提高小鼠腦內源抗氧化酶（SOD、GSH-Px）活力，降低腦部NO含量和MAO活力來提高D-半乳糖致衰老小鼠的學習記憶能力。

關鍵詞：無瓣海桑果實， D-半乳糖， 學習記憶能力， 神經細胞， 抗氧化活性

中圖分類號：Q946， R285.5

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2019）11-1534-07

Abstract：To study the effects and mechanism of different extracts of Sonneratia apetala fruit on learning and memory abilities of aging mice induced by D-galactose， the learning and memory abilities of mice were measured by Morris Water Maze Test and the changes of brain nerve cells were observed by HE staining. The activities of superoxide dismutase（SOD） and glutathione peroxidase（GSH-Px） ， nitric oxide（NO） content， and monoamine oxidase（MAO） activity in brain tissue were measured. The results showed that compared with the model group， the escape latency of the mice treated with different extracts from the S. apetala fruit was significantly shorter than that of the model group（P<0.05）， and the residence time of the target quadrant was significantly increased（P<0.05） in the water maze experiment. Compared with the model group， the brain nerve cell injury of the mice treated with different extracts was significantly decreased， and the activities of SOD and GSH-Px in the brain of the mice were increased significantly（P<0.05）. The content of NO and the activity of MAO in the brain decreased significantly（P<0.05）. Different extracts of S. apetala fruits can improve the learning and memory abilities of aging mice induced by D-galactose. Different extracts of S. apetala fruits may reduce the damage of nerve cells in the brain of aging mice and increase the endogenous antioxidant enzymes（SOD， GSH-Px） activity， decreased brain NO content and MAO activity， which can increase learning and memory in aging mice.

Key words：Sonneratia apetala fruit， D-galactose， learning and memory， nerve cells， antioxidant capacity

衰老是生命過程中不可抗拒的自然規(guī)律，衰老發(fā)生的重要表現(xiàn)之一就是機體抗氧化能力下降（Wickens， 2001）。在衰老過程中，隨著機體年齡的增長，體內自由基增多，由其誘導的有害物質增加、機體防御能力下降、抗氧化能力減弱（張丁等， 2002）。腦是機體衰老過程中最突出的器官，腦部衰老的過程中腦組織會發(fā)生一系列的變化，包括腦部神經細胞減少，腦萎縮，抗氧化能力下降等（黃華等， 2010）。因此，尋找抗氧化活性強的成分是延緩衰老研究的重要工作之一。

紅樹生長在熱帶和亞熱帶沿海潮間帶區(qū)域，是海洋植物的重要組成部分。紅樹生存環(huán)境具有高鹽、強光照、根部長期缺氧的特異性。因此，為了抵抗這種逆境，大部分紅樹植物的根莖葉花果均有抗氧化活性。正紅樹（Rhizophora apiculata）和老鼠勒（Acanthus ilicifolius）根的正丁醇萃取物富含多酚和黃酮，能夠抑制DPPH（2，2-二苯代苦味肼基自由基清除法）和ABTS[2，2-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽]自由基及小鼠腦部氧化應激（Asha et al.， 2012）。美洲紅樹（Rhizophora mangle）莖的正丁醇提取物能影響小鼠胃組織中SOD 酶（超氧化物歧化酶）、GPx（谷胱甘肽過氧化物酶）和GR 活性，提升GSH（谷胱甘肽）水平、降低LPO（過氧化脂）水平（de-Faria et al.， 2012）。海漆（Excoecaria agallocha）莖中獲得的12-deoxyphorbol 13-（3E，5E-decadienoate）能抑制鼠腦細胞膜的氧化應激（Erickson et al.， 1995）。

無瓣海桑（Sonneratia apetala）為海桑科海桑屬喬木，原產孟加拉國，20世紀80年代引入中國，目前廣泛分布在我國海南、廣西、廣東、福建和臺灣等省（區(qū)）（王瑞江等， 2002）。無瓣海桑果實可食用，可制成果酒，含有大量的氨基酸、總酚、花青素等（林海生和宋文東， 2009; 林海生等， 2009; Patra et al.， 2015）。曹雷雷等（2015）從新鮮無瓣海桑果實分離得到16個化合物，其中包含新化合物蘋果酸乙基正丁基酯。孟加拉國民間用無瓣海桑的果實治療扭傷（Ganguly & Sincar，1974）。目前，中國國內的無瓣海桑果實還處于自生自滅狀態(tài)，造成海洋生物資源的巨大浪費。因此，為了促進無瓣海桑果實的開發(fā)利用，作者開展過多層次的研究，曾經證實無瓣海桑果實提取物具有很強的體外清除自由基能力（易湘茜等，2017）。為了進一步驗證無瓣海桑果實提取物在體內抗氧化應激活性，采用D-半乳糖致衰老模型，深入研究無瓣海桑果實提取物對衰老小鼠的學習與記憶能力及抗氧化應激活性影響，探討其作用機制，為無瓣海桑果實的更深一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1?材料與方法

1.1 實驗動物

雌性昆明小鼠108只，體重18～22 g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK桂2014-0002。常規(guī)飼養(yǎng)在動物房內，溫度為23 ℃，濕度為45%～55%，自然光線下養(yǎng)殖，晝夜比為12 h/12 h，自由進食、進水。

1.2 無瓣海桑果實醇提物及不同極性提取物制備

果實采自廣西茅尾海自治區(qū)級紅樹林自然保護區(qū)，經廣西北部灣海洋研究中心許銘本工程師鑒別為海?？坪Ｉ贌o瓣海桑（Sonneratia apetala）果實。摘取新鮮的無瓣海桑果實，用95%乙醇浸泡減壓濃縮后得到乙醇提取物（S. apetala fruit ethanol extract，SEE），并依次采用乙酸乙酯、正丁醇萃取得到乙酸乙酯提取物（S. apetala fruit ethyl acetate extract，SEAE）和正丁醇提取物（S. apetala fruit butanol extract，SBE），減壓濃縮，真空冷凍干燥后備用。

1.3 主要試劑與儀器

試劑：D-半乳糖、水溶性維生素E（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為D8310、ST9160）;蘇木素、伊紅、中性樹脂（BIOSWAMP公司，批號分別為PAB180015、PAB180016、PAB180017）;超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、一氧化氮（NO）、單胺氧化酶（MAO）試劑盒（南京建成生物工程公司，批號分別為20170214、20170220、20170224、20170213）。

儀器：Infinite 200酶標儀（奧地利TECAN公司）、ST16R臺式高速冷凍離心機（德國Thermo公司）、HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）、Carry 100紫外分光光度計（美國瓦里安公司）、DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）、CX41正置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）、RM2235石蠟切片機（徠卡顯微系統(tǒng)有限公司）、TB-718D石蠟包埋機（湖北泰維科技實業(yè)有限公司）。

1.4 動物分組、衰老模型建立及給藥

適應環(huán)境3～5 d后將小鼠按體重隨機分成空白組、模型組、陽性組（水溶性維生素E，VE 100 mg·kg-1）、SEE高劑量組（SEE-H，250 mg·kg-1）、SEE低劑量組（SEE-L，125 mg·kg-1）、SEAE高劑量組（SEAE-H，76 mg·kg-1）、SEAE低劑量組（SEAE-L，38 mg·kg-1）、SBE高劑量組（SBE-H，19 mg·kg-1）、SBE低劑量組（SBE-L，9.5 mg·kg-1），每組12只小鼠。除空白組外，其余各組小鼠每只每日皮下注射D-半乳糖溶液，劑量為120 mg·kg-1 ，連續(xù)注射13周誘導小鼠建立衰老模型，空白組注射等量生理鹽水。第8周開始灌胃給藥，連續(xù)灌胃42 d?？瞻捉M和模型組灌胃等量生理鹽水，灌胃量為20 mL·kg-1。實驗結束后脫臼處死小鼠，采集樣本測定相關指標。

1.5 Morris水迷宮實驗

實驗結束前5天進行Morris水迷宮實驗，前4天進行定位航行訓練，每天在固定時間段內訓練4次，每次一個象限，將小鼠面向池壁，依次從四個象限入水點放入水中，記錄每只小鼠在60 s內找到平臺的時間（逃避潛伏期），如60 s內未能找到平臺則對其進行引導，并在平臺上停留10 s，逃避潛伏期為60 s。第5天進行空間探索實驗，撤去平臺，記錄每只小鼠進行原平臺所在區(qū)域的次數(shù)，以衡量小鼠對水迷宮記憶的獲取能力。

1.6 衰老小鼠腦部形態(tài)學觀察

每組隨機選取兩只小鼠脫臼處死，冰上取腦，用預冷生理鹽水沖洗除去表面血液，濾紙吸干水分后用4%多聚甲醛溶液固定，制備病理組織切片，采用HE染色對大腦組織神經細胞進行觀察，委托武漢華聯(lián)科生物技術有限公司進行。

1.7 組織制備及指標測定

脫臼處死小鼠，冰上取出大腦，并用預冷的生理鹽水漂洗除去血液，用濾紙吸干水分后將腦組織移入燒杯中，用勻漿器將其勻漿，生理鹽水稀釋制備成10 %組織勻漿，按試劑盒說明書檢測腦組織SOD酶活力、GSH-Px酶活力、NO含量和MAO活力。

1.8 統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析及LSD檢驗。P<0.05時表示具有統(tǒng)計學差異。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差。

2?結果與分析

2.1 各組小鼠Morris水迷宮實驗結果

結果如表1所示，與空白組相比，模型組小鼠的逃避潛伏期顯著延長（P<0.01），模型組小鼠的穿越平臺次數(shù)減少（P<0.01），表明D-半乳糖致衰老小鼠的學習記憶能力顯著下降，衰老模型建立成功。與模型組相比，SEE-H組小鼠的逃避潛伏期隨著訓練時間的增長逐漸縮短，穿越次數(shù)顯著增加，與模型組具有顯著性差異（P<0.01）。SEAE-H和SEAE-L組小鼠的逃避潛伏期與模型組相比均具有顯著性差異（P<0.01），SEAE-H和SEAE-L組均能有效增加衰老小鼠穿越平臺次數(shù)（P<0.01），效果接近空白組。

2.2 各組小鼠腦部形態(tài)學觀察

研究表明，當機體出現(xiàn)衰老時，腦部將出現(xiàn)不同程度的萎縮、死亡（姜秀梅等，2016）。由圖1可知，空白組小鼠腦部神經細胞排列緊湊、細胞結構清晰。模型組小鼠腦部神經細胞出現(xiàn)大量深染、細胞壞死數(shù)量多，表明給小鼠連續(xù)皮下注射D-半乳糖造成腦部萎縮壞死。陽性組小鼠腦部有少量壞死細胞出現(xiàn)、神經細胞結構清晰，表明VE能有效改善衰老小鼠神經細胞壞死情況。SEE-H組小鼠腦部壞死細胞數(shù)量少、細胞結構清晰。SEE-L組小鼠腦部有少量壞死細胞出現(xiàn)、細胞排列緊湊，表明SEE能有效改善衰老小鼠的腦部神經細胞損傷，其中高劑量效果優(yōu)于低劑量效果。SEAE-H組小鼠腦部神經細胞結構清晰、壞死細胞數(shù)量少。

SEAE-L組小鼠腦部神經細胞排列整齊、結構清晰，表明SEAE能有效預防衰老導致的腦部神經細胞壞死。SBE-H組小鼠腦部神經細胞間隙偏大、細胞輪廓清晰，SBE-L組小鼠腦部出現(xiàn)少量壞死神經細胞、排列緊湊，表明SBE能有效保護衰老小鼠腦部細胞、緩解由D-半乳糖造成的腦部萎縮，且高劑量效果優(yōu)于低劑量效果。

2.3 各組小鼠腦組織抗氧化系統(tǒng)指標測定結果

實驗結果如表2所示，與空白組相比，模型組小鼠腦部SOD、GSH-Px酶活力顯著降低（P<0.01），NO含量和MAO活力顯著升高（P<0.01），表明對模型組小鼠連續(xù)注射D-半乳糖后，小鼠腦部有害物質積累量增多、抗氧化能力下降，模型建立成功。與模型組相比，陽性組小鼠腦部SOD、GSH-Px酶活力顯著增加（P<0.01），NO含量和MAO活力顯著減少（P<0.01），表明VE能有效改善衰老小鼠腦部抗氧化能力。與模型組相比，SEE-H組和SEE-L組小鼠腦部SOD、GSH-Px酶活力顯著升高（P<0.01），MAO活力顯著減少（P<0.01），NO含量SEE-H組顯著減少（P<0.01），SEE-L組減少（P<0.05），表明SEE能有效提高衰老小鼠腦部抗氧化能力，且高劑量效果優(yōu)于低劑量效果。與模型組相比，SEAE-H組NO含量和MAO活力顯著減少（P<0.01），SEAE-L組小鼠腦部SOD酶活力顯著升高（P<0.01），NO含量和MAO活力顯著下降（P<0.01），表明SEAE能有效減少衰老小鼠腦部氧化應激有害產物，低劑量效果優(yōu)于高劑量效果。與模型組相比，SBE-H組小鼠腦部SOD、GSH-Px酶活力顯著升高（P<0.01），NO含量和MAO活力顯著降低（P<0.01），SBE-L組小鼠腦部NO含量和MAO活力顯著降低（P<0.01），表明SBE能有效降低衰老小鼠腦部氧化應激有害物質累積、提高腦部抗氧化能力，抗氧化能力與給藥濃度呈一定的量效關系。

3?討論與結論

衰老是生物體隨著時間的推移所帶來的一種自發(fā)的必然過程，它是復雜的自然現(xiàn)象，表現(xiàn)為各器官組織結構逐漸退化，生理生化功能減退，適應性、抵抗力和自穩(wěn)機能下降。目前，用于研究衰老和癡呆的動物模型很多，給小鼠慢性注射D-半乳糖已成為一種常見的模擬衰老動物模型的方法，小鼠長期注射D-半乳糖后， 毛發(fā)枯黃無光，行動遲緩，學習記憶能力下降，模型組小鼠腦部SOD、GSH-Px酶活力顯著降低，NO含量和MAO活力顯著升高。陽性對照水溶性維生素E能顯著改善上述指標， 表明研究所建立的衰老模型是成功的。

生物體在新陳代謝過程中會不斷產生各種自由基，引起體內代謝紊亂，導致各種疾病產生，加速人體衰老。因此，產生了自由基致衰老學說。在衰老機制研究中，自由基學說認為在機體衰老過程中，隨著年齡的增長，機體防御能力下降、有害物質增多、氧化失衡、自由基在體內大量增多（劉靜等，2016）。SOD和GSH-Px是機體內源抗氧化酶，對清除氧自由基，防止氧自由基破壞細胞的組成、結構和功能，保護細胞免受氧化損傷具有十分重要的作用（陳洪燕等，2017;張悅等，2006）。SOD 活性卻隨年齡的增加而降低，其活性與物種的壽命呈正相關。MAO是常用的衰老指示酶，其含量和活力與衰老呈正相關關系（馬志虎，2010;王潔，2010）。NO 是一種重要的細胞間和細胞內信使以及新的神經遞質。NO可以為介導神經元對興奮性氨基酸的反應和增強機體學習記憶能力等。隨著年齡增長，中樞神經系統(tǒng)中的NO合成減少。

本研究通過D-半乳糖建立衰老小鼠模型來研究無瓣海桑果實不同提取物對衰老小鼠的學習記憶影響及其作用機制。實驗結果表明，無瓣海桑果實不同提取物均可以有效地提高衰老小鼠的學習與記憶能力，縮短衰老小鼠Morris水迷宮實驗的逃避潛伏期，并延長其在目標象限的停留時間（P<0.05），同時可以緩解衰老造成的腦部萎縮、死亡。通過對小鼠腦部的檢測進一步發(fā)現(xiàn)無瓣海桑果實能夠提高衰老小鼠腦部SOD和GSH-Px酶活力，降低NO含量和MAO活力（P<0.05）。以上實驗結果表明無瓣海桑果實不同提取物可能是通過減輕衰老小鼠腦部神經細胞損傷，提高內源抗氧化酶（SOD、GSH-Px）活力，降低腦部NO含量和MAO活力來提高D-半乳糖致衰老小鼠的學習記憶能力。無瓣海桑果實的粗體物中含有總酚和花青素等酚類成分。酚類化合物是植物的次生代謝產物，其抗氧化、抗菌、抗衰老等生物活性已成為醫(yī)學、食品、日用化工等領域的研究熱點。曹雷雷等（2015）也從新鮮無瓣海桑果實分離鑒定了8個酚酸類單體化合物。因此，推測是無瓣海桑果實中的酚酸類成分起到了提高D-半乳糖致衰老小鼠的學習記憶能力。但是，具體是何種酚酸類單體化合物起到主要作用，還需要進一步深入研究。

參考文獻：

ASHA KK， MATHEW S， LAKSHMANAN PT， 2012. Flavonoids and phenolic compounds in two mangrove species and their antioxidant property[J]. Ind J Geo-Mar Sci， 41（3）： 259-264.

CAO LL， TIAN HY， WANG YS， et al.， 2015. Chemical constituents in the fruits of mangrove plant Sonneratia apetala Buch. Ham[J]. J Trop Oceanogr， 34（1）：77-82.[曹雷雷， 田海妍， 王友紹， 等， 2015. 紅樹植物無瓣海桑果實的化學成分研究[J]. 熱帶海洋學報， 34（1）：77-82.]

CHEN HY， AO MZ， XIONG YT， 2017. Experimental study on anti-aging effect of Fengmianning capsule on D-galactose mice[J]. Lishizhen Med Mat Med Res， 28（1）：84-85.[陳洪燕， 敖明章， 雄義濤， 2017. 蜂眠寧膠囊對D-半乳糖小鼠抗衰老作用的實驗研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥， 28（1）：84-85.]

DE-FARIA FM， ALMEIDA ACA， LUIZ-FERREIRA A， 2012. Antioxidant action of mangrove polyphenols against gastric damage induced by absolute ethanol and ischemia-reperfusion in the rat[J]. Sci World J：1-9.

ERICKSON KL， BEUTLE JA ， CARDELLINA JH， et al.， 1995. A novel phorbol ester from Excoecaria agallocha [J]. J Nat Prod， 58（5）：769-772.

HUANG H， 2010. Effects of total saponins of Gynostemma pentaphyllum on brain senescence in mice induced by D-galactose[D]. Jinan：Shandong Normal University：24.[黃華， 2010. 絞股藍總皂苷對D-半乳糖致衰小鼠延緩腦部衰老作用的實驗研究[D]. 濟南：山東師范大學：24.]

JIANG XM， XU XL， YIN YM， et al.， 2016. Effects of Flammulina velutipes polysaccharide on antioxidant capacity of brain in aging mice[J]. Chin J Gerontol， 36（23）：5797-5799.[姜秀梅， 徐小磊， 殷一民， 等， 2016. 金針菇多糖對衰老小鼠大腦抗氧化能力的影響[J]. 中國老年學雜志， 36（23）：5797-5799.]

LIN HS， SONG WD， 2009. Determination and analysis of amino acids in leaves and fruits of valveless sea mulberry fruit[J]. Amino Acids Biol Resour， 31（2）：76-78.[林海生， 宋文東， 2009. 無瓣海桑葉子和果實中氨基酸成分的檢測分析[J]. 氨基酸和生物資源， 31（2）：76-78.]

LIN HS， SONG WD， WU J， et al.， 2009. Detection and analysis of fatty acids in leaves and fruits of valveless sea mulberry fruit[J]. Fujian Anal Test，18（3）：5-9.[林海生， 宋文東， 吳婕， 等， 2009. 無瓣海桑葉子和果實中脂肪酸成分的檢測分析[J]. 福建分析測試， 18（3）：5-9.]

LIU J， ZHAO HX， YUAN D， et al.， 2016. Advances in the study of the anti-aging effect of Ligustrum lucidum and its active components[J]. Lishizhen Med Mat Med Res， 27（12）：2974-2977.[劉靜， 趙海霞， 袁丁， 等， 2016. 女貞子及其有效成分延緩衰老作用的研究進展[J]. 時珍國醫(yī)國藥， 27（12）： 2974-2977.]

MA ZH， 2010. Studies on supercritical CO2 extraction and bioactivity of lutein from Trichosanthes kirilowii seed oil and peel of Trichosanthes kirilowii[D]. Nanjing：Nanjing Agricultural University：17.[馬志虎， 2010. 栝樓籽油和栝樓果皮葉黃素的超臨界CO2萃取及生物活性研究[D]. 南京：南京農業(yè)大學：17.]

PATRA JK， DAS SK， THATOI H， 2015. Phytochemical profiling and bioactivity of a mangrove plant， Sonneratia apetala， from Odisha Coast of India[J]. Chin J Integr Med， 21（4）： 274-285.

WANG RJ， CHEN ZY， 2002. Phylogeny and geographical distribution of Hymenaceae[J]. Guihaia， 22（3）：214-219.[王瑞江， 陳忠毅， 2002. 海桑科的系統(tǒng)進化及地理分布[J]. 廣西植物， 22（3）：214-219.]

WANG J， 2010. Effect of low deuterium water on anti-oxidation of D-galactose induced aging model mice[D]. Shanghai：Second Military Medical University：53.[王潔， 2010. 低氘水對D-半乳糖致衰老模型小鼠抗氧化作用的研究[D]. 上海：第二軍醫(yī)大學：53.]

WICKENS AP， 2001. Ageing and the free radical theory[J]. Resp Physiol，128（3）：379-391.

YI XX， LI JY， GAO CH， et al.， 2017. Antioxidation activity of ethanol extract and its different polar extracts from valveless sea mulberry fruit[J]. Food Ind Sci Technol， 38（19）：27-30.[易湘茜， 李家怡， 高程海， 等， 2017. 無瓣海桑果實乙醇提取物及其不同極性萃取物抗氧化活性[J]. 食品工業(yè)科技， 38（19）：27-30.]

ZHANG D， ZHANG J， MENG G， et al.， 2002. Effects of compound antioxidants on lipid peroxidation and survival of Drosophila melanogaster in mice[J]. Chin J Food Hyg， 14（5）：3.[張丁， 張杰， 孟光， 等， 2002. 復合抗氧化劑對小鼠脂質過氧化及果蠅生存期的影響[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志， 14（5）：3.]

ZHANG Y， YUAN LJ， 2006. Effects of propolis flavonoids on SOD， GSH-Px， MDA in rat brain[J]. Prog Mod Biomed， 6（10）： 62-63.[張悅， 袁麗杰， 2006. 蜂膠黃酮對小鼠腦SOD、GSH-Px、MDA的影響[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展， 6（10）：62-63.]