二氫丹參酮對(duì)人非霍奇金淋巴瘤Raji細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制

陳亮 董長(zhǎng)城

摘要?目的：探究二氫丹參酮對(duì)人非霍奇金淋巴瘤Raji細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)人非霍奇金淋巴瘤Raji細(xì)胞，并分為空白組和低/高劑量組，低/高劑量組以8、15 μmol/L二氫丹參酮處理，空白組以等量0.9%氧化鈉注射液處理。用CCK-8法檢測(cè)Raji細(xì)胞成活率，Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組Raji細(xì)胞凋亡情況，試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中Caspase 8活性，免疫熒光法檢測(cè)Raji細(xì)胞中CytC移位情況，蛋白免疫印跡法檢測(cè)Raji細(xì)胞中Bad、Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果：低/高劑量組藥物干預(yù)24、48 h后細(xì)胞成活率及增殖指數(shù)低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。干預(yù)48 h后，低/高劑量組Raji細(xì)胞凋亡率、Caspase 8活性及CytC表達(dá)量高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與空白組比較，低/高劑量組Bad蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Bax蛋白表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：二氫丹參酮可有效抑制人非霍奇金淋巴瘤Raji細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，其作用機(jī)制與上調(diào)Caspase8的表達(dá)，誘導(dǎo)Bad表達(dá)有關(guān)，且呈劑量依賴性。

關(guān)鍵詞?非霍奇金淋巴瘤;二氫丹參酮;增殖;凋亡;機(jī)制

Effects of Dihydrotanshinone on Proliferation and Apoptosis of Human Non-Hodgkin′s Lymphoma Raji Cells and its Mechanism

Chen Liang， Dong Changcheng

（Steel Hospital of Baotou City， Baotou 014010， China）

Abstract?Objective：To investigate the effects of dihydrotanshinone on proliferation and apoptosis of human non-Hodgkin lymphoma Raji cells and its mechanism.Methods：Raji cells of human non-Hodgkin′s lymphoma were cultured in vitro and divided into a blank group and a low/high dose experimental group.The experimental group was treated with 8， 15 μmol/L dihydrotanshinone， and the blank group was treated with 0.9% NaCL.CCK-8 method was used to detect the survival rate of Raji cells， and Annexin V-FITC/PI double-staining flow cytometry was used to detect the apoptosis of Raji cells in each group.Caspase 8 activity was detected by kit， and Cytc translocation in Raji cells was detected by immunofluorescence， and Bad and Bax protein expression in Raji cells was detected by Western blotting.Results：The cell viability and proliferation index of low/high dose experimental group were lower than those of the blank group after 24 and 48 hours of drug intervention（P<0.05）.After 48 hours of intervention， Raji cell apoptosis rate， Caspase 8 activity and Cytc expression in the low/high dose experimental group were higher than those in the blank group（P<0.05）.WB detection showed that compared with the blank group， the expression of Bad protein in the low/high dose experimental group increased（P<0.05）， and the expression of Bax protein had no significant difference（P>0.05）.Conclusion：Dihydrotanshinone can effectively inhibit the proliferation and induce apoptosis of Raji cells in non-Hodgkin′s lymphoma， and its mechanism is related to up-regulation of Caspase 8 expression and Bad expression， and with dose-dependence.

Key Words?Human non-Hodgkin′s lymphoma; Dihydrotanshinone; Proliferation; Apoptosis; Mechanism

中圖分類號(hào)：R284;R733文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.023

非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin′s Lymphoma，NHL）是惡性淋巴瘤（Malignant Lymphoma，ML）的一種，占比達(dá)85%～90%，是一種具有高度侵襲性的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，疾病進(jìn)展迅速，較早發(fā)生遠(yuǎn)處擴(kuò)散和結(jié)外侵襲，而單純化療治療效果不佳[1-2]。從中草藥資源中尋找新的活性化合物，提高患者的化療敏感性、改善患者預(yù)后生命質(zhì)量是目前臨床研究的熱點(diǎn)。二氫丹參酮屬于菲醌類脂溶性化合物，其抗菌活性顯著，且近年來(lái)研究報(bào)道，其可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，但與丹參其他生物學(xué)有效成分隱丹參酮、丹參酮Ⅰ及丹參酮ⅡA等比較，抗腫瘤研究尚處于早期階段，且在NHL方面的抗腫瘤效應(yīng)研究尚不多見(jiàn)[3-4]。本研究重點(diǎn)探討二氫丹參酮對(duì)人NHL Raji細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?細(xì)胞株?人NHL Raji細(xì)胞，由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院饋贈(zèng)。

1.1.2?試劑與儀器

主要試劑：二氫丹參酮（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：YY90060）純度98%;胎牛血清（杭州四季青公司，批號(hào)：08040502）;RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：AE24464298）;AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20170601）;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-8）檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物公司，批號(hào)：BC3880）;Bad、Bax抗體（美國(guó)Bioworld公司，批號(hào)：AB008、AB009）等。

主要儀器：SHEL-LAB2300型CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)SHELDON公司產(chǎn)品;LXJ-II型超低溫高速離心機(jī)，上海領(lǐng)成生物科技有限公司;IX71型熒光倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品;Elx800酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek公司產(chǎn)品;DY-A型穩(wěn)壓電泳儀，上海西巴斯公司;JY-ZY5型蛋白凝膠電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，美國(guó)Bio Rad公司產(chǎn)品等。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備

將Raji細(xì)胞采用含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d離心換液，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究[5]。

1.2.2?給藥方法

消化細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL，接種于96孔板中，分為空白組和低/高劑量組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，低/高劑量組以8、15 μmol/L二氫丹參酮處理，空白組以等量0.9%氧化鈉注射液處理。

1.2.3?檢測(cè)指標(biāo)與方法

CCK-8法檢測(cè)Raji細(xì)胞成活率：培養(yǎng)24、48 h后取出96孔培養(yǎng)板，每孔加10 μLCCK-8工作液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，以酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值（OD450 nm），計(jì)算細(xì)胞成活率=（組OD平均值/空白組OD平均值）×100%，重復(fù)3次檢測(cè)[6]。

Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組Raji細(xì)胞凋亡情況：于295 μL細(xì)胞懸液中加入Annexin V-FITC 5 μL，加入10 μL 10 μg/mL的碘化丙啶（PI），4 ℃避光反應(yīng)15 min，加入200 μL 4 ℃緩沖液，應(yīng)用Nex-in程序在guava easy Cyte8微流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)Raji細(xì)胞周期及凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算增殖指數(shù)=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）[7]。

Raji細(xì)胞內(nèi)Caspase 8活性檢測(cè)：收集作用48 h后的Raji細(xì)胞，裂解細(xì)胞后收集上清。測(cè)定上清中蛋白濃度，采用Caspase-8試劑盒檢測(cè)上清中Caspase-8含量，405 nm處測(cè)定各組細(xì)胞的吸光度值。

免疫熒光法檢測(cè)Raji細(xì)胞中細(xì)胞色素C（CytC）移位情況：取培養(yǎng)于蓋片上生長(zhǎng)融合至95%左右的Raji細(xì)胞，4%甲醛固定，分別經(jīng)DAPI、mitotracker Red CMXRos及綠色熒光標(biāo)記后的CytC抗體孵育染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察Raji細(xì)胞中CytC蛋白移位情況[8]。

蛋白免疫印跡法檢測(cè)Raji細(xì)胞中Bad、Bax蛋白表達(dá)：收集干預(yù)后48 h細(xì)胞，并提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，參照相關(guān)文獻(xiàn)[7]檢測(cè)方法檢測(cè)Raji細(xì)胞中Bad、Bax蛋白條帶積分吸光度值[9]。

1.3?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?各組Raji細(xì)胞形態(tài)及增殖情況比較

正常組Raji細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，貼壁生長(zhǎng)，組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，立體感較差，大量細(xì)胞出現(xiàn)圓縮，間隙增加，可見(jiàn)部分細(xì)胞碎片。干預(yù)24 h后，空白組和低/高劑量組Raji細(xì)胞成活率分別為（99.42±0.13）%，（86.34±4.45）%，（78.56±9.73）%，干預(yù)48 h后，空白組和低/高劑量組Raji細(xì)胞成活率分別為（98.46±0.21）%，（66.47±6.45）%，（48.55±4.43）%，低/高劑量組干預(yù)24、48 h細(xì)胞活率及增殖指數(shù)均低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2?各組Raji細(xì)胞凋亡情況及Caspase-8活性比較

干預(yù)48 h后，低/高劑量組Raji細(xì)胞凋亡率高于空白組，且高劑量組高于低劑量組（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.3?Raji細(xì)胞中Caspase 8活性及細(xì)胞色素C（CytC）表達(dá)情況

干預(yù)48 h后，低/高劑量組Raji細(xì)胞Caspase 8活性均高于空白組，且高劑量組高于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。低/高劑量組Raji細(xì)胞CytC表達(dá)量高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖1。

2.4?各組Raji細(xì)胞Bad、Bax蛋白表達(dá)比較

與空白組比較，低/高劑量組Bad蛋白表達(dá)量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Bax蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖2，表2。

3?討論

NHL目前治療策略以化療為主，且與常規(guī)NHL的化療方案比較，高強(qiáng)度、短療程包含CTX、MTX、Ara-c的各種化療方案效果更佳，另外增加利妥昔單抗更有助于進(jìn)一步增強(qiáng)療效;但由于疾病的高度惡性和侵襲性，目前臨床整體治療效果仍不令人滿意[10]。從中醫(yī)學(xué)理論來(lái)說(shuō)NHL起病源于正氣虛損，加之癌毒侵襲，與痰、瘀互結(jié)所致。正氣虛損與腎、脾的關(guān)系密切，腎為先天之本，《諸病源候論》曰：“腎藏精，精者，血之所成也”。脾為后天之本，《景岳全書》曰：“血者水谷之精也，源源而來(lái)，生化于脾”。均說(shuō)明了腎、脾與氣血、正氣的密切聯(lián)系;化療藥物屬于攻邪類藥物，此類藥物在“以毒攻毒”的同時(shí)會(huì)損傷陰陽(yáng)氣血及脾、腎等臟，這也是NHL治療中常提到的“攻邪傷正”理論[11-12]。

丹參是具有活血化瘀、益氣安神、涼血消腫的傳統(tǒng)中藥，二氫丹參酮是丹參的抗腫瘤活性成分之一，近年來(lái)有關(guān)其體外抗腫瘤效應(yīng)日漸突出，可有效抑制體外培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞A2780[13]、人肝癌細(xì)胞[14]的增殖與轉(zhuǎn)移，但目前有關(guān)二氫丹參酮對(duì)NHL的抗腫瘤效應(yīng)研究尚不多見(jiàn)。本研究結(jié)果證實(shí)，與空白組細(xì)胞比較，二氫丹參酮干預(yù)后Raji細(xì)胞成活率及增殖指數(shù)明顯降低，凋亡率明顯升高，證實(shí)二氫丹參酮也具有較好的抑制Raji細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡的作用。外源性凋亡途徑主要由細(xì)胞表面死亡受體介導(dǎo)，而內(nèi)源性凋亡途徑主要由線粒體介導(dǎo)，外源性和內(nèi)源性凋亡途徑均可引起胞內(nèi)Caspase-8的活化而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。胞內(nèi)酶原形式的pro-caspase 8經(jīng)死亡受體與其相應(yīng)配體結(jié)合后被激活，Bad、Bid、Bim等為Bcl-2家族成員，接受胞內(nèi)死亡信號(hào)后激活，與Bax、Bak作用后導(dǎo)致蛋白寡聚并插入線粒體膜，膜通透性改變導(dǎo)致大量CytC移位并釋放，胞質(zhì)中的Caspase-9前體活化并進(jìn)而啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活下游的Caspase-3和Caspase-7，完成底物剪切而引起細(xì)胞凋亡[15]。孫蓓等[16]研究發(fā)現(xiàn)，二氫丹參酮通過(guò)下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)、上調(diào)Caspase-3蛋白的表達(dá)對(duì)人肺腺癌GLC-82細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用，并誘導(dǎo)其凋亡。Lee等[17]發(fā)現(xiàn)，二氫丹參酮作用肝癌HepG2細(xì)胞后，檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)caspase 3、8、9活性增高，Bax表達(dá)上調(diào)。Ishitsuka等[18]用和厚樸酚誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡時(shí)，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)caspase 3、7、8、9活性增高，Bad表達(dá)上調(diào)。

本研究結(jié)果顯示，干預(yù)48 h后，低/高劑量組Raji細(xì)胞Caspase 8活性及CytC表達(dá)量均高于空白組，與空白組比較，低/高劑量組Bad蛋白表達(dá)量均升高，Bax蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異。提示二氫丹參酮可有效抑制人NHL Raji細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，其作用機(jī)制與上調(diào)Caspase8的表達(dá)，誘導(dǎo)Bad表達(dá)有關(guān)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

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（2019-09-27收稿?責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄）