電針對神經根型頸椎病大鼠PI3K/AKT信號通路的影響

段曉英 丁宏 曹振強 李艷雙 王明禮

摘要?目的：觀察探討電針對神經根頸椎?。–SR）大鼠PI3K/AKT信號轉導通路及細胞凋亡的變化。方法：SD大鼠60只，按照隨機數字表法分為空白組、模型組和電針組3組，每組20只。造模后第3天開始電針，取雙側頸夾脊穴，以一側穴位為一組，兩側均通過針柄接電針治療儀，疏密波，頻率，強度以大鼠四肢輕度抖動為度。1次/d，30 min/次，連續(xù)治療14 d后處死。采用YLS-3E型痛分析儀檢測大鼠外周神經模型感覺功能，采用蛋白免疫印跡法檢測PI3K/AKT通路表達情況，采用免疫組化法檢測BAX和BCL-2，同時以DNA斷裂的原位末端標記法（Tunel法）檢測細胞凋亡情況。結果：1）與空白組比較，模型組和電針組大鼠外周神經疼痛感覺功能機械痛閾值均下降（P<0.05），其中電針組的機械痛閾值較模型組高（P<0.05）。2）與空白組比較，模型組和電針組大鼠PI3K、p-AKT的蛋白表達均下調（P<0.05），電針組PI3K、p-AKT較模型組明顯上調（P<0.05），而3組的AKT和GAPDH蛋白表達差異均無統計學意義（P>0.05）。3）與空白組比較，電針組和模型組BAX明顯上調（P<0.05），BCL-2則明顯下調（P<0.05）;而電針組BAX表達程度低于模型組（P<0.05），電針組BCL-2的表達程度高于模型組（P<0.05）。4）與空白組比較，模型組和電針組細胞調亡比例均增高，差異有統計學意義（P<0.05）;電針組細胞調亡比例低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：電針雙側頸夾脊穴對CSR大鼠具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，其機制可能與激活PI3K/AKT通路，激活下游BAX、BCL-2等生物因子抗細胞凋亡有關。

關鍵詞?電針;神經根型;頸椎病;大鼠;PI3K;AKT;信號通路;動物實驗

Effects of Electroacupuncture on PI3K/AKT Signaling Pathway in Rats with Cervical Spondylotic Radiculopathy

Duan Xiaoying，Ding Hong，Cao Zhenqiang，Li Yanshuang，Wang Mingli

（The Second Hospital of Jilin University，Changchun 130041，China）

Abstract?Objective：To observe the changes of PI3K/AKT signal transduction pathway and apoptosis in rats with cervical spondylotic radiculopathy（CSR）treated by electroacupuncture.Methods：A total of 60 SD rats，SPF grade，weighing（250±20）g，half male and half female，were randomly divided into 3 groups：a blank group，a model group and an electro-acupuncture group with 20 rats in each group.On the 3rd day after modeling，electro-acupuncture was started.Neck Jiaji（EX-B2）acupoints on both sides were taken.One side of the acupoints was used as a group.Both sides were connected with electro-acupuncture therapeutic apparatus by needle handle.The frequency of dilatational and the intensity was moderate to the slight shaking of the limbs of rats.Once a day，30 minutes each time，after 14 consecutive days of treatment，they were executed.The sensory function of rat peripheral nerve model was detected by YLS-3E pain analyzer.The expression of PI3K/AKT pathway was detected by protein immunoblotting.BAX and BCL-2 were detected by immunohistochemistry.Apoptosis was detected by in situ end labeling（Tunel）with DNA fragmentation.Results：1）Compared with the blank group，the mechanical pain threshold of peripheral nerve pain sensory function in model group and electro-acupuncture group decreased（P<0.05）.The mechanical pain threshold in electro-acupuncture group was higher than that in model group（P<0.05），suggesting that electro-acupuncture could effectively improve the peripheral nerve pain sensory function in CSR rats.2）Compared with the blank group，the expression of PI3K and p-AKT protein in the model group and electro-acupuncture group were down-regulated（P<0.05）.Among them，PI3K and p-AKT in the electro-acupuncture group were up-regulated significantly（P<0.05），while the expression of PI3K and p-AKT protein in the AKT and GAPDH groups were not significantly different（P>0.05），suggesting that electro-acupuncture CSR rats activated PI3K/AKT signal transduction pathway.3）Compared with the blank group，BAX increased significantly in EA group and model group（P<0.05），while BCL-2 decreased significantly（P<0.05）.BAX expression in EA group was lower than that in model group（P<0.05），and BCL-2 expression in EA group was higher than that in model group（P<0.05）.4）Compared with the blank group，the proportion of apoptotic cells in the model group and the electro-acupuncture group increased with statistical significance（P<0.05）; compared with the model group，the proportion of apoptotic cells in the electro-acupuncture group was lower than that in the model group，with statistical significance（P<0.05）.Conclusion：Electro-acupuncture at bilateral cervical Jiaji points has obvious analgesic effect on CSR rats.The mechanism may be related to activating PI3K/AKT pathway，activating downstream biological factors such as BAX，BCL-2 and so on to resist cell apoptosis.

Key Words?Electroacupuncture; Nerve root type; Cervical spondylosis; Rats; PI3K; AKT; Signal pathway; Animal experiment

中圖分類號：R246.9文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.020

神經根型頸椎?。–ervical Spondylosis Radiculopathy，CSR）的主要臨床癥狀是頸部神經根性疼痛，病因主要是由于椎間盤退行性病變壓迫或刺激神經根而出現一系列分子生物學反應造成的[1-3]，其中炎性反應遞質是引起CSR根性疼痛的重要原因[4-5]。近期研究[6-7]表明，炎性反應主要與細胞內大量傳導通路的參與有關，其中被廣泛證實主要在細胞存活中起調控作用的是磷脂酰肌醇3-激酶/絲氧酸-蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/AKT）信號通路。PI3K/AKT在哺乳動物中有3個亞型，其中Ⅲ型為調控細胞增殖和調亡的關鍵，通過肌醇環(huán)第3位點磷酸化底物，激活PI3K信號傳導通路的關鍵下游靶點AKT。p-AKT由約480個氨基酸殘基組成，包括PH、激酶催化和羥基端調控的3部分結構域，其中羥基端是疏水性的，在調節(jié)域的40個氨基酸序列中，含有非常重要的磷酸化位點絲氨酸473位點，這個位點的磷酸化是AKT完全活化的必要因素，當AKT被PDK2磷酸化為p-AKT后，PKB/AKT便具有了活性，而活化了的AKT通過磷酸化含有絲氨酸殘基的底物（如BAX及BCL-2等）而產生抗凋亡的分子生物學效應。有研究[8-9]證實，PI3K/AKT轉導途徑與脊神經細胞調亡關系甚密，研究人員在大鼠脊神經細胞培養(yǎng)中加入PI3K抑制劑后發(fā)現細胞的凋亡細胞比率上升。因此，PI3K/AKT傳導途徑對脊神經細胞的凋亡意義重大。CSR屬于中醫(yī)學“項痹”，中醫(yī)學常見的治療方法有針灸、電針、推拿等。有研究[10-11]表明，單純針刺雙側頸夾脊穴及電針雙側頸夾脊穴，均可緩解頸椎病頸痛患者的頸痛程度、提高日常生活活動能力;治療后及隨訪后，觀察組療效均優(yōu)于對照組。因此本研究采用電針雙側頸夾脊穴對CSR大鼠進行治療，觀察電針對CSR大鼠PI3K/AKT信號轉導通路和細胞凋亡的影響?，F報道如下。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?SD大鼠60只，SPF級，體質量（250±20）g，雌雄各半，相同飼養(yǎng)環(huán)境下，相同批次的喂養(yǎng)飼料，密閉飼養(yǎng)，實驗大鼠均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[動物許可證號：SCXK（京）2016-0006]。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（26±0.5）℃，濕度（50±2.5）%。

1.1.2?實驗儀器與試劑?型痛分析儀（北京眾實嘉合生物科技有限公司，型號：YLS-3E）檢測;電針治療儀（北京中西遠大科技有限公司，型號：G-6805）;一次性使用無菌針灸針（規(guī)格0.35 mm×13 mm，華佗牌）;渦旋振蕩儀（上海珂淮儀器有限公司，型號：I-4002-HCS）;蛋白電泳及轉膜系統（Bio-Rad公司，型號：170-4070）;臺式高速離心機（Eppendorf公司，型號：5810R）;抗體p-AKT（貨號：4060T）、AKT（貨號：4685S）、PI3K（貨號：17366S）、BAX（貨號：5023T）、BCL-2（貨號：15071T）和GAPDH（貨號：5174T），全部購于CST公司;SDS-PAGE瓊脂糖凝膠（上海鈺博生物科技有限公司，批號YB81218-30）;TUNEL檢驗試劑盒（美國Roche公司，批號11684795910）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備?SD大鼠60只，按隨機數字表法分為空白組、模型組、電針組3組，每組20只。參照竇夏睿氏法[12]進行CSR動物造模，首先將大鼠用10%水合氯醛，按0.35 m/100 g劑量進行常規(guī)麻醉，俯臥位固定，首先手觸下頸部附近定位最高棘突（T2），常規(guī)手術配皮和消毒后，于背部正中線由T2向上用手術剪快速做3 cm左右切口，用手術彎鑷不破壞肌肉組織的前提下，逐層鈍性分離頸后皮下組織和肌群，當充分暴露C6～T2左側椎弓時，采用顯微鑷輕輕挑開4個椎體的3個椎間隙（C6和C7、C7和T1、T1和T2）的黃韌帶和結締組織，再以尖嘴蚊式鉗輕輕鉗開C7左側椎弓，在充分暴露脊髓后，用神外顯微剝離器之神經剝離子將脊髓輕推至右側，再用顯微外科鑷將尼龍漁線（0.5 mm×15 mm，組織黏附性處理：尼龍漁線經過乙醇浸泡，無菌干燥后再浸泡至0.1%的多聚賴氨酸溶液中）輕輕沿脊髓縱軸放至C6-7、T1神經根腋下，動物造模中尤其需要注意插線時不要過度下壓，以免碰破椎靜脈叢導致椎管內大量出血。CSR造模完成后，逐層關閉傷口，病因手術針線進行縫合。

1.2.2?干預方法

1.2.2.1?空白組?正常飼養(yǎng)，不做任何處置。

1.2.2.2?模型組?于造模后第3天開始，每日抓取1次，不做針刺處置。

1.2.2.3?電針組?造模后第3天開始電針，取穴：參照大鼠穴位圖譜[13]，取雙側頸夾脊穴，常規(guī)消毒穴區(qū)皮膚，直刺進針，進針深度0.3～0.5 cm，輕捻轉提插后，以一側穴位為1組，兩側均通過針柄接電針治療儀，疏密波，頻率，強度以大鼠四肢輕度抖動為度。1次/d，30 min/次，連續(xù)治療14 d后處死。

1.2.3?檢測指標與方法

1.2.3.1?模型評價?參照文獻[14]將造模后的大鼠每日固定時間段（9：00至10：30）置于觀察箱，適應30 min后出現嘶叫、自叫等行為;同時參照Kawakami及Dubussion法評估大鼠步態(tài)障礙的方法：若出現受損傷足不持重或輕微持重、大鼠在行走時出現跛行;或受損足的大鼠走動時不著臺面，伴有明顯的足內收蜷縮畸形等現象說明造模成功。造模不成功的大鼠予以排除，不納入后續(xù)研究。

1.2.3.2?外周神經模型感覺功能的檢測?采用YLS-3E型痛分析儀檢測大鼠外周神經模型感覺功能，在大鼠清醒狀態(tài)下測量機械性痛閾，首先將YLS-3E型痛分析儀上一個鈍頭有機玻璃圓錐體此安裝固定于大鼠足趾第3、4跖骨間，通過線性逐漸增大壓力，直到大鼠嘶叫掙扎為止，此時儀器自動記錄下的大鼠最后試圖抽回后爪壓力值（g）即為大鼠的機械痛閾，以此評估大鼠外周神經模型感覺功能。

1.2.3.3?蛋白質印跡法檢測PI3K/AKT通路表達動物于造模電針干預14 d后，通過用10%水合氯醛過量麻醉致死，然后在4 ℃下將造模是C6-T2段壓尼龍魚線處脊髓及神經根剝離出來，并以用研磨器制成組織勻漿，在蛋白裂解液的作用下，充分提取蛋白后，在低溫離心機上高速離心（12 000 r/min），取上清液，-20 ℃冰箱保留代用。然后以考馬斯亮藍法測定樣品蛋白濃度，計算同等體積下，每組樣品的蛋白上樣量。取出所購買的SDS-PAGE瓊脂糖凝膠，加入電泳液并沒過短玻板，輕輕提取加樣孔梳，在第一加樣孔用移液器精密加入5 μL蛋白MARKER對蛋白分子量進行標記，其余加樣孔根據空白組、模型組和電針組依次根據已得上樣量進行加樣。然后以60 V開始蛋白電泳待蛋白均跑出濃縮膠后，以100 V繼續(xù)蛋白電泳至所有蛋白跑到底部停止，接著根據MARKER切出所檢測蛋白的分子量，裁剪出相應大小的濾紙和PVDF膜，根據三明治轉膜法，加入轉膜液常規(guī)轉膜，取出轉好蛋白的PVDF膜時需及時標記正反面。之后將PVDF膜在5%脫脂牛奶中常規(guī)封閉1 h，分別加入PI3K、p-AKT、AKT和GAPDH一抗在4 ℃冰箱中孵育過夜，次日用TBST緩沖液室溫搖床洗3次，10 min/次;加入對應二抗，搖床充分反應2 h后，用TBST緩沖液室溫搖床洗3次，10 min/次;ECL顯色試劑盒在避光黑暗處滴加在PVDF膜上，反應1 min后在CHEMIC成像儀上讀取蛋白條達圖像，并通過Image圖像處理軟件讀取蛋白條帶灰度值。

1.2.3.4?免疫組化法檢測BAX、BCL-2的表達?動物于造模電針干預14 d后，通過用10%水合氯醛過量麻醉致死，然后在4 ℃下將造模是C6-T2段壓尼龍魚線處脊髓及神經根剝離出來放置于4%福爾馬林中，48 h后進行常規(guī)組織脫水和透明處理，然后在二甲苯與石蠟混合液中進行滲透和常規(guī)石蠟包埋，采用美國旋轉切片機連續(xù)切片4 μm厚度，每張切片均以防脫載玻片承載并于貼片后放置在60 ℃烤箱中烘烤5 h。常規(guī)脫蠟水化后，以枸櫞酸緩沖液在微波爐中加熱至沸騰，閉門燜5 min進行抗原修復，待冷卻至室溫后PBS泡洗后加封閉液封閉10 min，防水筆在切片周圍畫好隔離圈后，加入一抗BAX、BCL-24 ℃冰箱孵育過夜，次日于37 ℃烤箱中回溫45 min，PBS泡洗3次，5 min/次，加入對應二抗，室溫反應10 min，PBS泡洗3次，5 min/次，DAB顯色后再浸泡于蘇木素中復染30 s，常規(guī)脫水封片后在顯微鏡下觀察，計數，拍片。

1.2.3.5?DNA斷裂的原位末端標記法（Tunel法）檢測細胞凋亡的情況?動物于造模電針干預14 d后，通過用10%水合氯醛過量麻醉致死，然后在4 ℃下將造模是C6-T2段壓尼龍魚線處脊髓及神經根剝離出來，同1.2.3.4免疫組化常規(guī)石蠟包埋，切片，脫蠟水化后，加入現配的3%H2O2，室溫孵育10 min后，蒸餾水浸泡洗3遍，每遍2 min;然后加入0.01MTBS和新鮮稀釋蛋白酶K混合液（1∶200）15 min，0.01MTBS浸泡洗3遍，每遍2 min;接著切片分別加入20 μL添加標記液（1 μL TDT、1 μL DIG-UTP和18 μL標記緩沖液）37 ℃孵育2 h，0.01MTBS浸泡洗3遍，每遍2 min;封閉液封閉30 min，1%DGX抗體溶液反應30 min，0.01MTBS浸泡洗3遍，每遍2 min;1%SBAC溶液反應30 min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察，計數，拍片。各組切片光鏡下隨機拍攝7個高倍視野，每個視野計數100個細胞計算細胞調亡率調亡率（%）=[（調亡細胞數/總細胞數）]×100%。

1.3?統計學方法?采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，3組數據同時符合正態(tài)分布和方差齊性，采用單因素方差分析，若其中一組數據不符合正態(tài)分布，則采用多組秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2?結果

2.1?各組CSR造模成功率?根據造模模型評價標準，模型組和電針組分別有18只和17只大鼠的CSR造模成功，納入后續(xù)研究。見圖1。

2.2?電針對CSR大鼠外周神經疼痛感覺功能的影響?與空白組比較，模型組和電針組大鼠外周神經疼痛感覺功能機械痛閾值均下降（P<0.05），其中電針組機械痛閾值較模型組高（P<0.05），提示電針能有效改善CSR大鼠外周神經疼痛感覺功能。見表1。

2.3?電針對PI3K/AKT通路的影響?與空白組比較，模型組和電針組大鼠PI3K、p-AKT的蛋白表達均下調（P<0.05），其中電針組的PI3K、p-AKT較模型組明顯上調（P<0.05），而3組的AKT和GAPDH蛋白表達差異均無統計學意義（P>0.05），提示電針CSR大鼠能激活PI3K/AKT信號轉導通路。見圖2。

2.4?電針對BAX和BCL-2的影響?與空白組比較，電針組和模型組BAX明顯上調（P<0.05），而BCL-2則明顯下調（P<0.05）;而電針組BAX表達程度低于模型組（P<0.05），電針組中BCL-2的表達程度高于模型組（P<0.05）。見圖3和表2。

2.5?各組TUNEL的表達情況?與空白組比較，模型組和電針組細胞調亡比例均增高，差異有統計學意義（P<0.05）;電針組與模型組比較，細胞調亡比例低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖4。

3?討論

頸椎病屬于中醫(yī)學“痹證”“項痹”等范疇。此病中醫(yī)學病因多由勞損或風寒濕等邪氣侵襲人體而誘發(fā)，引起頸項部疼痛或上肢麻木等氣血運行不暢之表現，故也常稱其為“項強”。頸椎病最根本的病因當屬氣虛血瘀型項痹，病位在肝腎，致病特點可概括為本虛標實。目前，在頸椎病的治療方法中，中醫(yī)療法的針灸和推拿為首選。有研究人員采用電針頸夾脊穴治療CSR取得總有效率的療效更好，患者治療后外周神經疼痛癥狀療效明顯優(yōu)于治療前;若配合辨證取穴治療CSR，有效率達97%[15]。因此認為，電針治療CSR療效顯著。在本實驗中，電針的波形選擇疏密波，緣于本研究團隊在臨床診療CSR中發(fā)現疏密波的抗炎止痛效果明顯好于連續(xù)波和斷續(xù)波，同時研究[16]發(fā)現，電針的2 Hz和100 Hz的頻率分別能夠促進脊髓釋放不同阿片類物質起到鎮(zhèn)痛效應，而疏密波是高低2種頻率間歇使用，使脊髓能釋放包括強啡肽在內的4種己知阿片類物質，相互疊加起到更強的鎮(zhèn)痛消炎效果，可有效改善患者CSR的臨床癥狀;另外，研究人員通過對不同波形電針對頸性疼痛療效的觀察，不僅證實了疏密波對頸椎病的療效優(yōu)于連續(xù)波，而且發(fā)現疏密波可保持機體對電針治療的敏感度，防止耐受[17]。

PI3K是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，具有脂類激酶活性和蛋白激酶活性，可被受體酪氨酸激酶或G2蛋白耦聯受體激活，再通過第二信使（如BAX和BCL-2）在細胞的增殖、調亡等過程中起重要的作用。BAX和BCL-2是PI3K/AKT信號轉導通路上的2個關鍵因子，他們同屬BCL-2家族，參與細胞調亡的重要生物學因子。其中BAX是促細胞凋亡的因子，而BCL-2則與之相反，屬于抗細胞調亡的因子?，F代研究表明，BCL-2家族主要是以線粒體為靶器官，通過對線粒體的介導而對細胞凋亡過程起調控作用。BCL-2家族可分為3個結構功能各異的亞家族：一是BAX亞族，可促進細胞凋亡;二是BCL-2亞族，起到抑制凋亡的作用;三是BH3域蛋白亞族，和BAX一樣也是促進調亡發(fā)生的重要因子。BAX對細胞凋亡的調控可能通過誘發(fā)線粒體膜上供凋亡蛋白通過的離子通道開放和精確改變線粒體膜的通透性而釋放CytC;而BCL-2則是通過拮抗BAX，抑制細胞色素C與半胱氨酸蛋白酶激活而起到的抗凋亡作用[18]。本研究結果顯示：電針激活了PI3K/AKT通路，而BAX和BCL-2的免疫組化結果發(fā)現與空白組比較，電針組和模型組中BAX明顯上調（P<0.05），而BCL-2則明顯下調（P<0.05）;而電針組中BAX表達程度低于模型組（P<0.05），電針組中BCL-2的表達程度高于模型組（P<0.05）。提示電針治療后激活PI3K/AKT通路，進而誘導下游BAX和BCL-2的分子生物學反應，其中通過下調BAX的表達和上調BCL-2的表達，從而起到對CSR的脊神經細胞的保護作用。

綜上所述，本研究發(fā)現，電針雙側頸夾脊穴對CSR大鼠具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，其機制可能與激活PI3K/AKT通路，下調下游BAX的表達和上調BCL-2的表達而起到抗脊神經細胞凋亡有關。

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（2018-12-12收稿?責任編輯：芮莉莉）