無機硒對桑黃（SH623）菌株菌絲生長影響研究

宋飛飛 曹曉 陳文婷 黃鈺婕 何文勝

摘 要：研究無機硒對桑黃（SH623）菌株菌絲生長的影響，并測定SH623菌株對無機硒的耐受度。通過平板法測定不同無機硒濃度下SH623菌株菌絲的平均生長速度，得出SH623菌株對無機硒的耐受度;通過顯微鏡觀察測定無機硒對SH623菌株菌絲結構形態(tài)的影響;通過還原法測定無機硒對SH623菌株菌絲影響的可持續(xù)性。結果表明：SH623菌株菌絲的生長受無機硒濃度影響較大，當外源硒濃度≤18.63 mg·L-1時，其對桑黃菌株菌絲生長速度影響不顯著;當外源硒濃度≥37.25mg·L-1時，桑黃菌株菌絲生長速度受到顯著的抑制（P<0.05），抑制率達到45.86%;SH623菌株對硒的最大耐受濃度約為298.00mg·L-1。顯微鏡觀察結果表明：在外源硒濃度較低時，SH623菌株菌絲體健壯飽滿、分枝較多，菌絲內(nèi)橫隔相距較遠，鎖狀聯(lián)合結構明顯，球狀分生孢子較少;而高濃度硒脅迫可導致SH623菌株菌絲分枝數(shù)目減小，長度變短，橫隔間離變小，部分分枝被分生孢子替代，甚至出現(xiàn)菌絲表面干癟狀況。還原培養(yǎng)試驗表明外源硒對SH623菌絲的影響是可恢復的。

關鍵詞：無機硒;桑黃;菌絲;硒耐受性

中圖分類號：S567.39 ? 文獻標志碼：A ? 文章編號：0253-2301（2019）11-004

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.11.004

Effect of Inorganic Selenium on the Growth of Phellinus Mycelium

SONG Feifei， CAO Xiao， CHEN Wenting， HUANG Yujie， HE Wensheng

（Fujian Vocational College of Bioengineering， Fuzhou， Fujian 350007， China）

Abstract：The effect of inorganic selenium （Se） to the Phellinus （SH623） mycelia was investigated， and the tolerance level of SH623 to inorganic selenium were measured. The mean growth rate of SH623 mycelium under different concentrations of inorganic selenium was measured by the plate method， and the tolerance of SH623 to inorganic selenium was obtained. The effect of inorganic selenium on the structure morphology of SH623 mycelia was observed and determined by microscope. The sustainability of the effect of inorganic selenium on SH623 mycelia was determined by the reduction method. The results showed that： the growth of SH623 mycelia was greatly affected by the concentration of inorganic selenium， and when the concentration of exogenous selenium was less than 18.63 mg·L-1， the effect of it on the growth rate of SH623 mycelia was not significant. When the concentration of exogenous selenium was ≥37.25 mg·L-1， the growth rate of SH623 mycelia was significantly inhibited （P<0.05）， and the inhibition rate reached 45.86%. The maximum tolerated concentration of the SH623 to selenium was about 298.00 mg·L-1. The observation results of microscope showed that when the concentration of exogenous selenium was low， SH623 mycelia was robust and plump with many branches， and the inner septum transversum of mycelia was far apart， with obvious clamp connection structure and fewer spheric conidia. However， under the stress of high concentration of selenium， the number of SH623 mycelia branches decreased， the length became shorter， the septum transversum became smaller， some branches were replaced by conidia， and even the surface of mycelia became shrivelled. The experiments of reduction and cultivation showed that the effect of exogenous selenium on SH623 mycelia was recoverable.

Key words： Inorganic selenium; Phellinus; Mycelium; Selenium tolerance

硒（Se）是人體不能合成且正常生理活動必需的一種微量元素[1-3]。大量研究表明人體免疫功能降低、甲狀腺功能減退、癌癥等疾病與硒缺乏有關[4]。此外，人們發(fā)現(xiàn)攝入硒元素對癌癥具有控制和治療的作用[5-9]。但自然界中該微量元素多以劇毒的無機鹽形式存在[10-11]。食藥用菌具有較強的富集能力，并能將無機硒轉化為無毒的硒多糖、硒蛋白、硒核酸等有機硒，使得食藥用菌具有更好的營養(yǎng)或藥用價值[12-17]。因此，通過開發(fā)富硒食藥用菌實現(xiàn)無機硒向有機硒的轉化對提高人類健康具有重要意義。已有研究表明，食藥用菌對微量營養(yǎng)素的積累能力并不是無限制的，生長基質(zhì)中硒的濃度會影響食藥用菌菌絲的生長及子實體的形成[18-19]。因此，了解無機硒對食藥用菌菌絲生長的影響是生產(chǎn)富硒功能性食藥用菌的前提條件。

桑黃Phellinus屬于擔子菌亞門Basidiomycotina，銹革孔菌科Hymenochaetaceae是一種珍貴的藥用真菌[20]，具有多種藥用價值，其生物活性物質(zhì)具有抗發(fā)炎[21]、降血糖[22]、降血脂[23]、抗腫瘤及提高免疫力[24-25]功效，此外還具有預防流感[26]及類風濕性關節(jié)炎[27]等作用。目前對該菌的研究主要集中在對其生物活性代謝物如多糖、酚類化合物、三萜等方面[21，25，28]，有關富硒桑黃及無機硒對桑黃菌絲體生長的影響方面還鮮有報道。本研究以桑黃為試驗材料，研究無機硒對桑黃菌絲體生長的影響，為富硒桑黃的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

桑黃（SH623）菌株由福建農(nóng)林大學國家菌草工程技術研究中心提供。

1.2 供試培養(yǎng)基、主要試劑及儀器

母種培養(yǎng)基（改良PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯200g·L-1、葡萄糖30g·L-1、磷酸二氫鉀1g·L-1、硫酸鎂0.75g·L-1、維生素B1（VBl）1mg·L-1、瓊脂15g·L-1，pH自然。

主要試劑：外源無機硒為亞硒酸鈉，西亞試劑公司生產(chǎn);其余試驗藥品均為分析純。

主要儀器：高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）;電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司）;超凈工作臺（蘇州佳寶凈化工程設備有限公司）;光學顯微鏡（重慶澳普光電技術有限公司）;體式顯微鏡（上海丙林電子科技有限公司）。

1.3 母種活化及接種

取桑黃斜面母種菌塊（d=0.25cm2）接種于改良PDA平板中，28℃暗光恒溫培養(yǎng)，待菌絲生長直徑達到7～8cm，取菌落邊緣處（d=0.6cm）活化菌塊作為后續(xù)試驗母種。

1.4 平板法測定無機硒對桑黃菌株菌絲生長的影響

配制1mg·mL-1亞硒酸鈉母液，通過梯度稀釋法向改良PDA培養(yǎng)基中添加亞硒酸鈉母液，使培養(yǎng)基硒含量終濃度分別為0（CK）、2.33、4.66、9.31、18.63、37.25、74.50、149.00和

298.00mg·L-1。121℃、20min滅菌后備用。滅菌后的培養(yǎng)皿分別注入供試培養(yǎng)基，每皿約25 mL，冷卻凝固后接入活化菌塊（d=0.6cm），每個梯度濃度重復5皿，28℃倒置暗光培養(yǎng)。觀察桑黃菌株菌絲生長情況，培養(yǎng)7～8d后，利用十字交叉法，通過游標卡尺精確測量菌落生長直徑，記錄數(shù)據(jù)。

通過計算桑黃菌株菌絲平均生長速度對其生長情況進行評估，測量所得菌絲生長直徑除以培養(yǎng)時間即為菌絲生長速度，其中菌絲生長直徑為測量獲得總直徑與初始接種直徑之差。CK 組菌絲生長直徑與不同梯度菌絲生長直徑之差占CK組菌絲生長直徑的百分比即為菌絲生長抑制率（%）。最大耐受濃度（MTC）指受試對象對供試品的耐受臨界濃度，即當處理濃度處于MTC時，菌絲體略有生長;而處理濃度高于MTC時，菌絲體則完全被抑制生長。

1.5 鏡檢法測定無機硒對桑黃菌株菌絲生長的影響

分別選取0（CK）、4.66、18.63、74.5mg·L-1梯度為鏡檢觀察組。將滅菌（121℃、20min）后的培養(yǎng)皿分別注入供試培養(yǎng)基，每皿約25 mL，冷卻凝固后接入活化菌塊（d=0.6cm），每個梯度濃度重復5皿，在距活化菌塊1.5 cm處以45°的角度插入無菌蓋玻片，28℃倒置暗光培養(yǎng)。觀察桑黃菌株菌絲生長情況，當大部分玻片約長滿2/3菌絲時于無菌環(huán)境取出玻片，通過光學顯微鏡觀察記錄玻片上菌絲細胞形態(tài)。將取出玻片各組供試平板繼續(xù)培養(yǎng)至總培養(yǎng)天數(shù)為7～8d，通過體式顯微鏡對桑黃（SH623）菌株菌落邊緣形態(tài)特征進行觀察記錄。

1.6 還原法測定無機硒對桑黃菌株菌絲生長的影響

將上述1.5中各組供試平板繼續(xù)培養(yǎng)至總培養(yǎng)天數(shù)為7～8 d，取菌落邊緣處（d=0.6cm）菌塊作為接種塊，接入無硒添加的改良PDA培養(yǎng)基作復原培養(yǎng)，每個梯度濃度重復5皿，培養(yǎng)方法、測量方法同上。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

利用DPS 7.05軟件對試驗數(shù)據(jù)進行隨機單因素方差分析，采用Tukey多重比較法進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 無機硒對桑黃（SH623）菌株菌絲生長速度的影響

桑黃（SH623）菌株菌絲生長速度受培養(yǎng)基內(nèi)外源無機硒濃度的影響較大（表1）。當外源硒濃度≤18.63mg·L-1時，菌絲生長速度與CK組無顯著差異（P<0.05）;當外源硒濃度≥37.25mg·L-1時，菌絲生長速度受到顯著的抑制（P<0.05），抑制率達到45.86%;當硒濃度達到298.00mg·L-1時，桑黃（SH623）菌株菌絲幾乎無生長，抑制率達到97.84%，因此，桑黃（SH623）菌株菌絲對硒的最大耐受濃度為298.00mg·L-1。

2.2 無機硒對桑黃（SH623）菌株菌絲菌落及菌落邊緣形態(tài)特征的影響

通過對不同硒濃度處理下桑黃（SH623）菌株平板菌落及菌落邊緣形態(tài)特征進行觀察發(fā)現(xiàn)，桑黃（SH623）菌株高濃度硒處理組（圖1F～I、圖2D）與低濃度硒處理（圖1B～D、圖2B～C）及CK組（圖1A、圖2A）的菌落形態(tài)及菌落邊緣形態(tài)差異較大。當外源硒濃度≤18.63 mg·L-1時，桑黃（SH623）菌株菌落略小于對照組，菌落形態(tài)完整，菌絲色澤為淡黃色（圖1），菌落邊緣菌絲繁密、氣生菌絲旺盛，分枝較多（圖2B～C）;當外源硒濃度≥37.25mg·L-1時，桑黃（SH623）菌株菌落明顯區(qū)別于對照組，菌落形態(tài)不完整，菌絲顏色變化不大（圖1），氣生菌絲較少，分枝較少（圖2D）。

注：A為CK組，（B - I）依次分別為2.33、4.66、9.31、18.63、37.25、74.50、149.00和298.00 mg·L-1處理組。

2.3 無機硒對桑黃（SH623）菌株菌絲形態(tài)的影響

為了進一步研究外源硒對桑黃（SH623）菌株菌絲體的影響，選取。CK處理組與4.66、18.63和74.5 mg·L-1硒處理組，通過光學顯微鏡對不同硒濃度下桑黃（SH623）菌株的菌絲體形態(tài)進行了觀察，結果如圖3所示。CK組及4.66 mg·L-1硒處理組SH623菌絲體狹長、健壯飽滿、分枝較多，菌絲內(nèi)橫隔相距較遠，鎖狀聯(lián)合結構明顯，球狀分生孢子較少（圖3A、3B、3a、3b）;18.63 mg·L-1硒處理組桑黃（SH623）菌株的菌絲體分枝數(shù)目減小、長度變短，橫隔間離變小，球狀分生孢子相對增多，部分分枝被分生孢子替代（圖3C，3c）;當外源硒濃度較高時（74.50 mg·L-1），桑黃（SH623）菌株大部分菌絲體出現(xiàn)表面干癟情況（圖3D、3d）。

注：A為CK組，（B～D）依次分別為4.66、18.63和74.5 mg·L-1處理組，體式顯微鏡放大50倍觀察。

注：A、a為CK組，B、C、D和b、c、d依次分別為4.66、18.63和74.50mg·L-1處理組，大寫字母為光學顯微鏡放大100倍觀察結果，小寫字母為光學顯微鏡放大400倍觀察結果。

2.4 無機硒處理桑黃菌株菌落的還原培養(yǎng)

為研究外源硒對桑黃（SH623）菌株菌絲體的影響是否可逆，對不同硒濃度處理后的桑黃（SH623）菌株菌絲菌落進行還原培養(yǎng)試驗，結果如表2及圖4所示。不同硒濃度處理后的桑黃（SH623）菌株菌落在接入改良PDA培養(yǎng)基后均恢復了生長，且菌絲生長狀況正常，菌落形態(tài)完整（圖4）。不同硒處理菌株各組平均生長速度與CK組沒有顯著差異（表2），說明外源無機硒添加對桑黃（SH623）菌絲的影響是可恢復的。

3 討論與結論

本研究針對無機硒對桑黃菌株菌絲生長的影響進行探索，發(fā)現(xiàn)桑黃（SH623）菌株菌絲的生長情況受無機硒影響較大，其對無機硒的耐受度與金針菇[19]、香菇[29]、真姬菇[30]、平菇[31]等相當。當硒濃度≥37.25mg·L-1時，桑黃（SH623）菌株菌絲生長受到顯著的抑制作用（P<0.05），抑制率達到45.86%，且這種抑制作用隨著硒濃度的增加而增加。這與已有的關于金針菇[19]及平菇[31]的研究結果相類似。雖然較高無機硒濃度處理對桑黃（SH623）菌株菌落形態(tài)影響較大，但菌絲顏色沒有表現(xiàn)出明顯的差異，這一表征與經(jīng)富硒處理香菇的研究類似[29]。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，低濃度硒對桑黃（SH623）菌株菌絲生長無顯著性影響，高濃度硒對桑黃（SH623）菌株菌絲生長具有抑制作用。已有研究表明在外界條件脅迫下，食藥用菌菌絲體會出現(xiàn)如表面形態(tài)畸變等應答反應[32]

。通過對桑黃（SH623）菌絲的顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，桑黃（SH623）菌株菌絲在高濃度無機硒脅迫下，會出現(xiàn)類似的反應。對桑黃（SH623）菌株菌落邊緣的觀察發(fā)現(xiàn)，其菌落邊緣菌絲稀疏、分枝變少，氣生菌絲較少，菌絲之間幾乎完全沒有網(wǎng)狀交叉。食藥用菌菌絲間的網(wǎng)狀交叉結構是有利于菌絲體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與能量傳遞的重要結構[33]，網(wǎng)狀交叉結構被抑制，可直接導致菌絲體物質(zhì)能量傳遞受阻，從而使得菌絲體營養(yǎng)不足。光學顯微鏡觀察結果也表明了高濃度硒脅迫導致菌絲體物質(zhì)能量傳遞受阻的這一現(xiàn)象：隨著培養(yǎng)基中硒濃度的增高，桑黃（SH623）菌株菌絲體由健壯飽滿、分枝較多，菌絲內(nèi)橫隔相距較遠，鎖狀聯(lián)合結構明顯等表征向菌絲分枝數(shù)目減小、長度變短，橫隔間離變小，球狀分生孢子相對增多轉變，直至菌絲表面干癟。但還原培養(yǎng)試驗表明了桑黃（SH623）菌株產(chǎn)生的表征變化只是對硒脅迫的應答反應，外源硒對其并沒有產(chǎn)生不可逆的誘變或傷害，其影響是可恢復的。因此，以桑黃（SH623）菌株開發(fā)富硒食藥用菌具有可行性。

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（責任編輯：林玲娜）

收稿日期：2019-10-13

作者簡介：宋飛飛，女，1987年生，博士，實驗師，主要從事食藥用菌的研究與開發(fā)。

基金項目：福建省教育廳中青年教師科技項目（JAT160759）;福建健康產(chǎn)品研究檢測中心平臺（PT201706）;福建省科技創(chuàng)新平臺項目（2014Y2008）。