番茄根內(nèi)生細(xì)菌的促生及其優(yōu)勢種群的篩選和分析

黎燁 熊娟 張婷 金玲月 桂楚伊 田寶玉

摘 要：以從番茄植株分離出的46株內(nèi)生細(xì)菌為研究對象，采用番茄根內(nèi)生細(xì)菌單獨(dú)侵染番茄種子，并研究其對番茄植株生長的影響，進(jìn)一步利用測試內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA序列結(jié)合之前公開番茄根內(nèi)核心OTU（Operational Taxonomic Unit）序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析主要促生長內(nèi)生細(xì)菌的種類與豐度。促生試驗(yàn)表明，測試內(nèi)生細(xì)菌均對番茄植株鮮重均有促進(jìn)作用，其中芽孢桿菌（3株）、假單胞菌（2株）、黃單胞菌（1株）以及根瘤菌（2株）對番茄植株的鮮重具有顯著性促進(jìn)（P<0.05），而GF12與對照相比對鮮重的促進(jìn)最為顯著（P<0.01），GF12內(nèi)生細(xì)菌對番茄植株鮮重的增加為對照的1.69倍;對株高具有顯著性促進(jìn)的內(nèi)生菌株共有9株，分屬芽孢桿菌（5株）、假單胞菌（2株）、黃單胞菌（1株）以及根瘤菌（1株），與對照相比CZ29在促進(jìn)株高伸長極顯著（P<0.01），CZ29侵染后番茄株高為對照組的1.46倍;此外，測試內(nèi)生細(xì)菌中8株促進(jìn)番茄根的伸長，其中MR56、GF12和CZ29侵染后的番茄根長比對照組根長超出15%以上。對46株內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA序列與番茄根內(nèi)生細(xì)菌前100核心OTU序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，測試內(nèi)生細(xì)菌聚類到假單胞菌目、腸桿菌目、根瘤菌目、伯克氏菌目、芽孢桿菌目、黃單胞菌目以及黃桿菌目。此外聚類到假單胞菌目和根瘤菌目的內(nèi)生細(xì)菌分別與番茄根內(nèi)高豐度的OTU_3（Pseudomonas）和OTU_23（Rhizobium）聚在一起，表明測試假單胞菌以及根瘤菌是番茄根內(nèi)主要促生效果的核心類微生物。分離到的具有促生的芽孢桿菌種類最多，但假單胞菌和根瘤菌在根內(nèi)豐度較高，作為健康番茄根內(nèi)生微生物組中最主要的群體，因此芽孢桿菌、假單胞菌以及根瘤菌具有巨大促生潛力，可以作為生物菌肥探索為宿主提供營養(yǎng)，并合理開發(fā)利用微生物資源以更好發(fā)展農(nóng)業(yè)。

關(guān)鍵詞：番茄;內(nèi)生細(xì)菌;盆栽;促生長;優(yōu)勢種群

中圖分類號：S476 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? 文章編號：0253-2301（2019）11-003

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.11.003

Screening and Analysis on the Growth Promotion of Endophytic Bacteria in Tomato Roots and its Dominant Population

LI Ye， XIONG Juan， ZHANG Ting， JIN Lingyue， GUI Chuyi， TIAN Baoyu*

Abstract： By taking 46 endophytic bacteria isolated from tomato plants as the research objects， the endophytic bacteria from tomato roots were used to infect the tomato seeds to study the effects on tomato plant growth. Then， the phylogenetic trees were further constructed by using the sequences of the 16S rDNA combined with the previously open OTU （Operational Taxonomic Unit） sequence of tomato root to analyze the species and abundance of major growthpromoting endophytic bacteria. The results of the experiment showed that the tested endophytic bacteria could promote the fresh weight of tomato plants. Bacillus （3 strains）， Pseudomonas （2 strains）， Xanthomonas （1 strain） and Rhizobium（2 strains） could significantly promoted the fresh weight of tomato plants （P<0.05）， while compared with the control group， GF12 has promoted the fresh weight most significantly （P<0.01）， and the increase of endophytic bacteria of GF12 on the fresh weight of tomato plants was 1.69 times that of the control group. There were 9 endophytic strains with significant promotion of the plant height， including Bacillus （5 strains）， Pseudomonas （2 strains）， Xanthomonas （1 strain） and Rhizobium （1 strain）. CZ29 significantly promoted the plant height and elongation compared with the control group （P<0.01）， and the tomato plant height after the infection of CZ29 was 1.46 times that of the control group. In addition， the tested 8 endophytic bacteria promoted the elongation of tomato roots， among which the tomato root length after the infection of MR56， GF12 and CZ29 was more than 15% longer than that of the control group. The phylogenetic analysis of the 16S rDNA sequence of 46 endophytic bacteria and the first 100 core OTU sequences of endophytic bacteria in tomato roots showed that the tested endophytic bacteria were clustered into Pseudomonadales， Enterobacteriales， Rhizobiales， Burkholderiales， Bacillales， Flavobacteriales and Xanthomanadales. In addition， the endophytic bacteria clustered into Pseudomonas and Rhizobium were clustered together with OTU_3 （Pseudomonas） and OTU_23 （Rhizobium） with high abundance in tomato roots， indicating that Pseudomonas and Rhizobium were the core microorganisms for the main growth promoting effect in tomato roots. There were the most types of probiotic Bacillus isolated which had the effect of promoting growth， but Pseudomonas and Rhizobium were abundant in roots， which were the most important groups in the endophytic microbiome of healthy tomato roots. Therefore， Bacillus， Pseudomonas and Rhizobium had great potential to promote growth， which could be used as biological fertilizer to provide nutrition for the host， and rationally develop and utilize microbial resources to better develop the agriculture.

Key words： Tomato; Endophytic bacteria; Potting; Growthpromoting; Dominant population

植物微生物組作為植物的第二基因組，其在植物的生長發(fā)育以及生理活動(dòng)中發(fā)揮的作用受到廣泛的關(guān)注和研究。植物內(nèi)生細(xì)菌可以從植物周圍組織環(huán)境中吸取營養(yǎng)來進(jìn)行生長繁殖，同時(shí)也可以通過菌株生長、生理代謝活動(dòng)等影響植物宿主的生長和發(fā)育[1]。由于植物與內(nèi)生細(xì)菌以及內(nèi)生菌群之間復(fù)雜的互作關(guān)系，內(nèi)生細(xì)菌在植物促生長以及病害生物防治方面具有較好應(yīng)用潛力。基于傳統(tǒng)的微生物純培養(yǎng)技術(shù)，內(nèi)生細(xì)菌與植物的相互作用，國內(nèi)外學(xué)者已做了大量的研究[2]，研究報(bào)道內(nèi)生細(xì)菌可以增加宿主抗逆性[3]、分泌生長素[4]、固氮[5]等促進(jìn)植物生長的作用，并且諸多學(xué)者已從許多作物中分離出多種內(nèi)生細(xì)菌，其中以芽孢桿菌Bacillus、假單胞菌Pseudomonas和腸桿菌Enterobacteria最為常見[6]。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，Bulgarelli等[7-8]通過16S擴(kuò)增子測序揭示擬南芥根的微生物群落結(jié)構(gòu)和核心微生物組，進(jìn)一步了解植物和核心微生物組之間的互作。結(jié)果表明，放線菌、假單胞菌、根瘤菌以及芽孢桿菌是植物根占據(jù)較高豐度的主要菌群，并且與宿主的互作機(jī)制中表現(xiàn)出特定生態(tài)位功能[9]。同樣，對一些重要經(jīng)濟(jì)作物，如番茄和甘蔗根內(nèi)細(xì)菌群落分析也出現(xiàn)相似的群落組成結(jié)構(gòu)[10-12]。但是，通過宏基因組方法對植物內(nèi)生細(xì)菌的多樣性和功能分析大部分是基于整體群落水平以及較高分類水平，很少有工作將內(nèi)生菌菌群與具體某個(gè)種或者植物互作發(fā)揮特定功能分析相聯(lián)系。因此，在植物相關(guān)的內(nèi)生菌群中，很難界定具體哪些菌群對植物發(fā)育是有益的，哪些菌群是有害以及哪些菌群處于中立的。

番茄是世界上最主要的果蔬之一。本研究在前期對番茄根內(nèi)生菌菌群分析和內(nèi)生菌菌株分離鑒定的基礎(chǔ)上，通過在盆栽試驗(yàn)中定量添加內(nèi)生細(xì)菌與番茄生長指標(biāo)間的相互關(guān)系，界定在盆栽試驗(yàn)中對番茄生長具有促進(jìn)作用的相關(guān)內(nèi)生菌株，篩選對番茄具有促生長作用的內(nèi)生菌菌株，并通過與番茄根微生物組優(yōu)勢OTUs的聚類和系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定具有促生長功能的內(nèi)生菌是否為番茄根內(nèi)生菌優(yōu)勢種群。對植物內(nèi)生菌關(guān)鍵細(xì)菌群的功能探索將有助于了解特定內(nèi)生菌是否對宿主植物有益，以及植物-微生物組-病原體之間的互作機(jī)制。此外，這些研究將有助于發(fā)現(xiàn)新的內(nèi)生微生物，可加以開發(fā)利用作為潛在的生物防治劑資源，為植物病原體的防治奠定材料和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

番茄品種選用新中蔬4號。將購買的番茄種子用紗布包裹并用75%乙醇溶液消毒1 min，無菌蒸餾水洗滌多次后，再用5%次氯酸鈉對番茄種子侵泡10 min，滅活種子表面附著微生物，無菌蒸餾水再次洗滌多次，最后無菌濾紙吸干水分備用。

用于盆栽試驗(yàn)的46株番茄根內(nèi)生細(xì)菌（按菌株保藏者姓氏進(jìn)行編號，如CZ1、GG1等）來自實(shí)驗(yàn)室已分離保藏菌株（表1）[13-14]。

1.2 細(xì)菌LB培養(yǎng)基

培養(yǎng)基為胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl10g，pH值自然，以蒸餾水定容至1L，按每瓶100mL分裝于250mL三角瓶中，121℃高壓滅菌30 min備用。固體培養(yǎng)基按每100 mL加2 g瓊脂粉滅菌后，制備固體培養(yǎng)基平板。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 番茄根內(nèi)生細(xì)菌的活化與菌液制備 用接種針分別挑取保藏的菌液少許，在LB固體培養(yǎng)基平板上劃線，并于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜進(jìn)行菌株活化。菌株活化后，挑取單克隆分別接種到裝有2 mL液體培養(yǎng)基試管中，于37℃、120 r·min-1過夜培養(yǎng)，并通過分光光度計(jì)在600 nm條件下測量各菌株的菌濃度，并將各濃度等量化稀釋（均稀釋到OD600=0.5）備用。

1.3.2 番茄內(nèi)生細(xì)菌對植物促進(jìn)生長效果的盆栽試驗(yàn) 番茄根內(nèi)生菌處理種子和植株方法的選擇。先采用平板試驗(yàn)篩選6株促生試驗(yàn)效果好的內(nèi)生菌菌株進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。用以下4種單獨(dú)或者混合處理測試內(nèi)生菌對番茄的促生效果：處理（1）菌液浸種;處理（2）種子播下后菌液灑在種子周圍土壤中;處理（3）發(fā)芽后將菌液灑在芽周圍土壤中;處理（4）番茄苗3～4片真葉時(shí)將菌液灑在芽周圍土壤中，以及處理（1）+（2），處理（1）+（3），處理（1）+（4）進(jìn)行處理，自然生長1個(gè)月，期間分別觀察植株生長狀態(tài)、統(tǒng)計(jì)并測量不同方式處理后植株的鮮重、株高以及根長，從而判斷不同處理方式的促生效果，對照組，不作任何處理。

基于預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，選取促生試驗(yàn)效果好的（1）+（2）方案，將發(fā)酵培養(yǎng)的46株內(nèi)生菌菌液等濃度微生物菌懸液分別浸泡10粒番茄種子，每盆種子播下后并將菌液均勻?yàn)⒃诜N子周圍土壤中，最后在種子上面覆蓋薄土層。1個(gè)處理3個(gè)平行，以鑒定微生物的促生效果;對照組（3盆），不添加任何微生物。按常規(guī)方法進(jìn)行水肥和自然光照與溫度管理，待種子發(fā)芽出現(xiàn)真葉時(shí)，去除多余的幼苗（每盆僅保留3棵植株），后期根據(jù)土壤干濕程度進(jìn)行水分給予，維持土壤良好的濕度環(huán)境。整個(gè)番茄植株生長的過程中都要定期觀察、拍照并做好統(tǒng)計(jì)記錄，1個(gè)月后檢查促生效果。

1.3.3 番茄促生長效果的測量與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 對完成生長后的番茄植株進(jìn)行收集，利用金屬鍬將番茄從盆栽盒拔出，并輕輕抖動(dòng)防止根毛斷裂除去大部分根部散土，隨后利用毛刷輕輕除去根部附著較為緊密的土壤，最后利用自來水清洗植株根部并用吸水紙吸干，分別測量番茄植株的株高（頂端到根部的長度），植株根長（根部到根尖的長度）與鮮重，并利用軟件SPSS對各試驗(yàn)組的株高、根長以及鮮重與對照組進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)以判斷試驗(yàn)組與對照組是否存在明顯差異。

1.3.4 番茄根內(nèi)生菌和番茄根內(nèi)優(yōu)勢核心OTU的系統(tǒng)樹構(gòu)建 為了確定促生內(nèi)生菌在番茄根內(nèi)的豐度占比與親緣關(guān)系，選取涵蓋番茄的主要內(nèi)生菌群前100個(gè)最豐富的OTU序列（V3～V4可變區(qū)）與促生細(xì)菌的16S rDNA序列（約1500 bp）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育和聚類分析，其中OTU序列從先前發(fā)表的健康番茄根內(nèi)微生物組數(shù)據(jù)集提取[10]。使用ClustalX2.1[15]將所有序列通過默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行比對，并在SeaView 4中進(jìn)行序列編輯[16]，使用Mega7構(gòu)建鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加根內(nèi)生細(xì)菌與番茄共培養(yǎng)盆栽方案選擇

通過用7種不同的處理方法來測試不同的根內(nèi)生細(xì)菌對番茄的促生效果，經(jīng)試驗(yàn)后最終選擇接下來的試驗(yàn)處理方法為菌液浸種，隨后將浸泡后的番茄種子播種于盆栽盒里，并用相應(yīng)的菌液灑在種子附近的土壤中，最后在種子上面覆蓋一薄層土。待種子發(fā)芽生長至具有2～4片真葉時(shí)，去除多余的苗（每盆保留3株同樣的植株），再灑相應(yīng)的菌液（每株番茄苗根部土周圍灑1 mL菌液），之后放在室外自然光照條件下培養(yǎng)。

2.2 盆栽條件下添加根內(nèi)生細(xì)菌對番茄生長的促生效果

番茄播種并接種相應(yīng)的內(nèi)生細(xì)菌后將盆栽置于室外自然環(huán)境萌發(fā)生長，整個(gè)生長過程中定期檢查番茄植株生長狀況、拍照（圖1）并做好統(tǒng)計(jì)記錄（表2），1個(gè)月后檢查促生效果。

由表2結(jié)果可知，盆栽條件下添加不同根內(nèi)生細(xì)菌對番茄的促生長作用不同。（1）所有測試內(nèi)生細(xì)菌均使得番茄植株鮮重增加，與對照相比較CZ6、B68、GG7、B60、MR56、B51、CZ29以及GF12對植株鮮重增加具有顯著性促進(jìn)（P<0.05），包含芽孢桿菌（3株）、假單胞菌（2株）、黃單胞菌（1株）以及根瘤菌（2株），部分內(nèi)生細(xì)菌促進(jìn)番茄植株鮮重增加極顯著（P<0.01），如B51、GF12、CZ29等菌株侵染的植株比對照組的重量高出60%以上（表2），其中GF12（2.92±0.68）g內(nèi)生細(xì)菌對番茄植株鮮重的增加為對照（1.73±0.39）g的1.69倍。（2）有10株內(nèi)生細(xì)菌侵染的番茄植株與對照組相比高出20%以上，其中B51、CZ6、CZ19、CZ26、CZ29、B68、GG1、GF12以及MR56等9株內(nèi)生細(xì)菌對株高伸長具有顯著性促進(jìn)（P<0.05），對株高具有顯著促進(jìn)的內(nèi)生細(xì)菌分屬芽孢桿菌（5株）、假單胞菌（2株）、黃單胞菌（1株）以及根瘤菌（1株），促進(jìn)株高伸長最為顯著的為芽孢桿菌CZ29（16.30±0.50cm），侵染后番茄株高為對照組（11.13±1.65cm）的1.46倍，比對照組高出46.45%。（3）有8株內(nèi)生細(xì)菌促進(jìn)番茄根的伸長，其中接種MR56、GF12和CZ29等3株內(nèi)生細(xì)菌的植物根長比對照組根長超出15%以上。從試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)測試的根內(nèi)生細(xì)菌

侵染的番茄植株與對照組相比部分具有顯著性促進(jìn)植株生長的能力，各內(nèi)生細(xì)菌對植物的促生長作用表現(xiàn)主要體現(xiàn)為促進(jìn)植株根的伸長、植株整體高度的增加、植株莖稈的加粗以及重量的增加。

2.3 番茄根內(nèi)生菌和番茄根內(nèi)優(yōu)勢核心OUT的聚類分析

對測試的46株番茄根內(nèi)生菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，推測這些內(nèi)生菌在番茄根內(nèi)生菌中的豐度和所處的地位。聚類結(jié)果（圖2）顯示，46株內(nèi)生細(xì)菌共聚類到3個(gè)門7個(gè)菌目，分別為伯克氏菌目（2株）、腸桿菌目（5株）、芽孢桿菌目（23株）、黃桿菌目（1株）、假單胞菌目（9株）、根瘤菌目（4株）以及黃單胞菌目（2株）。其中測試芽孢桿菌目內(nèi)生細(xì)菌主要與兩類OTU親緣關(guān)系較近，CZ16、B50、CZ21、CZ23、CZ26、CZ59、CZ64以及B51與OTU_14（Bacillus）聚到一支，而CZ29與OTU_80（Planococcaceae）聚為一支，表明分離的番茄根內(nèi)生芽孢桿菌所屬類別較為集中。另外的23株內(nèi)生細(xì)菌主要為腸桿菌目、假單胞菌目以及根瘤菌目，其中，B70、B71、MR5、MR7和GG4與屬于腸桿菌目的OTU_35（Salmomella）聚為一支，同樣，在根瘤菌目和假單胞菌目的聚類也出現(xiàn)類似結(jié)果，測試的4株內(nèi)生細(xì)菌B35、B60、GF12以及GF49與OTU_23（Rhizobium）聚到一塊，而同屬根瘤菌目的OTU_67（Bosea）、OTU_86（Devosia）、OTU_197（Hyphomicrobium）和OTU_1044（Aurantimonadaceae）聚到另外一支，GG1、CZ78、MR10、B75、B25、GG7、GG12、GF13和B68與OTU_167（Pseudomonas）、OTU_549（Pseudomonas）和OTU_3（Pseudomonas）聚到一支，其中OTU_3（Pseudomonas）在番茄根內(nèi)豐度較高（高通量測序數(shù)據(jù)顯示OTU_3的在假單胞菌目中歸屬于優(yōu)勢種群），而OTU_1015（Psychrobacter）和OTU_147（Acinetobacter）等假單胞菌未能和測試假單胞菌聚到一支，表明分離的測試根瘤菌和假單胞菌雖屬于高豐度菌類但多樣性較低，還有很多根瘤菌以及假單胞菌未能成功分離驗(yàn)證。

3 討論

據(jù)報(bào)道，植物根內(nèi)生細(xì)菌可以通過生物合成吲哚乙酸（IAA）促進(jìn)宿主植物的生長或者調(diào)解其生理代謝活動(dòng)，在內(nèi)生細(xì)菌中主要合成IAA的途徑有吲哚3丙酮酸（IPyA）、吲哚3乙酰胺（IAM）、吲哚3乙腈（IAN）和色胺（TAM）等，并且在先前的番茄根微生物組分析中發(fā)現(xiàn)大部分核心種群都具有不完整的IAA生物合成途徑，只有少數(shù)種群具有一個(gè)完整的IAA合成途徑[10]。通過研究發(fā)現(xiàn)，在所測試的番茄根內(nèi)生細(xì)菌中對番茄株高伸長促進(jìn)極顯著（P<0.01）的內(nèi)生細(xì)菌有CZ6、CZ26和CZ29等3株芽孢桿菌、GG1（假單胞菌）以及GF12（根瘤菌），而促進(jìn)番茄鮮重增加極顯著的內(nèi)生細(xì)菌有B51（芽孢桿菌）、CZ29（芽孢桿菌）和GF12（根瘤菌），表明假單胞菌，芽孢桿菌和根瘤菌可能是番茄根內(nèi)主要的促生菌群。將篩選的內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA序列與之前[10]番茄根內(nèi)100個(gè)最豐富的OTU序列進(jìn)行比對和聚類分析，對番茄株高具有極顯著促進(jìn)作用的根瘤菌菌株GF12，以及假單胞菌菌株GG1分別與番茄根內(nèi)生菌優(yōu)勢種群的較高豐度OTUs（OUT_23和OTU_3）聚為同一個(gè)分支。但是，并不是所有與這些較高豐度OTUs聚在一起的內(nèi)生細(xì)菌都具有顯著性促生長作用，例如與根瘤菌GF12聚在同一分支的其他根瘤菌B35、B60和GF49的促生活性相對較低，另外，部分具有顯著性促進(jìn)番茄植株生長的芽孢桿菌在番茄根內(nèi)生細(xì)菌中的豐度較假單胞菌和根瘤菌低，表明內(nèi)生細(xì)菌的促生長與其在植物根內(nèi)的豐度無正負(fù)相關(guān)性，并且分離的測試內(nèi)生細(xì)菌多樣性仍較低，例如測試芽孢桿菌目主要與OTU_14（Bacillus）聚到一支，根瘤菌主要和OTU_23（Rhizobium）聚到一塊，并未聚類到同屬根瘤菌目的Bosea、Devosia、Hyphomicrobium以及Aurantimonadaceae，同樣假單孢菌主要和OTU_3（Pseudomonas）聚到一支，而Psychrobacter和Acinetobacter等假單胞菌未能和測試假單胞菌聚到一支，還有很多根內(nèi)生細(xì)菌未能成功分離驗(yàn)證，因此持續(xù)驗(yàn)證多樣內(nèi)生細(xì)菌的功能特征及其在內(nèi)生細(xì)菌中的生態(tài)地位，將為合理利用微生物發(fā)展生物肥料和生防制劑提供理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）

收稿日期：2019-11-05

作者簡介：黎燁，男，1994年生，碩士研究生，主要從事植物微生物組研究。

通信作者：田寶玉，男，1973年生，教授，主要從事環(huán)境微生物和微生物組學(xué)研究（Email：tianby@fjnu.edu.cn）。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31670125）;福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2017J01625）。