不同提取法炮制對(duì)水蛭體外溶栓活性的影響

譚赫 侯覺(jué)文 單宇 王雄飛 鐘苗 雷艷 沈蒙 于繼平 袁瑞娟

摘要?目的：研究炮制對(duì)水蛭體外溶栓活性的影響。方法：采用水提取法和仿生提取法對(duì)水蛭凈制品、燙制品、酒制品進(jìn)行提取，選用纖維蛋白平板法和纖維蛋白原平板法，以平板上透明圈面積為指標(biāo)進(jìn)行纖溶活性測(cè)定;并建立體外血栓模型，通過(guò)血凝塊的失重比進(jìn)一步評(píng)價(jià)水蛭不同炮制品的溶栓活性。結(jié)果：水蛭在炮制前后均能在纖維蛋白平板上產(chǎn)生透明圈。采用水提取法時(shí)，燙制品和酒制品的溶圈面積減小，炮制后纖溶活性降低，活性順序?yàn)椋簝糁破?酒制品>燙制品。而采用仿生提取法時(shí)，顯示燙制和酒制后水蛭纖溶活性升高，活性順序?yàn)椋籂C制品>酒制品>凈制品。體外血栓模型中，血凝塊失重比結(jié)果與纖溶活性測(cè)定結(jié)果一致，采取水提取法時(shí)，炮制使溶栓活性降低，而采用仿生提取法時(shí)顯示炮制使溶栓活性增加。結(jié)論：與水提取法比較，仿生提取法更符合水蛭經(jīng)口服后在人體內(nèi)的消化吸收過(guò)程，其結(jié)果更有說(shuō)服力。傳統(tǒng)炮制可增強(qiáng)水蛭溶栓活性。

關(guān)鍵詞?水蛭;炮制;仿生提取;纖溶;溶栓

Effects of Water Extraction Method and Bionic Extraction Method on Antithrombotic Activity of Processed Products of Whitmania Pigra

Tan He1， Hou Juewen1， Shan Yu2， Wang Xiongfei1， Zhong Miao1， Lei Yan1， Shen Meng1， Yu Jiping1， Yuan Ruijuan1

（1 School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 102488， China; 2 Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences， Peking Union Medical College， Beijing 100193， China）

Abstract?Objective：To explore the effects of different processing methods on the antithrombotic activity of Whitmania Pigra by different extraction methods.Methods：The water extraction method and the bionic extraction method were used respectively to extract the antithrombosis active components in W.pigra hanging dried products， talcum powder fried products and wine products.In the case of the transparent circle area of the fibrin plate method and the fibrinogen plate method were used as the activity indexes to evaluate the fibrinolytic activities of different processed W.pigra.Then， for the purpose of further determining the antithrombosis activity， the thrombus model in vitro was established in order to calculate further the dissolution rate of blood clot.Results：W.pigra could produce transparent rings on the fibrin plate before and after processing.In the sample of the water extraction method， it was found there existed not only decreased the area of transparent rings but also weakened activity in fibronolysis after processing both in the talcum powder fried products and the wine products， and the activity order was as follows：hanging dried products>wine products>talcum powder fried products， the results of whom were in agreement with the results of the weight loss ratio of the dissolved blood clot in vitro.In the sample of the bionic extraction method， all the results indicated the fibrinolytic activity and the thrombolysis rate of W.pigra after wine product and talcum powder fried product were increased.Conclusion：When compared with the water extraction method， the bionic extraction method was more similar to the absorption process of W.pigra in human digestive system after oral administration， and the extracted ingredients of the bionic extraction method were more consistent with human digestion and absorption.Therefore， the traditional processing method can enhance the antithrombosis activity of W.pigra.

Key Words?Whitmania pigra; Processing; Bionic extraction; Fibrinolysis; Antithrombosis activity

中圖分類(lèi)號(hào)：R284;R283文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.012

水蛭是破血逐瘀類(lèi)藥材的代表，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，抗凝、溶栓是其最重要的藥理作用?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2015年版（一部）收錄了3種水蛭，分別為水蛭科動(dòng)物螞蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman和柳葉螞蟥Whitmania acranulata Whitman[1]，目前以螞蟥應(yīng)用最多。水蛭常用的處理方法為清水吊干，有滑石粉燙制、酒制等諸多炮制方法，其中滑石粉燙制法是《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版（一部）收載的臨床使用最多的炮制方法[2]。據(jù)記載，炮制能使水蛭毒性降低、利于粉碎、消減腥味。但目前研究表明，炮制使水蛭抗凝溶栓作用降低，所以臨床應(yīng)用中多選用其清水吊干品[3-5]。這些研究中主要采用水為溶劑提取樣品，而水蛭主要活性成分為蛋白類(lèi)物質(zhì)，其發(fā)揮真正藥效作用的物質(zhì)可能是經(jīng)胃腸道消化降解后的成分，僅采用水提取法時(shí)不能很好地模擬水蛭在體內(nèi)被消化降解的過(guò)程，因此得出的結(jié)論可能有失偏頗[6-7]。本實(shí)驗(yàn)組前期采用仿生提取法研究水蛭的抗凝活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)炮制后水蛭抗凝活性增加[8]。除抗凝活性外，溶栓活性也是水蛭的主要藥理活性，而關(guān)于炮制對(duì)水蛭溶栓作用的影響還沒(méi)有相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)選用水提取和仿生提取2種方法[9]，用纖維蛋白平板法、纖維蛋白原平板法和體外溶栓實(shí)驗(yàn)對(duì)水蛭不同炮制品的溶栓活性進(jìn)行探討。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動(dòng)物?水蛭，市售，清水吊干品，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院鑒定系楊瑤珺教授鑒定為螞蟥W.pigra。雄性SD大鼠，SPF級(jí)，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0002，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.2?藥物?黃酒，市售，老恒和浙江黃酒（五年陳釀·清爽型黃酒，湖州老恒河釀造有限公司）;滑石粉，市售。

1.1.3?試劑與儀器?磷酸緩沖鹽溶液（PBS）緩沖液（片劑，Solarbio，批號(hào)：809A032）;胃蛋白酶（1∶10 000，P7000，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：9001756）;纖維蛋白原（Sigma F8630，批號(hào)：AP0036）;瓊脂糖（Agarose G-10，批號(hào)：1461000）;胰蛋白酶（1∶250，0458，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：9002077）;凝血酶（T4648-1KU，Sigma，批號(hào)：SLBV3604）;注射用尿激酶（25萬(wàn)單位，廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：071704011）;0.9%氯化鈉注射液（250 mL，山東華魯制藥有限公司，批號(hào)：G17i21307）;烏拉坦、氫氧化鈉、鹽酸等其他試劑為分析純?cè)噭?實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

RXZ智能型人工氣候箱（寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司）;梅特勒-托利多FE20實(shí)驗(yàn)室pH值計(jì)（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）;中科美菱超低溫冷凍儲(chǔ)存箱（型號(hào)：DW-HL 388）;水蛭，市售，清水吊干品，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院鑒定系楊瑤珺教授鑒定為螞蟥W.pigra;黃酒，市售，老恒和浙江黃酒（五年陳釀·清爽型黃酒，湖州老恒河釀造有限公司）;滑石粉，市售。LGJ-12冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（北京世紀(jì)予華儀器有限公司）;G16型醫(yī)用高速離心機(jī)（安新縣白洋離心機(jī)廠）。

1.2?方法

1.2.1?水蛭炮制

1）凈制：取水蛭清水吊干品適量，去離子水洗凈，剪切成小段，冷凍干燥24 h后，打粉，過(guò)3號(hào)篩，得凈制品粗粉，置于-20 ℃冰箱密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2）燙制：將滑石粉置于鍋內(nèi)，武火炒至靈活狀態(tài)時(shí)加入凈選后的水蛭清水吊干品適量，不斷翻動(dòng)，燙至微鼓起、表面呈黃棕色時(shí)取出，篩去滑石粉，放涼至室溫，去離子水快速?zèng)_洗去除殘存的滑石粉，冷凍干燥24 h后，打粉，過(guò)3號(hào)篩，得燙制品粗粉，置于-20 ℃冰箱密封保存?zhèn)溆谩?/p>

3）酒制：取水蛭清水吊干品適量，除去雜質(zhì)，稱(chēng)重，剪切成小段，用黃酒拌勻，水蛭-黃酒（10∶1），酒吸盡后加蓋悶透，置于烘箱中加熱（40 ℃）干燥至表面微變色、質(zhì)酥脆時(shí)取出，放涼至室溫，打粉，過(guò)3號(hào)篩，得酒制品粗粉，置于-20 ℃冰箱密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2?水蛭各炮制品活性成分的提取

1）水提取法：稱(chēng)取水蛭各炮制品粗粉各0.15 g，分別加入2.8 mL去離子水，室溫下磁力攪拌5 h，15 000 r/min離心20 min，取上清液，備用。

2）仿生提取法：取10 mL人工胃液（人工胃液：9 mL濃HCl，加水定容至1 000 mL），加入胃蛋白酶（酶底比1.25%），攪拌均勻后分別加入水蛭各炮制品粗粉1.50 g，37 ℃磁力攪拌3 h（蛋白質(zhì)在胃內(nèi)的消化吸收時(shí)間）;用pH值13.00的NaOH溶液將反應(yīng)液pH值調(diào)至6.80，加入胰蛋白酶（酶底比7.5%），37 ℃磁力攪拌2 h（蛋白質(zhì)在小腸內(nèi)的消化吸收時(shí)間）將反應(yīng)樣品取出，置于85 ℃水浴中滅活15 min，自然冷卻至室溫;以15 000 r/min離心20 min，取上清液，備用[8]。

1.2.3?纖維蛋白平板和纖維蛋白原平板實(shí)驗(yàn)

纖維蛋白平板的制備：用pH值7.4的PBS配置1%的瓊脂溶液，加熱至90 ℃使其完全融化，待冷卻至75 ℃左右，取20 mL瓊脂溶液與用pH值7.4的PBS配置的8 mL 0.5%的纖維蛋白原溶液和1 mL 10 U/mL的凝血酶溶液混合，攪拌均勻后，立即倒入經(jīng)高壓蒸汽滅菌后的直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻，冷卻靜置約50 min瓊脂完全凝固后，打出直徑為8 mm的孔，打孔后用移液槍小心將孔中液體吸出，備用。

纖維蛋白原平板的制備：用pH值7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）配置3%的瓊脂溶液，加熱至90 ℃使其完全融化，待冷卻至75℃左右，取20mL瓊脂溶液與10 mL用pH值7.4的PBS配置的0.1%的纖維蛋白原溶液混勻，立即倒入經(jīng)高壓蒸汽滅菌后的直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻，冷卻靜置約30 min瓊脂完全凝固后，打出直徑為8 mm的孔，打孔后用移液槍小心將孔中液體吸出，備用。

纖溶活性測(cè)定：分別精密吸取水蛭各樣品溶液、陽(yáng)性對(duì)照品（尿激酶）、空白試劑各120 μL（其中水提樣品以水為空白對(duì)照，仿生提取樣品以空白酶解液為空白對(duì)照，空白酶解液按仿生提取法所述，除不加水蛭樣品外，其余操作相同），同板加樣，置于恒溫（37 ℃）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h取出觀察。

1.2.4?大鼠體外溶栓實(shí)驗(yàn)

血栓的制備：從大鼠腹主動(dòng)脈取血于無(wú)菌離心管中，4 ℃放置自然凝血5 h，待凝固后取出，用手術(shù)刀將血凝塊均分[10-12]，每塊約0.2 g，分別用生理鹽水漂洗至無(wú)顏色以除去表面黏附的血細(xì)胞和雜質(zhì)，將血凝塊烘干稱(chēng)重（W1），并隨機(jī)放入無(wú)菌離心管中，分為4組，每組3支平行管。

溶栓活性測(cè)定：向每組離心管中分別加入水蛭各樣品溶液、空白試劑各3 mL（其中水提樣品以生理鹽水為空白對(duì)照，仿生提取樣品以空白酶解液為空白對(duì)照），置于37 ℃水浴箱內(nèi)恒溫孵育，36 h后取出血凝塊，用生理鹽水反復(fù)漂洗至無(wú)顏色后，將血凝塊烘干稱(chēng)重（W2）[12-13]，計(jì)算36 h后3組血凝塊溶解率平均值。血凝塊溶解率（%）=[（W1-W2）/W1]×100%。

1.3?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理所有數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?纖維蛋白平板實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將水蛭及炮制品的水提物和仿生提取物分別加入纖維蛋白平板中，恒溫（37 ℃）培養(yǎng)20 h后出現(xiàn)的結(jié)果如圖1所示。纖維蛋白平板的溶圈面積反映了人體內(nèi)血栓形成后各樣品通過(guò)與纖維蛋白反應(yīng)直接溶解血栓的效果。陽(yáng)性對(duì)照品（尿激酶）出現(xiàn)明顯透明圈，證明纖維蛋白平板制作成功。無(wú)論水提取法還是仿生提取法，與空白組比較，水蛭各炮制品均能與纖維蛋白平板作用產(chǎn)生透明圈，表明水蛭各炮制品能通過(guò)直接降解纖維蛋白以達(dá)到纖溶作用，但是炮制前后纖溶活性對(duì)比時(shí)，不同提取方法下，不同炮制品產(chǎn)生的透明圈大小差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

水提取法顯示水蛭各炮制品在纖維蛋白平板上產(chǎn)生透明圈的大小順序?yàn)椋簝糁破?酒制品>燙制品，表示炮制降低了凈制品的溶栓活性;仿生提取法顯示，水蛭各炮制品在纖維蛋白平板上產(chǎn)生透明圈的大小順序?yàn)椋籂C制品>酒制品>凈制品，表示燙制和酒制均能使凈制品的溶栓活性增強(qiáng)。

2.2?纖維蛋白原平板實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將水蛭各炮制品的水提物和仿生提取物分別加入纖維蛋白原平板中，恒溫（37 ℃）培養(yǎng)20 h后發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照品（尿激酶）出現(xiàn)明顯透明圈，證實(shí)纖維蛋白原平板具有活性。但是無(wú)論水提取法還是仿生提取法均顯示水蛭各炮制品均不能在纖維蛋白原平板上產(chǎn)生透明圈，即水蛭各炮制品在發(fā)揮抗血栓作用時(shí)，不是通過(guò)直接降解纖維蛋白原抑制血栓形成，而是對(duì)已形成的血栓進(jìn)行溶解。

2.3?大鼠體外溶栓實(shí)驗(yàn)結(jié)果

無(wú)論采用水提取法還是仿生提取法，與空白對(duì)照組比較，水蛭各炮制品均有顯著的體外溶栓效果，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。觀察顯示，樣品組溶栓后，血凝塊質(zhì)地松散，體積減小，溶液明顯紅染。而空白組溶栓前后血凝塊形狀、質(zhì)地及溶液顏色均無(wú)明顯變化。

溶栓率結(jié)果表明，水提取法和仿生提取法均顯示水蛭各炮制品對(duì)血栓有很好的溶解效果，但是炮制前后溶栓活性比較，不同提取法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

水提取法顯示水蛭各炮制品溶栓率順序?yàn)椋簝糁破?酒制品>燙制品，表示炮制降低了水蛭的活性;仿生提取法顯示水蛭各炮制品溶栓率順序?yàn)椋籂C制品>酒制品>凈制品，表示燙制和酒制均能使水蛭的溶栓活性增強(qiáng)。

3?討論

由于水蛭在體內(nèi)發(fā)揮抗血栓活性作用的成分為蛋白類(lèi)物質(zhì)，所以經(jīng)水提取法和仿生提取法得到的物質(zhì)存在很大差異，對(duì)抗血栓活性的強(qiáng)弱有著決定性的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)出現(xiàn)的透明圈和測(cè)得的溶栓率證明水蛭能直接降解纖維蛋白并溶解血栓。在采用2種提取方法研究炮制對(duì)水蛭纖溶活性的影響時(shí)，在纖維蛋白平板和體外血栓模型上所得到的結(jié)果卻幾乎相反。在水提取法中，根據(jù)觀察測(cè)量透明圈的大小及測(cè)得的溶栓率顯示，炮制使水蛭抗血栓活性明顯降低，這與采用水提取法的研究者所得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)論基本相同[10];而采用仿生提取法時(shí)，通過(guò)產(chǎn)生透明圈的大小及測(cè)得的溶栓率顯示2種炮制方法均能使水蛭的抗血栓活性增強(qiáng)。在纖維蛋白原平板上所得到的結(jié)果與纖維蛋白平板不同，根據(jù)觀察，2種提取方法得到的成分均不能產(chǎn)生透明圈，反映了水蛭不能直接降解纖維蛋白原。

由于水蛭的給藥形式通常為口服，所以仿生提取法得到的抗血栓活性成分與在人體內(nèi)真正發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)更加相似，所得結(jié)果比水提取法更具有說(shuō)服力，對(duì)于在2種不同平板上所得到的不同結(jié)果及2種提取方法在纖維蛋白平板上及體外血栓模型中所得到的抗血栓活性結(jié)果相悖的情況，可能的原因分析如下。

3.1?水蛭在纖溶過(guò)程中可能發(fā)揮類(lèi)纖溶酶的作用

機(jī)體內(nèi)存在凝血系統(tǒng)、纖溶系統(tǒng)。凝血-纖溶平衡系統(tǒng)血液凝固過(guò)程中最后可溶的纖維蛋白原在凝血酶的作用下變成不溶的纖維蛋白而凝固。在哺乳動(dòng)物血液系統(tǒng)中包含2個(gè)基本的纖溶過(guò)程：一個(gè)是纖溶酶溶解纖維蛋白或者纖維蛋白原，從而溶解血栓;另一個(gè)是在纖溶酶原激活劑的作用下，纖溶酶原轉(zhuǎn)變成纖溶酶，進(jìn)而發(fā)揮溶栓作用。通過(guò)建立體外血栓模型反映溶栓藥物向血栓滲透并發(fā)揮作用的溶栓效果[14]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，水蛭各炮制品可能起著類(lèi)似纖溶酶的作用[15]，其中含有1種或多種可以溶解纖維蛋白但不能直接溶解纖維蛋白原的成分，這可能是因?yàn)槔w溶過(guò)程中構(gòu)成纖維蛋白原的肽鏈不具有水蛭各炮制品的纖溶作用點(diǎn)，而有效的作用部位在形成纖維蛋白時(shí)暴露出來(lái)。

3.2?燙制對(duì)水蛭抗血栓活性的影響

水提取法提取出的活性物質(zhì)主要為大分子蛋白類(lèi)物質(zhì)，而仿生提取法產(chǎn)物多為相對(duì)分子質(zhì)量較小的肽類(lèi)物質(zhì)。水蛭經(jīng)過(guò)滑石粉高溫燙制后，蛋白質(zhì)變性甚至失活，水溶性降低。因此，采用水提取法提取出的物質(zhì)中水溶性蛋白變少，抗血栓活性較未經(jīng)炮制的水蛭有所降低。而燙制后，水蛭中蛋白類(lèi)成分的空間結(jié)構(gòu)被破壞，活性中心暴露，結(jié)構(gòu)變得疏松易被酶解而釋放出更多的活性肽，因此采用仿生酶解提取法后抗血栓活性的增強(qiáng)可能是活性肽的含量升高所導(dǎo)致。

3.3?酒制對(duì)水蛭抗血栓活性的影響

蛋白具有熱變性的屬性，在高溫下易變性而致某些理化性質(zhì)、生物活性改變。酒制烘干時(shí)的溫度和黃酒中的乙醇共同導(dǎo)致了部分蛋白質(zhì)變性，但綜合兩者所達(dá)到的變性程度仍不及燙制所達(dá)到的高溫。因此，水提取法所得到的抗血栓活性較未炮制的水蛭有所減弱，但其活性明顯高于燙制品。而采用仿生提取法的酒制品抗血栓效果大幅提升，一方面與蛋白質(zhì)變性，提取得到的活性肽增多有關(guān)，另一方面，傳統(tǒng)炮制理論認(rèn)為酒制可引藥上行、增強(qiáng)藥物活血功效，如經(jīng)酒制后的大黃、丹參等藥物活血作用增強(qiáng)[16]。水蛭經(jīng)酒制后可矯味矯臭、引藥上行[17]，還能加強(qiáng)破血逐瘀之功效，推測(cè)對(duì)頭面部的血栓可能會(huì)有更好的溶栓效果。

3.4?基于溶栓特異性的抗血栓作用

水蛭在臨床應(yīng)用中可能會(huì)較少的引發(fā)出血現(xiàn)象，所以有必要深入探究其對(duì)纖維蛋白專(zhuān)一性，同時(shí)也有望揭示其發(fā)揮溶栓作用的真正藥效成分。此外，現(xiàn)存的水蛭以及動(dòng)物類(lèi)藥材的加工炮制工藝仍缺少確定的參數(shù)，還需以抗凝溶栓效果及蛋白多肽的變化為主要指標(biāo)，建立更完善的水蛭高溫炮制過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)量控制體系。

綜上所述，采用水提取法和仿生提取法研究炮制對(duì)水蛭體外抗血栓活性的影響結(jié)果幾乎完全相反。水提取法顯示，水蛭經(jīng)炮制后在纖維蛋白平板上產(chǎn)生的透明圈及體外血栓溶解率均變小，而采用仿生提取法時(shí)，產(chǎn)生的透明圈及血栓溶解率均變大。仿生提取法模擬了胃腸道的吸收過(guò)程，其結(jié)果比傳統(tǒng)的水提法更具有可信度。此外，炮制可使水蛭質(zhì)地更加酥脆易于打粉，同時(shí)還能夠矯味矯臭、增效減毒。因此，采用燙制法或者酒制法對(duì)水蛭進(jìn)行炮制在臨床應(yīng)用上具有一定的科學(xué)性。

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（2019-01-20收稿?責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄）