艾灸對胃荷瘤大鼠生存狀態(tài)及骨骼肌代謝的影響

彭卓雋 林亞平 譚靜 趙歡 陳欲攀 石峻林

〔摘要〕 目的 通過觀察艾灸對荷瘤大鼠生存狀態(tài)及對骨骼肌代謝的影響，探討艾灸對荷瘤大鼠胃腫瘤的影響。方法 將40只SD大鼠隨機選取其中20只分為正常組、假手術組各10只，其余20只采用Walker-256型瘤組織胃部黏貼制備胃癌模型，將模型制備成功的16只大鼠再隨機分為模型組和艾灸組各8只。各組均每日捆綁20 min，艾灸組每日穴位施灸20 min，共干預14 d。每日觀察大鼠生存狀態(tài)，記錄生存狀態(tài)積分和體質量;稱取取材前體質量以及腓腸肌質量;使用游標卡尺測量腫瘤的最大徑和最小徑，電子天平稱量腫瘤體質量，計算腫瘤體積抑制率;TUNEL法觀察腓腸肌細胞凋亡情況;HE染色后觀察腓腸肌細胞并測量橫徑。結果 與模型組相比起：艾灸組生存狀態(tài)改善，生存癥狀積分降低（P<0.05）;艾灸8 d后體質量均明顯高于模型組體質量（P<0.05）;胃部瘤體質量和瘤體體積均明顯減?。≒<0.01）;腓腸肌細胞凋亡指數(shù)均降低（P<0.05），腓腸肌質量明顯提高（P<0.01），腓腸肌橫徑長度增加（P<0.05）。結論 艾灸能在一定程度上抑制胃癌大鼠腫瘤的生長，改善生存狀態(tài)，減少骨骼肌細胞過度消耗。

〔關鍵詞〕 胃荷瘤;艾灸;生存狀態(tài);腓腸肌質量;骨骼肌代謝;大鼠

〔中圖分類號〕R245.81 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.12.015

〔Abstract〕 Objective By observing the effects of moxibustion on the survival status of tumor-bearing rats and the metabolism of skeletal muscle， and to explore the effects of moxibustion on gastric tumors in tumor-bearing rats. Methods A total of 20 rats were randomly selected from 40 SD rats and divided into a normal group and an sham operation group， with 10 rats in each group. The remaining 20 rats were prepared gastric cancer models by Walker-256 tumor tissue gastric sticking. The 16 rats successfully modeling were randomly divided into a model group and a moxibustion group， with 8 rats in each group. Each group was bundled for 20 min every day， and the moxibustion group applied moxibustion for 20 minutes per day for a total of 14 days. The survival status of the rats was observed daily， and the survival status scores and body weights were recorded. The body weight and the weight of the gastrocnemius before taking materials were weighed; The maximum and minimum diameter of the tumor was measured using a vernier caliper. The tumor mass was weighed by electronic balance， and the tumor volume inhibition rate was calculated; The apoptosis of myocytes was observed by TUNEL method; The gastrocnemius muscle cells were observed after HE staining and Horizontal diameter was measured. Results Compared with the model group， the survival status of the moxibustion group improved and the score decreased （P<0.05）. The body mass after 8 days of moxibustion was significantly higher than that of the model group （P<0.05）; tumor weight and tumor volume were significantly decreased （P<0.01）; gastrocnemius muscle fiber apoptosis index decreased （P<0.05）， gastrocnemius weight increased significantly （P<0.01）， gastrocnemius transverse diameter length increased （P<0.05）. Conclusion Moxibustion can inhibit the growth of tumor in gastric cancer rats to a certain extent， improve the living condition and reduce the excessive consumption of skeletal muscle cells.

〔Keywords〕 gastric-bearing tumor rats; moxibustion; survival state; gastrocnemius muscle mass; skeletal muscle metabolism; rats

癌癥是威脅人類健康的重要疾病，在我國，受環(huán)境和不良飲食習慣的影響，胃癌的發(fā)病率、死亡率遠高于全球平均水平[1]。作為中醫(yī)學的重要組成部分之一，艾灸具有溫經(jīng)、通絡、散寒、固本回陽、行氣活血、防病保健等作用[2]。癌細胞有不耐高溫的特點，利用艾火的溫熱作用，促使瘤體內(nèi)溫度增加，可一定程度抑制癌細胞的生長。國內(nèi)外臨床及實驗研究均證實艾灸對腫瘤患者及荷瘤大鼠具有各方面的良性調節(jié)作用[3-5]，但目前缺乏艾灸對胃荷瘤大鼠骨骼肌組織作用的研究，本實驗期望從此展開研究，以提供艾灸治療胃癌的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?實驗動物及分組 ?模型制備前期選取3只體質量70～100 g的SD幼鼠，其中1只用來造腹水，2只用來制備皮下腫瘤。正式實驗選取40只體質量180～200 g SD大鼠，用隨機表法將其中20只動物分為空白組、假手術組，每組各10只，另外20只先進行造模。動物由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供并飼養(yǎng)于其動物實驗中心[許可證號：SYXK（湘）2013-0005]。實驗室空氣濕度：50%～70%，溫度：20～25 ℃。實驗全程遵照國家科委頒布的《實驗動物管理條例》。

1.1.2 ?瘤株 ?由中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院供應的Walker-256型癌細胞（20180601）。

1.1.3 ?主要試劑與儀器 ?醫(yī)用人體組織粘合劑（北京康派特，中國）;LD5-10B型低速離心機（北京京立，中國）;凋亡檢測試劑盒（瑞士羅氏生物科技公司）;7 mm×120 mm艾條（長沙艾醫(yī)生物科技）;PT300大鼠實驗溫度計（上海吉煜實業(yè)有限公司）等。

1.2 ?方法

1.2.1 ?模型制備 ?采用直接注射法制備模型[6]，將Walker-256癌細胞生理鹽水稀釋，以1 000 r/min的速度離心3～5 min，然后調整Walker-256細胞懸液濃度至2×107個/mL，用注射器將懸液注入于1只體質量70～100 g SD幼鼠的腹腔，約7 d后腹部膨隆并形成有癌細胞的紅色腹水。腹水形成后，注射器抽取腹水于另2只70～100 g幼鼠雙側前、后肢皮下分別注射0.2 mL癌性腹水。約7 d后可見大鼠皮下形成直徑約5 mm的球狀皮下實體瘤[7]。麻醉處死實體瘤大鼠，取瘤外圍位置魚肉樣胃腫瘤組織，組織剪剪取芝麻粒大小胃腫瘤組織，用少量人體組織粘合劑將瘤組織移植于20只造模大鼠胃竇部，用縫合線縫合腹腔，最后0.5 mL青霉素皮下注射?？瞻捉M不做任何處理，假手術組模擬開腹、胃壁刺激、縫合并皮下注射青霉素。

造模后第6天將20只造模大鼠進行麻醉剖腹探查，在與胃大彎垂直體表用手術刀縱向切開約 1 cm，可見胃大彎部附著一半徑約0.3 cm的米白色魚肉樣球狀腫瘤，表面光滑，邊界清晰，無粘連及臟器侵犯，即定義為造模成功[8]。隨后縫合關腹，消毒。造模成功率為80%，剔除失敗樣本，用隨機表法將16只造模成功大鼠隨機分為艾灸組和模型組，每組8只。

1.2.2 ?穴位定位 ?穴位定位參照《實驗針灸學》[9]。

1.2.3 ?干預方法 ?模后第8天開始干預，艾灸組每日艾灸1次，每次20 min，中脘、關元和足三里（雙）分為一組;雙側脾俞和胃俞分為另一組，兩組穴位交替進行施灸，共灸14 d。艾灸時，將大鼠用繩子捆綁四肢固定于鼠板上，點燃艾條并將其固定于灸架上，使艾條與大鼠體表垂直且保持在穴位上方3～4 cm，使用大鼠實驗溫度計測定表皮溫度，根據(jù)溫度值調整施灸高度，適時去除艾灰，確保表皮溫度持續(xù)在41～43 ℃之間，其他組每日僅用繩子捆綁20 min，不做其他處理。

1.3 ?檢測指標及方法

1.3.1 ?大鼠生存狀態(tài)評估 ?生存狀態(tài)：每周觀察大鼠精神狀態(tài)、行為活動、飲食情況、毛皮色澤、大便性狀、體質量及腹部皮下結節(jié)生長情況等。根據(jù)上述情況給每組大鼠分別評分，0分：精神狀態(tài)佳，目光有神，活動正常，反應靈活，毛色乳白有光澤，大便正常;1分：精神狀態(tài)良好，目光乏神，活動正常，反應遲緩，毛色乳白，光澤欠佳，大便質軟;2分：精神不振，目光無神，活動減少，反應遲鈍，毛色淡黃無光澤，大便質稀、次數(shù)增多;3分：精神萎靡，倦怠嗜睡，反應遲鈍，群體扎堆，毛色枯黃無光澤，有感染灶，大便稀溏、干稀不定。4個方面總積分為最終得分，最高12分[10]。

1.3.2 ?各組大鼠體質量 ?每日記錄1次每只大鼠的體質量。

1.3.3 ?瘤體質量及腫瘤體積生長抑制率 ?實驗結束，大鼠禁食不禁水24 h，眼球采血處死，無菌環(huán)境剖開腹腔取全胃，用生理鹽水輕柔充洗，用無菌紗布吸干多余水分，將全胃置于定型濾紙上，完全腫瘤暴露，剝離胃壁腫瘤，使用游標卡尺測量腫瘤的最大徑（a）和最小徑（b），計算腫瘤體積以及腫瘤體積抑制率，電子天平稱量瘤質量。

1.3.4 ?腓腸肌組織形態(tài)結構及質量 ?取材時用組織剪迅速剪取兩側完整腓腸肌并稱質量，PBS沖洗后將每側腓腸肌平均剪為兩部分，一部分存放于液氮罐，一部分用4%多聚甲醛固定48 h后石蠟包埋組織塊。石蠟5 μm切片，脫蠟、脫水、HE染色，脫水后封片，光學顯微鏡下調整好視野，觀察腓腸肌組織。

1.3.5 ?腓腸肌細胞凋亡指數(shù) ?取4%多聚甲醛固定完成的腓腸肌塊，用梯度乙醇脫水，石蠟包埋后切片、貼片、脫蠟加染色。400倍光鏡下觀察染色后的肌細胞，每張切片隨機取5個視野，計數(shù)總細胞及凋亡細胞。

1.4 ?統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0 軟件進行分析處理，計量資料以“x±s”表示。所有數(shù)據(jù)資料進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布者，采用多組計量資料比較，組間比較采用單因素方差分析（One way ANOVA）;方差齊用LSD法，不齊用Games-Howell法檢驗，組內(nèi)比較使用重復測量方差分析，以P<0.05定義為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ?大鼠生存癥狀評分

各組大鼠造模前行為正常，組間差異無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）。造模后，與空白組相比，假手術組、模型組和艾灸組大鼠的生存狀態(tài)積分均較高（P<0.05）。造模后，與假手術組相比，模型組與艾灸組生存狀態(tài)積分均較高（P<0.05）。干預后，與模型組相比，艾灸組生存狀態(tài)積分較低（P<0.05）。見表1。

2.2 ?大鼠各時間段體質量變化情況

造模前各組大鼠體質量差異無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）。造模后，與空白組相比，艾灸組與模型組大鼠體質量均較低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。艾灸組自干預后第5天，體質量開始回升，至干預后第8天時，艾灸組大鼠的體質量高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），直至艾灸結束期間，艾灸組大鼠體質量較模型組高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。如圖1所示。

2.3 ?瘤體質量及腫瘤體積生長抑制率

與模型組比較，艾灸組瘤體質量和瘤體體積均明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;艾灸組的腫瘤生長抑制率計算為54.78%，說明艾灸組可以抑制腫瘤生長。見表2。

2.4 ?腓腸肌質量、肌纖維橫徑及肌細胞凋亡指數(shù)

2.4.1 ?腓腸肌質量 ?與空白組相比，造模后模型組、艾灸組腓腸肌重量明顯降低（P<0.05或P<0.01）;與模型組相比，艾灸組大鼠治療后腓腸肌質量明顯提高（P<0.01）。見表3。

2.4.2 ?腓腸肌形態(tài)學觀察 ?如圖2所示，腓腸肌肌纖維切片經(jīng)染色后可見：空白組大鼠腓腸肌束排列緊密有序，肌細胞致密，可清楚觀察到肌橫紋，肌纖維細胞呈棱形或多邊形，細胞核染色，緊靠肌膜處顯藍紫色。模型組大鼠腓腸肌細胞排列疏松而分散，形狀不規(guī)則，邊緣變鈍，各肌束間疏松，細胞間隙變寬。艾灸組小鼠肌肌束排列緊密，形態(tài)飽滿，肌細胞排列比較緊密。

與空白組相比，模型組造模后腓腸肌肌細胞橫徑下降（P<0.05）;艾灸干預后，艾灸組腓腸肌橫徑明顯長于模型組（P<0.05）。見表3。

2.4.3 ?腓腸肌肌細胞凋亡情況 ?如圖3所示，TUNEL染色中凋亡細胞核為棕黃色，模型組大鼠腓腸組織內(nèi)呈強陽性表達，艾灸組內(nèi)呈弱陽性表達。空白組與假手術組細胞凋亡數(shù)量及比例較少，艾灸干預后大鼠骨骼肌細胞呈棕黃色的凋亡細胞明顯降低，模型組組比例較高。

與空白組比較，模型組肌細胞凋亡比率升高，差異具有統(tǒng)計意義（P<0.05），與模型組比較，艾灸組凋亡比率降低（P<0.05）。見表3。

3 討論

中醫(yī)學中，腫瘤的主要病機是正虛邪實，有形之邪導致機體氣血衰弱，脈道不暢，從而形成癌癥。艾灸可以改善腫瘤患者多種臨床癥狀、提高免疫力。艾灸可以上調腫瘤小鼠T淋巴細胞增殖活性及平衡Th1/Th2[13]，控制Lewis肺癌小鼠皮下腫瘤生長，并延長生存時間[14]。臨床研究表明，麥粒灸非小細胞肺癌患者雙側足三里穴、雙側肺俞穴，能使其中性粒-淋巴細胞比率明顯降低，血小板數(shù)量明顯升高[15]。隔姜灸胃癌患者雙側足三里，能使外周血白細胞計數(shù)、CD3+、CD4+、CD8+比值升高[16]。艾灸可以加強機體的抗腫瘤免疫功能，通過艾火的溫熱刺激與經(jīng)絡腧穴循經(jīng)傳導相互激發(fā)，改善循環(huán)，增強代謝，同時調整機體內(nèi)環(huán)境，以達最佳治療效果。

脾為氣血生化之源，脾胃運化失常，導致氣血運行不足以支撐肌肉組織機能活動，則骨骼肌組織易產(chǎn)生萎縮。足三里為足陽明胃經(jīng)五輸穴中合穴，五行屬土，根據(jù)“合治內(nèi)府”理論，足三里可直接調理脾胃、補中益氣;關元有培元固本、補益精血、調理沖任之功效，為古今強壯保健之要穴?！夺樉募滓医?jīng)》指出：“胃脹者，中脘主之?！敝须渲飨到y(tǒng)病癥，具有和胃健脾之功用。脾俞、胃俞分別為足太陽膀胱經(jīng)上脾、胃之背俞穴，主治脾胃腸腑病癥，是脾胃之氣輸注于背腰部的腧穴。電針能夠改善骨骼肌萎縮后產(chǎn)生的各種癥狀，包括能夠增加損傷的肌肉濕重，肌纖維直徑和橫截面積[17]、促進坐骨神經(jīng)損傷后神經(jīng)組織形態(tài)及失神經(jīng)支配腓腸肌功能的恢復[18]、促進肌衛(wèi)星細胞增殖[19]等幾個方面。艾灸足三里預處理可減輕大鼠一次性離心運動后骨骼肌結構的損傷程度，減輕運動時應激反應和自由基的產(chǎn)生，縮短骨骼肌損傷的修復時程[20]。

胃癌患者體質量下降主要與骨骼肌消耗密切相關。骨骼肌是機體蛋白重要的儲存場所，骨骼肌消耗增加不僅降低了患者對化療和放療的承受能力及治療效應，也直接影響患者生存質量和預后。研究顯示腫瘤患者體質量下降30%，肌肉蛋白貯備將下降75%，是預示生存率降低的獨立危險因素。與饑餓、禁食引起的體質量下降不同，腫瘤患者的骨骼肌消耗不能通過補充營養(yǎng)物質改善與逆轉。本研究中，模型組腓腸肌質量、肌纖維橫徑較空白組明顯減少（均P<0.01），肌細胞凋亡增加（P<0.01），說明胃癌大鼠骨骼肌消耗增加。艾灸14 d后，與模型組比較，艾灸組大鼠腓腸肌質量明顯增加，肌細胞凋亡減少、肌纖維橫徑增大（P<0.05，P<0.01），說明艾灸能一定程度減少胃癌大鼠的骨骼肌消耗。

艾灸能在一定程度上提高胃癌大鼠的體質量，改善生存質量，減小瘤體質量和體積，減少骨骼肌細胞過度消耗，對胃癌大鼠的腫瘤生長有一定的抑制作用。但艾灸對胃荷瘤大鼠骨骼肌質量和功能產(chǎn)生效應的相關研究尚顯不足，本研究發(fā)現(xiàn)可能跟艾灸雙向調理機體脾胃功能，增進大鼠食欲，以及艾灸的活血化瘀作用利于骨骼肌萎縮恢復有關。

參考文獻

[1] 左婷婷，鄭榮壽，曾紅梅，等.中國胃癌流行病學現(xiàn)狀[J].中國腫瘤臨床，2017，44（1）：52-58.

[2] 黃逸珠，肖明明，趙彩嬌.艾灸灸量影響因素臨床研究進展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2019，15（2）：210-212.

[3] 嚴越臺，沈 ?丹，阮嬰丹，等.艾灸關元、氣海穴對晚期肝癌患者生存質量影響的臨床觀察[J].中華全科醫(yī)學，2017，15（7）：1227-1229.

[4] 高西緒，孫永寧，閆春妮.艾灸關元、氣海穴對惡性腫瘤晚期患者生存質量及T淋巴細胞亞群的影響[J].中國中醫(yī)急癥，2017，26（3）：542-544.

[5] 張 ?梅，劉珍珍，楊佳敏，等.艾灸的研究進展[J].中醫(yī)藥學報，2015，43（1）：73-77.

[6] 隋英忠，夏玉軍，王曉靜，等.構建SD大鼠移植性胃癌模型及不同方法誘癌率的比較[J].中國臨床研究，2014，27（2）：135-137.

[7] YAN LIBO， LI YU， ZHANG CHUNPING， et al. Serial observations on an orthotopic gastric cancer model constructed using improved implantation technique[J]. World Journal of Gastroenterology，2011，17（11）： 1442-1447.

[8] 孔凡鎮(zhèn)，李京敏，馮國營，等.SD大鼠兩種移植性胃癌模型的誘癌成功率比較[J].濱州醫(yī)學院學報，2013，36（6）：405-408.

[9] 李忠仁.實驗針灸學[M]. 北京：中國中醫(yī)藥出版社，2007：1

[10] 萬全荃，賀鳳娥，林亞平.糖尿病胃輕癱大鼠模型衍變過程相關指標的觀察[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2017，37（10）：6-10.

[11] 張 ?勇.甲磺酸阿帕替尼治療惡性黑色素瘤的實驗研究及臨床觀察[D].鄭州：鄭州大學，2018：1-108.

[12] 陳 ?玄，葉笑然，黃曉卿.電針對大鼠失神經(jīng)支配骨骼肌萎縮及IGF-1/PI3K/AKT表達的影響[J].中國針灸，2018，38（12）：1311-1317.

[13] 閆亞南，王 ?寧，王卓昱，等.直接灸“肝俞”對原發(fā)性肝癌癌前病變大鼠T淋巴細胞亞群的影響[J].針刺研究，2016，41（4）：321-326.

[14] 梁曉華，高廣輝，周鑫莉，等.消癌平注射液抗C57小鼠Lewis肺癌腫瘤血管生成的研究[J].臨床腫瘤學雜志，2010，15（8）：689-692.

[15] 張夢雪，關 ?玲.麥粒灸足三里、肺俞穴對化療后非小細胞肺癌患者的中性粒-淋巴細胞比率及血小板數(shù)量的影響：隨機對照研究[J].中國臨床醫(yī)生雜志，2016，44（1）：42-45.

[16] 楊學紅，劉葉榮，何 ?清，等.艾灸對胃癌患者化療后免疫功能及臨床癥狀的影響[J].西部中醫(yī)藥，2017，30（7）：111-113.

[17] 范 ?蕊，吳宗輝，陳曉琳，等.電針對創(chuàng)傷性脊髓損傷大鼠下肢骨骼肌萎縮相關蛋白表達的影響[J].中國康復理論與實踐，2019，25（10）：1133-1139.

[18] 李慶雯，石田寅夫，郭 ?義，等.不同頻率電針對大鼠坐骨神經(jīng)損傷后神經(jīng)組織形態(tài)學與骨骼肌肌電圖的影響[J].中國針灸，2005，25（3）：73-76.

[19] 朱正威，唐成林，李小宏，等.電針通過調控微小RNA對失神經(jīng)肌萎縮大鼠肌衛(wèi)星細胞增殖的影響[J].針刺研究，2019，44（9）：643-648.

[20] 熊靜宇，肖國強，盧艷梅.艾灸預處理對大鼠離心運動后骨骼肌組織保護作用的研究[J].山東體育學院學報，2010，26（10）：56-61.