Daxx基因在小鼠睪丸精子發(fā)生過程中的表達分析

周生輝

[摘要]目的：分析Daxx基因在小鼠睪丸精子發(fā)生過程中的表達。方法：對不同周齡的野生小鼠的睪丸組織、成年睪丸支持細胞的雄激素受體特異性敲除（SCARKO）以及其雄性激素受體的敲除（ARKO）小鼠睪丸的水平進行檢測分析。結(jié)果：SCARKO小鼠和野生型的小鼠相比較其睪丸中Daxx基因的表達沒有明顯不同，然而在生精細胞的細胞核當中呈現(xiàn)極性分布的情況，在ARKO小鼠的睪丸Daxx基因的表達與其他方法相比明顯降低。結(jié)論：ARKO的小鼠與野生型小鼠相比其Daxx基因的表達明顯降低，Daxx基因的定位情況受到睪丸支持細胞中AR基因的特異性敲除的作用。小鼠睪丸精子的發(fā)生過程可能有Daxx基因的參與。

[關(guān)鍵詞]Daxx基因;實驗小鼠;睪丸;精子

[中圖分類號]R321 [文獻標識碼]A [文章編號]2096-5249（2019）21-0011-02

在精子的發(fā)生過程中雄激素以及受體（AR）有及其重要的影響Ⅲ。精子不能正常發(fā)揮作用以及男性造成的不育狀況與雄激素的低水平或AR基因突變情況有直接關(guān)系，睪丸的組織不相同細胞類型的條件性AR基因敲除以至于小鼠呈現(xiàn)各種情況的生精障礙。睪丸支持細胞中的AR調(diào)節(jié)精子的發(fā)生受到雄激素作用的影響。相關(guān)研究人員通過使用二代測序的方法，對SCARKO小鼠和野生型的小鼠睪丸的表達進行詳細的對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在一系列的基因差異表達情況。對于AR敲除后的死亡結(jié)構(gòu)域的相關(guān)蛋白其表達顯著降低。Daxx基因最終能夠進入細胞核，而后進入細胞質(zhì)最終使細胞凋亡。Daxx蛋白表現(xiàn)出來的高表達情況說明其影響睪丸的生精作用，值得對睪丸生理方面的深入探究。

1資料和方法

1.1材料的準備準備1、2、3、4、6、8周的野生型小鼠各4只，經(jīng)處死后將其睪丸的總RNA提取出來。8周的小鼠、ARKO和SCARKO小鼠各準備4只，取其膀胱、脾、心、腎、肝、肺、腦、睪丸、附睪的總RNA和總蛋白，將睪丸組織進行固定。

1.2提取反轉(zhuǎn)錄PCtL采用0.8%的瓊脂糖電泳檢驗RNA完整程度。將RNA進行定量操作后取1ug并參照說明進行反轉(zhuǎn)錄操作。將Cdna提取后進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系包括10uL的PCR、8uL的雙蒸水、1uL的Cdna以及各0.5uL的引物，總為20uL。PCR擴增在98℃兩min的預(yù)變性，98℃的10s鐘的變性，60℃的30s退火，72℃的20s的延伸總計為35個循環(huán)過程，在72℃下延伸5min，在4℃下進行冷卻，對擴增產(chǎn)物的檢驗采用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗。

1.3通過熒光定量儀對qPCR進行檢驗反應(yīng)體系中有10uL的TaqⅡPCR，1uL的cDNA，8uL的DEPC H20，0.5uL的上下游引物。在95℃下30s，95℃下5s，60℃下30s，72℃下15s，一共為40個循環(huán)過程。內(nèi)參為GAPDH。

1.4Western印跡蛋白質(zhì)的濃度大小通過BCA方法進行測定，將濃度定為1微克/uL，將5倍的上樣緩沖液加入其中，在98℃下進行5min。然后通過常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜和5%的脫脂牛奶進行封閉處理，將一抗加入經(jīng)過一夜。采用TBST清洗重復(fù)3次，每次清洗5min，將二抗加入進行1小時的室溫培育，清洗方法同上，ECL發(fā)光液體在培育后曝光。室溫保存直至晾干然后掃描獲取結(jié)果。

1.5免疫組化以及細胞免疫熒光染色將石蠟包裹的睪丸組織切成厚度為3微米的片狀，并干燥后備用。一次經(jīng)過二甲苯、乙醇水、枸櫞酸處理，冷卻達到室溫，采用4%多聚甲醛固定細胞，0.1%的Trion x-100進行十min的打孔操作。精原細胞爬片之后，清洗并固定，將切片或爬片在室溫下封閉保存1小時，一抗在4℃下經(jīng)過一晚，1gG熒光二抗在室溫下培育兩小時，染核后用熒光防猝滅劑封閉樣品片，觀察熒光狀態(tài)。采用1gG代替一抗進行陰性比較。

1.6培養(yǎng)細胞在5%的二氧化碳，溫度為37℃的條件下培養(yǎng)。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS20.0對實驗的所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料（x±s）表示，通過t檢驗進行組間比較，使用計數(shù)數(shù)據(jù)病例數(shù)（n，%），并進行x檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同周齡的野生型小鼠其Daxx基因在睪丸中的表達2周的小鼠Daxx基因表達處于較低水平，3周的小鼠表達升高，mRNA在其性成熟時表達水平為最高。2周的小鼠其蛋白水平表達較低，與mRNA相類似。4周達到最高，6、8周開始降低，但相差不顯著。

2.2AR.KO、SCARKO小鼠與野生小鼠睪丸中Daxx基因的表達情況對比SCARKO小鼠的睪丸中mRNA與蛋白的表達水平與野生小鼠相比沒有明顯的不同，ARKO的小鼠mRNA與蛋白的水平明顯下降。

2.3Daxx在1周和2周的熒光強度比較弱，到3周增強，4周表現(xiàn)最強，6、8周的熒光強度與4周相比沒有明顯不同。4周的生精細胞經(jīng)研究表現(xiàn)出核極性的表達。

2.4野生型成年小鼠的Daxx的熒光強度集中于細胞核，SCARKO小鼠的熒光強度比較強，表現(xiàn)出細胞核極性表達情況，ARKO小鼠的熒光強度比較弱，定位無法確定。

2.5Daxx表現(xiàn)于精原細胞的細胞核部位。

3討論

SCARKO和ARKO的生精過程分別在精母細胞減數(shù)分裂的細線期和粗線期停止，特異性AR敲除小鼠與野生型小鼠沒有顯著的不同。支持細胞中AR基因的特異性敲除和全身性的AR基因敲除有相似的阻礙精子發(fā)生的情況，精子發(fā)生也與支持細胞有重要關(guān)系。AR的主要表達部位為睪丸的支持細胞、間質(zhì)細胞、血管壁以及肌樣細胞。有專家發(fā)現(xiàn)SCARKO與野生型小鼠的睪丸在Daxx表達上有顯著差異。這一系列研究為精子被阻礙造成男性不育提供臨床診療根據(jù)。

在本次研究過程中，2、3周的小鼠Daxx基因的表達從較低變?yōu)樯撸?周的小鼠為最高，6，8周的小鼠又開始下降，但與4周的相比沒有明顯的不同。SCARKO小鼠的睪丸中mRNA與蛋白的表達水平與野生小鼠相比沒有明顯的不同，ARKO的小鼠mRNA與蛋白的水平明顯下降。Daxx在1周和2周的熒光強度比較弱，到3周增強，4周表現(xiàn)最強，6、8周的熒光強度與4周相比沒有明顯不同。野生型成年小鼠的Daxx的熒光強度集中于細胞核，SCARKO小鼠的熒光強度比較強，表現(xiàn)出細胞核極性表達情況，ARKO小鼠的熒光強度比較弱，定位無法確定。Daxx表現(xiàn)于精原細胞的細胞核部位。

綜上所述，本次研究探究了Daxx基因在小鼠睪丸精子發(fā)生過程中的表達特點，發(fā)現(xiàn)小鼠睪丸精子的發(fā)生過程存在Daxx蛋白的調(diào)節(jié)和控制的參與，并深入觀察了Daxx的作用，為臨床上治療男性不育癥狀提供診療依據(jù)。